茶叶是我国重要的经济作物之一且产量丰富，但目前大部分中低档茶叶特别是夏秋茶，因品质因素价格普遍较低，常出现滞销现象[1-4]。为了提高中低档茶叶的经济附加值，需运用科技手段对茶叶进行深加工[5-6]。研究表明，一些企业通过萃取、微生物发酵等技术手段对中低档茶叶中的黄酮类物质加以利用，以获得较高的经济价值[7-8]；也有部分企业利用中低挡茶叶生产茶酒，并取得了一定的成效[9-10]。发酵型茶酒是一种以茶叶、蔗糖为主要原料，通过微生物发酵，兼具茶香与酒香的新型饮料酒[11]。目前，市场上的茶酒大多存在成分和口感较为单调且风味不够优雅等问题，因此在其发酵过程中选择较好的酒基进行生产尤为重要[12]。
黄酒是一种酒精度低、营养成分丰富的发酵型饮料酒[13]，林娟等[14]利用绿茶和糯米研制出一种香醇浓郁、酸甜适中的发酵型茶酒。此外，我国糯米加工的副产物利用程度低及深加工结构层次不够高，制约着我国糯米产业的发展[15]。由此，试验选择糯米作为酒基并采用黄酒的生产工艺制作茶酒。通过比较绿茶、红茶、黄茶、黑茶、白茶、青茶等我国六大茶类与黄酒香气的相似程度，发现红茶的香气与黄酒相似度最高，而且夏秋茶也较为适合作为红茶[16]。试验拟以糯米与红茶为原料，采用能起到节能减排作用的生料酿酒法发酵糯米茶酒[17]，以期获得感官特性优良的糯米茶酒，为工业化生产提供理论基础，实现提高中低档茶叶与糯米附加值的目的。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红茶（茶叶原料为四川小叶种群体品种，采摘标准为一芽二叶）：宜宾川红茶业集团有限公司；糯米（水分含量为13.01%，淀粉含量为78.31%）：四川省宜宾市高县酿酒原料种植基地；黄酒生料酿酒曲：丽水力克生物科技有限公司；纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司；芦丁、杨梅素、木犀草素、槲皮素、山奈酚标准品（纯度均＞98%）：成都曼思特生物科技有限公司；叔戊酸：美国Sigma-Aldrich公司；CH2Cl2、NaCl、Na2SO4（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
BS210S型电子分析天平：北京赛多利斯天平有限公司；AZL-2500C型粉碎机：永康市红太阳机电有限公司；HN-25S型电热恒温培养箱：浙江力辰仪器科技有限公司；PHs-3c型精密pH计：上海理达仪器厂；1200型高速液相色谱系统、6890N-5973MSD气相色谱质谱联用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）仪：美国Agilent公司；QYN100-2型氮吹仪：成都乔跃仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 糯米茶酒生产工艺流程
操作要点：将红茶中的杂质及梗等异形物去除，粉碎后过60目筛；将挑选好的优质糯米用纯净水淘洗干净，用无菌纱布过滤后将红茶粉按试验添加量加入发酵罐中，并加入糯米质量2倍的纯净水进行调配，之后加入一定比例的黄酒生料酿酒曲；在试验设定的温度条件下静置发酵，发酵前5 d每天搅拌1次；发酵结束后滤布压榨、抽滤，85 ℃热水煎酒20 min后得成品。
1.3.2 糯米茶酒生产工艺单优化因素试验
参考黄建等[18]的单因素试验方法，在茶粉添加量、酒曲添加量、发酵温度及发酵时间分别为1.5%、3%、30 ℃、12 d的基础条件下，保持其他因素不变，只改变其中一个因素，考察茶粉添加量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、酒曲添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、发酵温度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）及发酵时间（8 d、10 d、12 d、14 d、16 d），以感官评分及酒精度为评价指标，每组试验重复3次进行单因素试验。
1.3.3 糯米茶酒生产工艺响应面优化试验
在单因素试验的基础上，以茶粉添加量（A）、酒曲添加量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）为评价因素，以感官评分为评价指标，进行响应面试验，因素与水平如表1所示。
