生鲜湿面是指经一系列加工工艺制成的未经杀菌及防腐剂处理的面条[1]，其营养丰富[2]、口感筋道[3]、食用方便、耐煮性好、便于携带，深受消费者青睐。由于生鲜湿面水分含量[4]较高，容易滋生腐败微生物，导致保藏期短[5]，严重制约了生鲜湿面[6]大规模商业化生产的品质[7]，这一直是阻碍生鲜湿面工业化生产的严重问题[8]。
中原地区主要以面食为主，生鲜湿面在河南地区尤为畅销，为近一步提高生鲜湿面的最佳保质期和食用品质，对生鲜湿面的腐败菌群进行深入分析具有重要的意义。周文化等[9]对室温下存放48 h的生鲜湿面进行菌相分析，发现引起生鲜湿面腐败的微生物主要是毛霉和青霉；肖付刚等[10]对28 ℃条件下保存的生鲜湿面的微生物种群进行分离鉴定，研究发现引起生鲜湿面腐败变质的细菌是芽孢杆菌属（Bacillus sp.）和葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）。目前，河南地区主要研究方向集中在通过生鲜湿面的加工工艺优化[11]及化学保鲜剂[12-13]的处理延长生鲜湿面保质期，并未对河南地区生鲜湿面中的腐败菌进行分离鉴定。河南高温高湿、雨热同期的气候特点使生鲜湿面储存运输过程微生物的变化受到气候条件的影响较大，易出现菌落总数超标现象导致变质[14]。
因此，本研究拟采用涂布平板法对郑州市售生鲜湿面中的腐败菌进行分离，通过形态观察及分子生物学技术对分离腐败菌进行菌种鉴定，为针对抑制生鲜湿面中腐败菌提供理论参考，以期为生鲜湿面的产业发展提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
生鲜湿面：购于郑州市中原区5个不同市场，每个市场3个批次，每批次3个重复样本。
1.1.2 试剂
琼脂粉、酵母提取物、胰蛋白胨（均为生化试剂）、葡萄糖、蔗糖、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾（均为分析纯）：生工生物工程（上海）股份有限公司；硫酸镁、硫酸亚铁（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；硝酸钠（分析纯）：中国（郑州）派尼化学试剂厂；通用引物（ITS1/ITS4）和（27F/1492R）：派森诺生物基因科技有限公司；rTaq酶（5 U/μL）：大连宝生物工程有限公司；细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：天根生化科技有限公司。
1.1.3 培养基
平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基[2]：酵母浸出物2.5 g，葡萄糖1 g，胰蛋白胨5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，15%氢氧化钠2 mL，调制pH值至7.2～7.4，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextrose agar，PDA）培养基[2]：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然，121 ℃，高压蒸汽灭菌15 min。
高盐察氏培养基[2]：硝酸钠2 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4 0.01 g，NaCl 6 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
LB培养基[2]：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
ABI-2720聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国Applied Biosystems公司；Mini Pro 300V Power Supply major science电泳仪：美国Major Science公司；ABI 3730XL测序仪：美国Applied Biosystems公司；QL-861旋涡振荡器：江苏省海门市麒麟医用仪器厂；SW-CJ-2D洁净工作台：苏州净化设备有限公司；Neofuge 13R台式高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司；Labnet Sub System 70电泳槽：美国Labnet公司；蔡司ZEISS primo star生物显微镜：北京普瑞赛司仪器有限公司；HZQ-X100恒温振荡培养箱：常州金坛精达仪器制造有限公司；Mixer 4K迷你涡旋混合器：生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 生鲜湿面的微生物计数
将包装密封的生鲜湿面分别于25 ℃和37 ℃条件下贮藏，每24 h统计微生物菌落数，连续观察72 h。菌落总数测定：参照GB/T 4789.2—2016《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》[15]；霉菌及酵母的测定：参照GB/T 4789.15—2016《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验霉菌和酵母菌计数》[16]。
1.3.2 生鲜湿面中腐败菌的分离纯化
在无菌条件下，取25 ℃、37 ℃条件下培养48 h后的面条25 g于含225 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，4 000 r/min振荡2 min，采用无菌生理盐水梯度稀释至10-7。吸取上述37 ℃稀释梯度为10-4、10-5、10-6、10-7的稀释液200 μL涂布于平板计数琼脂培养基，于37 ℃条件下培养48 h，用于分离腐败细菌；吸取上述25 ℃稀释液200 μL涂布于PDA培养基，25 ℃条件下培养48 h后，挑取单菌落接种于高盐察氏培养基，于25 ℃条件下培养48 h，用于分离腐败霉菌，每个稀释度3个平行。同时，吸取200 μL无菌生理盐水稀释液涂布于不同培养基作空白对照，每个不同培养基3个平行。从平板计数琼脂、PDA培养基及高盐察氏培养基中选取典型生长的单一菌落，反复分离纯化，镜检，得到纯菌株4 ℃保藏。
1.3.3 生鲜湿面中腐败菌的形态学鉴定
菌落形态观察：观察单菌落的大小、形态、颜色、质地、边缘、表面纹饰等。细胞形态观察：霉菌挑取48 h培养物，细菌挑取24 h培养物制成载片标本，观察细胞形态和排列方式等。霉菌的形态学鉴定实验方法参考GB/T4789.16—2016《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定》[17]，细菌的形态学鉴定实验方法参考《一般细菌常用鉴定方法》[18]和《伯杰细菌鉴定手册》[19]。
