曲是以粮谷为原料，经微生物繁殖后，具有糖化、液化、发酵能力的生物制剂，是酒、食醋、酱油等传统酿造中至关重要的发酵剂[1]。早在北魏时期就有在制曲时加入中草药的记载，制曲入药有增加风味、促进有益制曲微生物生长和抑制杂菌的作用[2]。根据曲的品种，添加药材的种类和用量通常不同，如宁波白药在制曲时加入1种中药材；桂林三花小曲添加约10种中草药；四川邛崃米曲加入大量中药材；董酒的小曲加入71种，大曲加入40种中药材[3-4]。现代微生物发酵过程研究表明，微生物菌群具有氧化、酯化、甲基化、还原化等多种生物转化能力[5-7]。微生物代谢过程中能够产生大量的酶分解利用中药材，中药材经过微生物的发酵，活性成分能得到充分的分离和提取，更易被机体吸收而发挥其生物活性，从而更好地发挥天然中草药的药效。
目前，中药材对曲中有益菌生长代谢所起作用的探究仅局限于中药材对酵母菌和根霉的影响，王世强等[8]的研究表明，人参含量的增加会使酵母菌的数量增加，人参对根霉菌丝的生长和淀粉酶活力提高有一定的刺激作用。周恒刚研究了8种中药材对酵母菌生长的影响，结果表明陈皮、甘草、香附子对酵母生长及酒精生成都有明显促进作用；杏仁、肉桂、良姜效果不明显；柴胡、茯苓具有抑制作用[4]。
本实验室前期研究了制曲药材的选择规律，药材制作纯种米曲的性能，但对药材成分对米曲霉生长代谢的作用规律探究较少[9-10]。选择常用的20种制曲中药材为原料，通过不同的提取方法进行提取，用于米曲霉的生长试验，探究中草药及其提取成分对米曲霉生长和淀粉水解能力的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
石菖蒲、天门冬、茯苓、苍术、黄精、红景天、西洋参、地黄、川乌、木香、牛膝、麦冬、黄芪、人参、何首乌、辣蓼、菊花、杏仁、枸杞、当归：成都市武侯区同仁堂药店。
米曲霉（Aspergillus oryzae）QJ：四川大学食品生态工程与生物技术研究室保藏。
无水乙醇、无水乙醚、苯酚、硫酸、酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、氢氧化钠、无水亚硫酸钠、香草醛、冰乙酸、高氯酸（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂公司；福林酚（Folin-Ciocalte）（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar medium，PDA培养基）：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然。
无机盐淀粉培养基：硝酸钾0.2%，硫酸亚铁0.01%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，氯化钠0.05%，可溶性淀粉2%，琼脂2%，pH自然。
1.2 仪器与设备
UV-2450型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；CW240小型中药粉碎机：山东临清宏源制药设备有限公司；KQ5200DB超声波清洗机：江苏省昆山市超声仪器有限公司；YXQ-LS-75SII型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司；HWS-28电热恒温水浴锅：上海申顺生物科技有限公司；FA2004B电子天平：上海天美天平仪器有限公司；101-1型电热鼓风恒温干燥箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 菌种活化及培养
在无菌条件下，从种斜面上刮取适量米曲霉孢子接种于PDA试管斜面培养基上，在28 ℃恒温培养5 d，即活化。
用无菌水水洗已活化的米曲霉PDA试管斜面培养基以制备孢子悬液，再将孢子悬液稀释至适宜梯度，涂布于已灭菌的PDA平板培养基上，28 ℃条件下培养2 d，待整个平板中长满白色菌丝后，于4 ℃保藏备用。
1.3.2 中药材及其提取
采用蒸馏水、乙醇、乙醚三种溶剂对中药材进行提取。
蒸馏水提：中药材干燥粉碎后过40目筛，取10 g加入200 mL冷水浸泡60 min，煮沸后保持微沸60 min，4层纱布过滤，使滤液浓度为0.2 g/mL，于4 ℃保藏备用[11]。