表1 发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation conditions optimization
1.3.4 糯米茶酒感官评分方法
感官评分由13名（6男7女）专业人员组成的感官评定小组参照GB/T 13662—2018《黄酒》[19]对糯米茶酒从外观、香气、滋味、风格等4个方面进行感官评分，评分标准见表2。
表2 糯米茶酒的感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of glutinous rice tea wine
1.3.5 糯米茶酒理化指标测定
酒精体积分数测定：密度瓶法[19]；总糖（以葡萄糖计）测定：廉爱农法[19]；总酸、氨基酸态氮的测定：电位滴定法[19]；非糖固形物的测定：重量法[19]；pH：酸度计法[19]。
1.3.6 糯米茶酒中黄酮类物质测定
应用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测糯米茶酒中黄酮类成分，并根据峰面积使用外标法进行定量分析。流动相A为0.2%磷酸，流动相B为80%甲醇；洗脱梯度程序在孙丽芳等[20]的基础上改为：0～0.5 min，B液从10%增加至45%；0.5～10 min，B液从45%增加至50%；10～18 min，B液从50%增加至100%；18～21 min，B液100%保持不变；21～22 min，B液从100%降低至10%后停止。
1.3.7 糯米茶酒中香气成分测定
试验采用液液萃取（liquid liquid extraction，LLE）结合气相色谱-质谱联用技术对糯米茶酒的香气成分进行测定：将100 mL酒样加入分液漏斗中，随后加入NaCl至饱和，使用30 mL重蒸CH2Cl2进行振荡萃取10 min。重复上述过程2次，合并CH2Cl2的萃取物，并加入内标物质叔戊酸5μL（990μg/L）与10 g Na2SO4，然后利用氮吹仪将萃取液浓缩至1 mL。气相色谱-质谱条件参照郑佳等[21]对五粮液香气成分的分析方法。
1.3.8 数据分析处理方法
以上每个试验重复3次，结果取平均值。采用Origin Pro 12.1软件进行数据制图，应用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，利用Design Expert 10.1软件进行响应面设计及结果分析。
2 结果与分析
2.1 糯米茶酒单因素试验
2.1.1 茶粉添加量对糯米茶酒品质的影响
图1 茶粉添加量对糯米茶酒品质的影响
Fig.1 Effect of tea powder addition on the quality of glutinous rice tea wine
不同字母表示感官评分（或酒精度）之间差异显著（P＜0.05），下同。
由图1可知，糯米茶酒的感官评分随着茶粉添加量的增加呈现出先上升后下降的趋势，当茶粉的添加量为2.0%时，糯米茶酒的感官评分达到了最高的（73.89±1.06）分。适量的茶粉能提高糯米茶酒的感官评分，其原因在于红茶茶粉中含有的香叶醇、芳樟醇及其氧化物能赋予糯米茶酒愉悦的花香与果香[22]，使复合米酒的感官评分在香气方面获得较高的分数。但当复合米酒中茶粉添加量＞2.0%之后，因红茶茶粉中的苦涩味在糯米茶酒中突显出来，进而对糯米茶酒的感官特性造成不良影响，造成其感官评分显著下降（P＜0.05）。糯米茶酒的酒精度随着茶粉添加量的增加而下降，其原因是茶粉中含有的酚类物质对微生物的生长繁殖具有一定的抑制作用[23]。虽然当茶粉的添加量从0增加至2.0%时，糯米茶酒的酒精度显著下降（P＜0.05），但只下降了8.52%，感官评分增加了30.16%。故选择茶粉添加量为2.0%用于后续试验。
2.1.2 酒曲添加量对糯米茶酒品质的影响
由图2可知，随着黄酒生料酒曲添加量的增加，糯米茶酒的酒精度也随之增加，最高达到了（13.31±0.07）%vol。但糯米茶酒的感官评分随着黄酒生料酒曲添加量的增加呈现出先上升后下降的趋势，当酒曲添加量为2%时，糯米茶酒的感官评分为最高的（82.93±0.76）分。由图2亦可知，酒曲添加量从1%增加至2%时，由于微生物及相关酶类的增加，能较快将淀粉质原料转化成乙醇及其他香味物质，故在相同的发酵时间内，2%的酒曲添加量能使糯米茶酒获得较高的感官评分及酒精度[24]。当酒曲添加量从2%开始继续增加时，糯米茶酒的酒精度也随之增加，但感官评分反而呈现出下降的趋势。其主要原因是增加曲量能提高发酵饮品的酒精度，但也会造成酒醅升温过快，使糯米中的蛋白质脱氨脱羧产生过量的高级醇，尤其是异丁醇，使糯米茶酒呈现出苦味[25]。故选择酒曲添加量2%用于后续试验。
