啤酒糟是啤酒酿造中麦芽糖转化的主要副产物，主要为麦芽皮壳类物质，约占总副产物的85%[1]。有研究表明，在干燥的啤酒糟中含纤维55%～61%、蛋白质24%～28%、脂肪8%～11%、糖1%～3%以及3%～5%的灰分[2]。我国是世界上最大的啤酒生产国，尽管2018年产量下降2.2%，年产量达到3 900万kL。啤酒糟约占啤酒产量的25%，仅一年我国啤酒糟的产量就将近1 000万t，由于不宜贮存，极易腐败，造成资源浪费且污染环境。
目前，国内外研究将啤酒糟主要应用于动物饲料[3-6]、农业[7-8]、能源[9-10]、生活性物质[11-12]等方面。在食品方面也有开发利用，刘军[13]将啤酒糟作为辅料制作酱油，质量与传统工艺相当，李爽等[14]利用啤酒糟饼干配方进行了研究，郭萌萌等[15]利用啤酒糟和玉米混合制作膨化食品，FERREIRA A M等[16]利用啤酒糟制作餐具，王然[17]在牛乳中加入啤酒糟进行酸奶的研制。苹果醋是经发酵而得到的一种饮料，以新鲜苹果为原料先发酵得到果酒，然后接入醋酸菌发酵得到果醋，LIU G P等[18]对苹果醋醋酸发酵工艺进行了优化，李曦等[19]分析了苹果醋饮料中的有机酸。啤酒糟中的营养成分和谷物的相近，将其作为原料用于发酵果醋，不仅能充分利用啤酒糟的剩余价值，还能赋予果醋独特的风味，张霁红等[20]研究了我国苹果醋产业现状、存在的问题和发展趋势，在国外有关果醋调味品、果醋保健品的产品比较多，美国H.J.Heinz公司生产的苹果醋远销全球，意大利VARVALLO生产的系列果醋在欧洲市场有很大的影响力[21]。
本研究通过顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法分析实验室自制啤酒糟苹果醋发酵的三个不同阶段（啤酒糟苹果汁、啤酒糟苹果酒、啤酒糟苹果醋）香气成分，探究啤酒糟苹果醋不同发酵阶段挥发性香气成分及抗氧化性变化，对今后啤酒糟果醋及相关产品开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
啤酒糟苹果醋：实验室自制；氯化钠（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；C8～C40正构烷烃、2-辛醇（纯度≥97.0%）、1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源叶生物技术有限公司。其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
DK-98-II型恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器公司；C-MAG HS7型加热磁力搅拌器：艾卡（广州）仪器设备有限公司；20 mL顶空瓶、Agilent 7890/5977气相色谱质谱联用仪、HP-5ms色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）：美国Agilent公司；SPME进样手柄、100 μm聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取纤维头：美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 啤酒糟苹果醋的加工工艺流程及操作要点
挑选新鲜苹果→清洗→切块去核→压榨→调节酸糖含量→加啤酒糟→杀菌→酒精发酵→醋酸发酵→离心→装瓶→杀菌→冷藏
原料前处理：将苹果去核切碎加水1∶1榨汁，新鲜啤酒糟在80 ℃烘箱中烘烤5 h，粉碎后用100目筛子过筛。
酒精发酵：酵母菌接种量为0.6%，发酵温度为28 ℃。
醋酸发酵：醋酸菌接种量为1.0%，发酵温度为32 ℃，摇床转速为120 r/min。
离心：果酒和果醋发酵完成后装瓶前均需在3 000 r/min离心5 min，将上清液装瓶。
1.3.2 挥发性香气成分测定[22-23]
（1）样品处理
取5 mL啤酒糟苹果汁、果酒、果醋样液装入20 mL顶空瓶中，加入1.5 g NaCl，放入磁力搅拌器转子，加盖密封垫。每次萃取前40 ℃水浴平衡15 min，使得被分析物质与顶空瓶达到平衡状态。将进样手柄先在250 ℃老化5 min后插入顶空瓶，推出纤维头，调整插入深度，40 ℃水浴吸附30 min，GC进样口解吸5 min，每组实验至少重复3次。
（2）GC-MS参数及分析条件
GC条件：进样口温度250 ℃；载气为氦气（He），流速为1 mL/min，采用不分流进样；毛细管色谱柱为Agilent HP-5ms（30 m×250 μm×0.25 μm）；程序升温条件为初始温度40 ℃保持12 min，以3 ℃/min升至108 ℃保持2 min，再以5 ℃/min升至250 ℃保持5 min。MS条件：离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，扫描范围45～550 amu。