乙醇、乙醚：取10 g粉碎中药材，加入100 mL 体积分数80%的乙醇（乙醚），浸泡48 h，25 ℃、200 W超声30 min后用4层纱布过滤，收集滤液后重复上述过程再提取一次，合并两次滤液，将滤液旋转蒸发浓缩至50 mL，得到中药材0.2 g/mL的药液，于4 ℃保藏备用[12]。
1.3.3 测定方法
总糖测定：采用苯酚硫酸法[13]；还原糖测定：采用DNS比色法[14]；总酚含量测定：采用Folin-Ciocalte法[15]；总黄酮含量测定：参考QUTTIER-DELEU C等的方法[16]；总皂苷含量测定：参考彭维等[17]的方法。
米曲霉的生长试验：将15 mL无机盐淀粉培养基和20%的药材提取液装入试管，以不加中草药提取液的无机盐淀粉培养基为空白，121 ℃灭菌20 min后倒入直径10 cm的培养皿中，待平板凝结后，接入采用直径为5 mm的打孔器打取1.3.1培养好的米曲霉菌落，于28 ℃培养72 h，利用碘-淀粉比色法制得透明圈，采用十字交叉法量定菌落直径和透明圈直径，并计算透明圈直径与菌落直径之比值（transparent circle diameter/colony diameter，H/C值），其中，菌落直径表征的是米曲霉的生长情况，透明圈直径表征的是米曲霉对淀粉的水解能力，H/C表征的是单位米曲霉淀粉水解能力。每个样品做3个平行实验。
2 结果与分析
2.1 不同溶剂对20种药材提取液成分的影响
20种药材的蒸馏水、乙醇、乙醚提取液的化学成分测定结果见图1。
图1 20种中药材蒸馏水提取液（A）、乙醇提取液（B）、乙醚提取液（C）中的主要组分含量比较
Fig.1 Comparison of contents of main component in water extract(A),ethanol extract (B) and ether extract (C) of 20 Chinese medicinal materials
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、（21）分别代表石菖蒲、天门冬、茯苓、苍术、黄精、红景天、西洋参、地黄、川乌、木香、牛膝、麦冬、黄芪、人参、辣蓼、菊花、杏仁、枸杞、何首乌、当归、（空白）。下同。
由图1可知，各种药材提取液中成分含量有所不同，蒸馏水提取液中的总糖、还原糖、总酚、总皂苷和总黄酮含量相对较高。采用溶剂提取法进行药材有效成分的提取，主要根据药材中各有效成分的溶解性能不同而将其溶解出来。溶剂根据极性大小分为亲水性和亲脂性溶剂，水的极性大于乙醇和乙醚。中药材化学成分也分为亲水性和亲脂性成分，如单糖、低聚糖和苷类为亲水性成分[18]。
2.2 不同溶剂的20种中药材提取液对米曲霉生长的影响
20种中药材的不同提取液对米曲霉生长的菌落直径、透明圈直径（反映水解淀粉能力大小）、H/C值（反映米曲霉单位代谢合成淀粉酶的速率）的影响结果见图2。
图2 20种中药材蒸馏水提取液（A）、乙醇提取液（B）和乙醚提取液（C）对米曲霉生长指标的影响
Fig.2 Effects of water extract (A),ethanol extract (B) and ether extract (C) of 20 Chinese medicinal materials on growth indexes of Aspergillus oryzae
从图2可以看出，中草药的水提液对米曲霉的生长、水解淀粉能力的促进作用要强于乙醇提取液和乙醚提取液。
从图2A可以看出，黄精、枸杞和杏仁的水提取液对米曲霉生长和水解淀粉能力促进作用最明显，菌落直径较空白组分别提高了75.86%、65.52%、57.47%，透明圈直径较空白组分别提高了43.36%、31.60%、33.07%。黄精、枸杞和杏仁对米曲霉的H/C值呈现出抑制效果，其抑制率分别为15.56%、20.95%和18.56%；木香对米曲霉的抑制作用最明显，菌落直径较空白组降低了27.60%，菌落直径较空白无明显作用，但对米曲霉的H/C值促进作用最明显，其H/C值较空白组提高了38.32%。