图2 酒曲添加量对糯米茶酒品质的影响
Fig.2 Effect of Jiuqu addition on the quality of glutinous rice tea wine
2.1.3 发酵温度对糯米茶酒品质的影响
由图3可知，在发酵温度在26～34 ℃之间时，糯米茶酒的感官评分随发酵温度的升高呈现出先上升后下降的趋势，发酵温度30 ℃是糯米茶酒发酵的最适温度，其感官评分达到最高的（82.93±0.76）分。当发酵温度低于30 ℃之前，糯米茶酒酒体不够醇厚、口感较为淡薄；当发酵温度高于30 ℃之后，糯米茶酒开始出现苦涩味，进而使其感官评分均显著低于82.93分（P＜0.05）。糯米茶酒的酒精度随发酵温度的升高而升高，当发酵温度高于30 ℃之后，其酒精度未发生显著性变化（P＞0.05），故选择发酵温度为30 ℃进行后续试验。
图3 发酵温度对糯米茶酒品质的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of glutinous rice tea wine
2.1.4 发酵时间对糯米茶酒品质的影响
由图4可知，发酵时间从8 d增加至16 d，糯米茶酒的酒精度随之从（8.42±0.06）%vol增加至（12.21±0.10）%vol。由于酒精度的升高能使糯米茶酒酒体更加丰满，故其感官评分也随之升高，最高达到了（90.94±1.24）分。发酵时间的延长也有助于酿酒微生物产生较为丰富的香气物质，使糯米茶酒获得不错的感官评分[26]。由图4可知，当发酵时间从14 d增加到16 d时，糯米茶酒的酒精度与感官评分均未发生显著性变化（P＞0.05）。故选择发酵时间为14 d用于后续响应面试验。
图4 发酵时间对糯米茶酒品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on the quality of glutinous rice tea wine
2.2 糯米茶酒工艺优化响应面试验
通过单因素试验，表明感官评分对糯米茶酒的品质较酒精度而言更为重要，故通过Box-Behnken中心组合设计[27]，对茶粉添加量（A）、酒曲添加量（B）、发酵温度（C）和发酵时间（D）4个因素为响应因素，并以感官评分（Y）为响应值进行响应面试验，结果见表3。
对试验数据进行方差分析，结果见表4。以感官评分为响应值，经回归拟合后，得到相应的回归方程：
表3 发酵条件优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface methodology for fermentation conditions optimization
表4 响应面试验方差分析结果
Table 4 Variance analysis results of response surface methodology
续表
注：“*”表示在P＜0.05水平上显著，“**”表示在P＜0.01水平上极显著。
由表4可知，模型的决定系数R2=0.993 1，调整决定系数R2Adj=0.9862。4个因素对糯米茶酒感官评分的影响次序为D＞A＞C＞B，即发酵时间对糯米茶酒感官评分的影响最为显著，其次是茶粉添加量，再次是发酵温度。一次项A、D，交互项CD，二次项A2、B2、C2、D2对糯米茶酒感官评分的影响极为显著（P＜0.01）；一次项C，交互项AD、BC对糯米茶酒感官评分的影响达到了显著水平（P＜0.05）。
4个因素的两两相互作用的响应面图如图5所示。由图5可知，4个因素的两两相互作用中，因素C与因素D所形成的响应面曲面坡度最为陡峭，与方差分析中交互项CD对糯米茶酒感官评分的影响极为显著（P＜0.01）的结论相吻合。此外，因素AD与BC交互作用影响显著（P＜0.05）。