（3）香气成分定性、定量分析
总离子流色谱图（total ion chromatogram，TIC）积分后对照美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）14.L谱库检索化合物（匹配度＞80），并参考文献、资料进行鉴定。以2-辛醇（纯度≥97.0%）为内标对香气成分计算各化合物的相对含量。
1.3.3 体外抗氧化活性评价
（1）样品处理
取不同的啤酒糟苹果汁、苹果酒、苹果醋上清液为试验样液，测定抗氧化活性。
（2）清除DPPH自由基的能力[24-25]
分别取0.1 g/100 mL的VC标准溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL定容于50 mL容量瓶中，配制成系列浓度梯度。准确量取DPPH溶液4.85 mL（DPPH的配制：精确称取0.025 g DPPH加无水乙醇于100 mL棕色容量瓶避光保存，临用时稀释10倍）于10 mL离心管中，分别添加150 μL不同浓度的VC标准溶液，室温避光静置30 min，在波长517 nm处测量吸光度值，同时用无水乙醇做空白对照。样品稀释成不同体积分数（10%、20%、30%、40%、50%）的溶液混匀，黑暗中放置30 min，取上清液，在波长517 nm处测吸光度值。DPPH自由基清除率计算公式如下：
式中：A0是空白对照组的吸光度值，A1是系列梯度浓度VC标准溶液吸光度值。
（3）还原Fe3+能力的测定[26]
取1 mL系列浓度VC标准溶液，加入2.5 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6）中混匀，再加入铁氰化钾（1%）2.5 mL混匀，50 ℃恒温水浴反应20 min后，加1 mL三氯乙酸（10%）混匀；取2.5 mL混合溶液，加水2.5 mL稀释，再加入氯化铁（0.1%）0.5 mL避光反应10 min后，样品稀释成不同体积分数（5%、10%、15%、20%、25%）的溶液混匀，避光反应10 min后，在波长700 nm处测量吸光度值，样品中的还原性物质可将Fe3+还原为Fe2+，该物质在波长700 nm处有特征吸收峰，吸光度值的大小可以反映抗氧化性的强弱，吸光度值越大，则表示样品的还原能力越强，抗氧化性越高。
1.3.4 数据处理
采用Excel 2016、Orgin 7.5软件分析数据及作图。
2 结果与分析
2.1 啤酒糟苹果醋不同阶段挥发性物质的色谱图及定性分析
运用HS-SPME-GC-MS技术对啤酒糟苹果醋发酵过程中的挥发成分进行分析，其总离子流色谱图（total ion chromatogram，TIC）见图1，发酵过程中的挥发性成分及相对含量见表1。
图1 啤酒糟苹果汁（A）、苹果酒（B）及苹果醋（C）中挥发性成分GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in apple juice (A),apple cider (B) and cider vinegar (C) with brewer's grains analysis by GC-MS
表1 啤酒糟苹果醋不同发酵阶段挥发性香气成分GC-MS分析结果
Table 1 Results of volatile components in brewer's grains cider vinegar at different fermentation stages analysis by GC-MS
续表
注：“ND”表示未检出。
由图1及表1可知，啤酒糟苹果醋发酵过程中共鉴定出50种挥发性香气成分，其中包括酯类16种、醇类8种、醛类8种、酸类7种、酚类4种、其他4种、酮类2种、醚类1种。果汁中检测出12种挥发性物质，主要包括2-己烯醛、DL-薄荷醇、乙酸己酯、2-甲基丁基乙酸酯、6-甲基-5-庚烯-2-醇，相对含量最高的是2-己烯醛（12.36%），其中2-己烯醛、DL-薄荷醇、乙酸己酯只在果汁中检测到，可作为它的特征化合物。果酒中检测出15种挥发性物质，主要包括苯乙醇、异戊醇、5-甲基呋喃醛、2-甲基丁酸、2-乙酰基呋喃，相对含量最高的是苯乙醇（24.64%），是果酒的主要呈香物质。果醋中检测出24种挥发性物质，主要包括糠醛、辛酸、正己酸、苯乙醇、乙酸异戊酯、2-甲基丁醇、丁酸、庚酸，相对含量最高的是糠醛（10.19%），可用来评价果醋发酵时间，丁酸、庚酸、4-乙基苯酚并未在果汁和果酒中检测到，可作为果醋的特征物质。
醇类在果醋中含量相对较高，包括异戊醇、2-甲基丁醇、2,3-丁二醇、正己醇、6-甲基-5-庚烯-2-醇、2-乙基己醇、苯乙醇，且检测到的大部分是碳原子数＞6的高级醇。其中一部分是在果酒发酵过程中酵母菌在磷酸-戊糖途径产生的，另一部分是发酵中氨基酸在转氨酶作用下生成酮酸，经一系列转化生成的高级醇[27]，作为发酵过程中的底物，苯乙醇含量最高是24.64%，到最后发酵成果醋含量下降至8.14%。苯乙醇有一定的杀菌作用，香味独特，具有玫瑰香、紫罗兰香、茉莉花香等，给人带来愉悦的感觉[28]。