从图2B可以看出，在乙醇提取液中，除菊花、苍术、西洋参、当归、石菖蒲、木香外，其他对米曲霉生长及水解淀粉的能力都有一定程度的促进作用。以枸杞、红景天、地黄、黄精、杏仁对米曲霉生长的促进作用最明显，菌落直径较空白组分别提高了31.47%、24.56%、18.00%、16.45%、15.38%，透明圈直径较空白组分别提高了5.70%、7.65%、6.98%、13.02%、4.93%，H/C值较空白组分别下降了19.76%、13.78%、9.58%、2.99%和8.98%。木香、石菖蒲和当归对米曲霉生长的抑制作用效果最明显，菌落直径较空白组分别降低了52.17%、49.01%和37.09%，透明圈直径较空白组分别降低了14.42%、10.66%和9.79%；木香、石菖蒲和当归对米曲霉的H/C值的促进作用最明显，H/C值较空白组分别提高了78.51%、74.80%、43.07%。
从图2C可以看出，在乙醚提液中，黄精、枸杞和杏仁对米曲霉生长具有促进作用，菌落直径较空白组分别提高了15.01%、2.63%和23.77%。具有抑制作用的有木香、石菖蒲、当归、苍术、菊花、辣蓼、人参、黄芪、麦冬和牛膝，菌落直径较空白组降低了16.69%～63.51%。对米曲霉水解淀粉能力具有促进作用的有枸杞、何首乌、天门冬、川乌、牛膝、黄芪和杏仁，透明圈直径较空白组提高了4.70%～28.64%。木香、石菖蒲和当归对米曲霉的H/C值促进作用最明显，H/C值较空白组分别提高了89.82%、85.03%和53.89%。
综上，三种提取方式对于米曲霉的生长都有促进作用的中药材有黄精、枸杞和杏仁，三种提取方式对米曲霉的生长都有抑制作用的中药材是木香；石菖蒲、木香和当归的醇提液和醚提液，能显著提高单位米曲霉淀粉水解能力。此外，同一药材的不同提取液对于同一菌种的作用效果也有不同，如菊花、苍术、西洋参、当归和石菖蒲用水提取时对于米曲霉的作用是促进，当用乙醇或乙醚提取时，对米曲霉的作用变为抑制。
2.3 相关性分析
对药材提取液中总糖、还原糖、总酚、总黄酮和皂苷与米曲霉生长的菌落直径、透明圈直径及H/C值进行相关分析，结果见表1。由表1可知，总糖与还原糖呈极显著正相关性（P＜0.01），总糖、还原糖与菌落直径及透明圈直径呈显著正相关性（P＜0.05），菌落直径和透明圈直径呈极显著正相关性（P＜0.01），表明药材中糖类成分通过促进微生物的生长，从而提高微生物水解淀粉的能力。皂苷类与H/C值呈极显著正相关性（P＜0.01），皂苷类与菌落直径及透明圈直径呈极显著负相关性（P＜0.01），表明药材中所含皂苷类成分抑制米曲霉生长及淀粉降解能力。中草药的成分组成比较复杂，除了多糖、黄酮、生物碱和皂苷等成分，还包含氨基酸、蛋白质、寡糖、微量元素、有机酸等，不同种类的药材提取液中含有的有效成分不同，其主要起促进及抑制作用的成分也有差异。中药材促菌、抑菌的物质基础是其中所含的各种活性成分，常见的促菌成分主要是多糖，抑菌成分主要有黄酮类、酚类、生物碱和萜类[19-23]。研究显示，皂苷类成分可通过与微生物膜甾醇形成复合物来破坏细胞膜的完整性，从而表现出抑菌活性[24，25]。本研究室前期采用逐步回归分析探讨了药材成分种类对曲的糖化力酶活的影响，其结果显示中药材中的皂苷类成分可能有助于提高米曲糖化力[6]。本研究中，虽然皂苷对米曲霉生长和淀粉酶合成都呈现抑制作用，但是对于淀粉酶合成的抑制相对弱于对菌体生长的抑制作用，从而使单位米曲霉淀粉水解能力相对提高。由于皂苷组分在传统制曲药材中存在较多，且具有多方面的功效作用，其在传统制曲酿造过程中的意义有待进一步探讨。
表1 药材提取液组分种类与米曲霉生长指标的相关分析
Table 1 Correlation analysis between the components of extract and the growth index of Aspergillus oryzae
注：“**”表示具有极显著影响（P＜0.01）；“*”表示具有显著性影响（P＜0.05）。
3 结论
以水作为溶剂提取出的总糖、还原糖、总酚、总黄酮和总皂苷含量最高，对米曲霉的生长和淀粉水解能力促进作用最明显。
对米曲霉生长及淀粉水解能力促进作用最明显的药材为黄精、枸杞和杏仁，抑制作用最明显的药材为木香；对单位米曲霉淀粉水解能力（H/C值）促进作用最明显的药材为木香；
对20种中药材提取液影响微生物生长试验结果进行相关分析和析因分析，结果表明，皂苷类化合物对霉菌的生长具有抑制作用，但能提高单位霉菌淀粉水解能力。
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