根据响应面软件分析，糯米茶酒在茶粉添加量2.08%、酒曲添加量2.00%、发酵温度29.95 ℃和发酵时间13.84 d的条件下，感官评分可获得最高的理论值91.42分。为了试验的可操作性将软件得出的最优浸提条件进行适当调整为茶粉添加量2.1%、酒曲添加量2.0%、发酵温度30.0 ℃和发酵时间13.8 d，进行3组平行验证试验后，糯米茶酒的感官评分实际值为（91.87±1.24）分。
图5 各因素交互作用对浸提率影响的响应面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between eachfactor on extraction rate
2.3 糯米茶酒理化指标与黄酮类物质分析
经响应面优化后测定糯米茶酒的理化指标及黄酮类物质的含量，用未添加茶粉的酒样作为对照，测定结果见表5。
由表5可知，糯米茶酒的理化指标与对照酒样之间存在显著性差异（P＜0.05），其中，糯米茶酒的总糖、非糖固形物、氨基酸态氮、pH、感官评分均显著高于对照酒样（P＜0.05）；总酸和酒精度则显著低于对照酒样（P＜0.05）。以上6项理化指标均符合中华人民共和国GB/T 13662—2018《黄酒》标准[19]。红茶茶粉的添加能将其中的黄酮类物质（芦丁、槲皮素、山奈酚、杨梅素分别为1.46 mg/g、0.93 mg/g、0.85 mg/g、0.21 mg/g）带入糯米茶酒中，使其具有一定的生物活性，如芦丁能防治脑溢血、高血压、急性出血性肾炎等疾病[28]，槲皮素可改善机体脂肪代谢、抑制甘油三酯积累[29]，山奈酚对心血管疾病等的治疗与预防有不错的疗效[30]，而杨梅素可改善由免疫应答引起的炎症反应[31]。综上，糯米茶酒具有一定的保健价值。
表5 两个酒样的理化指标与黄酮类物质含量
Table 5 Physicochemical indexes and flavonoids contents in two wine samples
注：“ND”表示未检出，同一行不同字母表示数值之间差异显著（P＜0.05）。下同。
2.4 糯米茶酒香气成分分析
经响应面优化后通过GC-MS测定糯米茶酒的香气物质及其含量，用未添加茶粉的酒样作为对照，测定结果见表6。
表6 两个酒样的香气物质含量
Table 6 Contents of aroma compounds in two wine samples
续表
由表6可知，在糯米茶酒中共检出42种香气物质（包括酯类物质、醇类物质、酸类物质、醛酮类物质和其他类物质），在香气物质的种类上多于对照酒样的33种香气物质。其中，乙酸乙酯、异戊醇、苯乙醇、乙酸是糯米茶酒的主要香气物质，其含量均显著高于对照酒样（P＜0.05）。乙酸苯甲酯、已酸-2-已烯酯、水杨酸甲酯、橙花醇、芳樟醇、氧化芳樟醇、反式-2-己烯酸、香叶醛、2,6,6-三甲基环已烷酮、α-紫罗酮、β-大马酮、β-紫罗酮、N-乙基琥珀酰亚胺、N-乙基乙酰胺、咖啡碱、十二烷等16种化合物是糯米茶酒相对于对照酒样所特有的香气物质，其中，乙酸苯甲酯、已酸-2-已烯酯、水杨酸甲酯、橙花醇、芳樟醇、氧化芳樟醇、香叶醛、α-紫罗酮、β-大马酮、β-紫罗酮、咖啡碱、十二烷等12种香气物质是红茶中原有的香气物质[32-33]，而其余4种香气物质则可能是在发酵过程中红茶的某些成分经微生物代谢后生成，进而使糯米茶酒兼具红茶茶香。综上，经试验优化后可获得酒香与茶香和谐、浓郁的糯米茶酒。
3 结论
以糯米与红茶为主要原料，采用生料法酿造黄酒，在单因素试验的基础上采用Box-Behnken中心组合设计优化糯米茶酒的酿造条件。结果表明，在洗净的糯米中添加2.1%的茶粉、2.0%的酒曲及2倍质量的纯净水，30.0 ℃发酵13.8 d。后经滤布压榨、抽滤，85 ℃热水煎酒20 min，待冷却后可获得感官评分91.87分、酒精度12.33%vol的糯米茶酒，酒体呈黄褐色、酒香与茶香和谐、酒体丰满，理化指标符合GB/T 13662—2018《黄酒》标准。利用HPLC检测糯米茶酒中黄酮类物质及其含量，其中，芦丁、槲皮素、杨梅素、山奈酚含量分别为98.23 mg/L、25.45 mg/L、16.71 mg/L、2.72 mg/L；采用LLE-GC-MS分析共检测出糯米茶酒中42种香气物质，其中芳樟醇、香叶醛、β-大马酮等16种香气物质是由原料中添加了红茶所致。因此，该糯米茶酒不仅感官特性优良而且具有一定的保健价值，进而具有广阔的市场潜力。
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