1.3.4 生鲜湿面中腐败菌的分子生物学鉴定
挑取培养48 h的单菌落分别转至LB培养基和PDA培养基中，分别于25 ℃、37 ℃培养24 h，采用真菌和细菌基因组提取试剂盒提取待测菌株的DNA，以其为模板，采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）对真菌的ITS rDNA基因序列进行PCR扩增；采用通用引物27F（5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'） 和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3'）对细菌的16S rDNA基因序列进行PCR扩增。PCR扩增体系：基因组DNA（20 ng/μL）1 μL、10×Buffer（含2.5 mol/L Mg2+）5.0 μL、rTaq聚合酶（5 U/μL）1.0 μL、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（10 mmol/L）1.0 μL、正反引物各1.5 μL，加双蒸水至50 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min30 s，35个循环；72 ℃再延伸7 min，4 ℃终止反应。取5 μLPCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，将获得的PCR扩增产物条带送至上海派森诺基因科技有限公司进行测序。测序结果提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中进行序列比对，选取同源性较高的模式菌株的ITS rDNA或16S rDNA基因序列，使用MEGA10软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 生鲜湿面的微生物计数
包装密封的生鲜湿面在贮藏过程中，菌落总数、霉菌、酵母菌的变化规律见表1。
表1 贮藏过程中生鲜湿面中微生物生长情况
Table 1 Growth of microorganisms in fresh wet noodles during storage
由表1可知，随贮藏时间的延长，生鲜湿面中微生物的数量逐渐增多，当25 ℃条件下储藏72 h时，菌落总数已经达到1.6×106CFU/g。根据NY/T 1512—2014《绿色食品 生面食、米粉制品》[20] 微生物学指标规定菌落总数≤3×105 CFU/g，生鲜湿面在25 ℃条件下的货架期仅为48 h。生鲜湿面水分含量较高，营养丰富等特点为霉菌和酵母的生长提供了有利环境，河南高温高湿的气候特点加速了腐败细菌的生长，导致生鲜湿面货架期较短。
2.2 生鲜湿面中霉菌的分离及鉴定
从高盐察氏培养基中选取3株典型的霉菌进行反复划线分离培养，编号分别为A1、B1、C1，其菌落形态和个体形态特征见图1，特征描述见表2。
图1 菌株A1、B1、C1的菌落形态及个体形态特征
Fig.1 Colonial morphology and individual morphology characteristics of strains A1,B1 and C1
表2 菌株A1、B1、C1的菌落形态及个体形态特征描述
Table 2 Description of colony and individual morphology characteristics of strains A1,B1 and C1
由图1及表2可知，根据GB/T 4789.16—2016《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定》[17]初步鉴定菌株A1和B1均为曲霉属（Aspergillus sp.）、菌株C1为青霉属（Penicillium sp.）。进一步采用分子生物学技术对3株霉菌进行鉴定，其系统发育树见图2。
图2 基于ITS rDNA基因序列菌株A1、B1及C1的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain A1,B1 and C1 based on ITS rDNA gene sequences
由图2可知，菌株A1与黄曲霉（Aspergillus flavus）聚于一支，亲缘关系最近，菌株B1与黑曲霉（Aspergillus niger）聚于一支，亲缘关系最近，菌株C1与草酸靑霉（Penicillium oxalicum）聚于一支，亲缘关系最近。结合形态观察，将菌株A1、B1、C1分别鉴定为黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、草酸靑霉（Penicillium oxalicum）。
霉菌在自然界中分布广泛，特别是粮油食品中。宋显良等[21]利用霉菌菌落表征与显微镜镜检从生鲜湿面中初步判定鲜湿面货架期内霉点出现和霉味产生是毛霉和青霉引起的。黄曲霉及黑曲霉产生的次级代谢产物黄曲霉毒素，真菌毒素不仅会污染食品，而且会对人类的健康产生严重危害[22]。在生鲜湿面生产前期应严格把控原料中黄曲霉毒素含量，严格控制原料储存温度、湿度、水分含量等因素，限制黄曲霉及黑曲霉的生长，防止因毒素污染造成的损失。
2.3 生鲜湿面中细菌的分离及鉴定
从PCA培养基中反复划线分离出5株菌，编号分别为S1、S2、S3、S4、S5。通过革兰氏染色镜检发现，菌株S1、S3、S4、S5均为革兰氏阳性细菌，而菌株S2为革兰氏阴性细菌。5株细菌的菌落形态见图3，菌落形态特征描述见表3。
由图3及表3可知，根据《一般细菌常用鉴定方法》[18]和《伯杰细菌鉴定手册》[19]，初步鉴定菌株S1、S3、S4、S5为芽孢杆菌属（Bacillus sp.），菌株S2为沙门氏菌属（Salmonella sp.）。进一步采用分子生物学技术对5株腐败细菌进行菌种鉴定，其系统发育树见图4。
图3 5种腐败细菌的菌落形态
Fig.3 Colonial morphology of 5 strains of spoilage bacteria
表3 5种腐败细菌菌落形态特征描述
Table 3 Description of colonial morphology of 5 strains of spoilage bacteria
图4 基于16S rDNA基因序列5种腐败细菌的系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree of 5 strains of spoilage bacteria based on 16S rDNA gene sequences