酯类是乙酰辅酶A与氨基酸或碳水化合物降解生成的高级醇的反应产物[29]，主要包括乙酸酯类、乙酯类、丁酯类和其他酯类，是果醋的特征香气成分。其中乙酸异戊酯在果醋里的最终含量为7.21%，它也是啤酒中的香味物质，出现在啤酒糟果醋中，对果醋增添别样的香气。在发酵后期，2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸丁酯、异戊酸己酯等未检出，可能是由于在发酵过程中因挥发含量太低未能检出，这与邓娜娜等[30]在桑椹果醋、张强等[31]在红树莓果醋未检测出己酸丁酯一致。
酸类是果醋的主要呈味物质，对果醋的风味有直接影响，其中辛酸和癸酸在果醋中增添水果香味和花香，低浓度的酸类可为果醋赋予清淡的香味，但过量又会表现出腐败的酸臭味[32]，对果醋的品质产生消极的影响，发酵结束后辛酸和癸酸的含量分别下降至8.92%和5.24%，使得果醋香气清淡，符合果醋的特征。
此外，还检测到8种醛类，在啤酒糟苹果汁阶段独有的是2-己烯醛，有浓郁的新鲜水果和绿叶清香气味[26]，在果酒和果醋阶段未检测到，可能是在发酵过程转化成其他物质。果酒和果醋阶段含量较高的有糠醛和苯甲醛，糠醛的含量从果酒阶段的2.4%，上升到果醋阶段的的10.19%，CAMARAJ S等[33]在研究Madeira葡萄酒过程中发现糠醛浓度和酒的酿造时间有良好的相关性，认为糠醛可以作为酒的陈酿时间指示剂。苯甲醛可能来自果酒阶段醇的进一步氧化，最终果醋中苯甲醛的含量为2.23%，虽然相对含量少，但对啤酒糟果醋的风味形成仍有一定的影响。
除醇类、酯类、酸类、醛类这些主要化合物外，还检测到一些其他的香气成分，它们的相对含量都比较低，对啤酒糟苹果醋的香气特性影响不是很大。
2.2 啤酒糟苹果醋发酵过程中体外抗氧化特性分析
2.2.1 DPPH自由基的清除能力
图2 啤酒糟苹果汁、苹果酒及苹果醋对DPPH自由基的清除作用
Fig.2 Scavenging effects of apple juice,apple cider and cider vinegar with brewer's spent grains on DPPH free radical
由图2可知，啤酒糟苹果汁、苹果酒、苹果醋都具有较强的DPPH自由基清除能力，随着体积分数的增加而增加。在相同体积分数下，其中啤酒糟苹果汁和苹果酒的清除能力趋势相似，在体积分数为20%时，二者清除率都在50%以上，体积分数达到50%时，对DPPH自由基的清除能力趋于稳定，啤酒糟苹果酒对DPPH自由基的清除率达到91.25%，而啤酒糟苹果汁对DPPH自由基的清除率也达到83.42%，啤酒糟苹果醋的清除效果也比较好，在最大试验浓度时清除率达到79.22%，与啤酒糟苹果汁DPPH自由基清除率相差不大，对DPPH的清除率顺序为啤酒糟苹果酒＞啤酒糟苹果汁＞啤酒糟苹果醋。孙强伟等[34]研究啤酒糟挥发油对DPPH自由基的清除作用明显，这与薛淑琴[22]对苹果醋的研究结果相一致，其原因可能与果醋里的多酚和黄酮等抗氧化活性物质含量有关。
2.2.2 Fe3+还原能力
图3 啤酒糟苹果汁、苹果酒及苹果醋Fe3+还原能力
Fig.3 Fe3+reducing capacity of apple juice,apple cider and cider vinegar with brewer's spent grains
由图3可知，三个阶段都具有较强的还原能力，各曲线呈上升趋势，啤酒糟苹果醋的还原能力明显比啤酒糟苹果汁、果酒低，可能是由于在果酒发酵阶段产生大量还原性物质，发酵成果醋后，一部分活性物质在长时间发酵后失活，使得果醋的还原能力有所下降，Fe3+还原能力由强到弱依次是啤酒糟苹果汁＞啤酒糟苹果酒＞啤酒糟苹果醋。
3 结论
本实验对啤酒糟苹果醋发酵过程中挥发性香气成分进行分析，共检出50种化合物，其中酯类16种、醇类8种、醛类8种、酸类7种、酚类4种、其他4种、酮类2种及醚类1种。果汁中检测出12种挥发性物质，其中2-己烯醛、DL-薄荷醇、乙酸己酯只在果汁中检测到，可作为它的特征化合物。果酒中检测出15种挥发性物质，相对含量最高的是苯乙醇（24.64%），是果酒的主要呈香物质。果醋中检测出24种挥发性物质，丁酸、庚酸、4-乙基苯酚并未在果汁和果酒中检测到，可作为果醋的特征物质。这些物质在不同阶段都有着不同的贡献，其中苯乙醇、乙酸异戊酯、2-己烯醛、糠醛共同作用形成了果酒、果醋特有的风味和口感。抗氧化活性试验结果表明，DPPH自由基的清除率顺序为啤酒糟苹果酒＞啤酒糟苹果汁＞啤酒糟苹果醋，Fe3+还原能力顺序为啤酒糟苹果汁＞啤酒糟苹果酒＞啤酒糟苹果醋。
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