由图4可知，菌株S1、S4、S5与蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）聚于一支，亲缘关系最近，菌株S2与肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）聚于一支，亲缘关系最近，菌株S3与副芽孢杆菌（Bacillus paramycoides）聚于一支，亲缘关系最近。结合形态观察结果，最终鉴定菌株S1、S4、S5为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），菌株S2为肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica），菌株S3为副芽孢杆菌（Bacillus paramycoides）。
3 结论
本研究对生鲜湿面中腐败菌进行分离纯化，得到3株典型霉菌A1、B1、C1和5株典型细菌S1、S2、S3、S4、S5，经形态观察及分子生物学技术鉴定，结果表明，3株腐败霉菌中菌株A1为黄曲霉（Aspergillus flavus），菌株B1为黑曲霉（Aspergillus niger），菌株C1为草酸靑霉（Penicillium oxalicum）；5株腐败细菌中菌株S1、S4、S5为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），菌株S2为肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica），菌株S3为副芽孢杆菌（Bacillus paramycoides）。
[1]SIAH S,QUAIL K J.Factors affecting Asian wheat noodle color and timedependent discoloration:A review[J].Cereal Chem,2018,95(2):189-205.
[2]曹涵，刘伯业，陈复生，等.鲜湿面防腐保鲜技术的研究进展[J].粮食与油脂，2020，33（3）：28-30.
[3]张庆霞.非热杀菌技术在生鲜湿面防腐保鲜中的应用研究进展[J].食品与发酵工业，https：//doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.024147.
[4]LI M,MA M,ZHU K X,et al.Critical conditions acceleratingthe deterioration of fresh noodles:A study on temperature,pH,water content,and water activity[J].J Food Process Pres,2016,41(4):1-7.
[5]孙子钦，王燕，吴卫国，等.生湿面保鲜技术研究现状[J].食品与机械，2019，35（2）：226-230.
[6] HOU J,LIY Q,WANGZ S,et al.Applicative effect of glycinin basic polypeptide in fresh wet noodles and antifungal characteristics[J].LWTFood Sci Technol,2017,83:267-274.
[7]邓航，周文化，李立华.小麦品质与鲜湿面品质的关系[J].食品与机械，2017，33（12）：6-11.
[8]李冉冉，李洪军，李少博，等.生湿面的保鲜技术及应用研究进展[J].食品与发酵工业，2019，45（4）：250-256.
[9]周文化，郑仕宏，唐冰.生鲜湿面菌相分析及腐败菌分离[J].粮食与油脂，2010（4）：45-46.
[10]肖付刚，孙军涛，王德国，等.生湿面中腐败菌分析[J].粮食与油脂，2016，29（5）：76-78.
[11]王晓明，陈洁，吕莹果，等.生鲜面在不同温度下品质变化研究[J].河南工业大学学报（自然科学版），2014，35（1）：69-72.
[12]王治中，陈洁，王远辉，等.干热处理面粉对鲜湿面品质的影响[J].河南工业大学学报（自然科学版），2018，39（1）：58-61.
[13]游新侠，王颖颖，侯利霞.防腐剂在花色生鲜面保鲜中的应用研究[J].河南工业大学学报（自然科学版），2015，36（3）：61-64.
[14] LI M,ZHU K X,SUN Q J,et al.Quality characteristics,structural changes,and storage stability of semi-dried noodles induced by moderate dehydration:Understanding the quality changes in semi-dried noodles[J].Food Chem,2016,194:797-804.
[15]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 4789.2—2016 食品安全国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[16]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T4789.15—2016 食品安全国家标准食品卫生微生物学检验霉菌和酵母菌计数[S].北京：中国标准出版社，2016.
[17]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 4789.16—2016 食品安全国家标准食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[18]中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法[M].北京：科学出版社，1978：135-179.
[19]BUCHANAN R E，GIBBONS N E.伯杰细菌鉴定手册[M].北京：科学出版社，1984：667-758.
[20]中华人民共和国农业部.NY/T 1512—2014 绿色食品生面食、米粉制品[S].北京：中国农业出版社，2014.
[21]宋显良，邓学良，周文化.生鲜湿面防霉保鲜技术[J].食品与机械，2013，29（2）：159-162.
[22]刘青，邹志飞，余炀炀，等.食品中真菌毒素法规限量标准概述[J].中国酿造，2017，36（1）：12-18.