作为我国传统发酵食品的重要组成部分，米酒[1]、黄酒[2]、白酒[3]、馒头[4]、酸粥[5]和鲊广椒[6]等均是以谷物为基础原料，通过自然环境、接入的酒曲或酸面团中的微生物菌株发酵而成。酸粥[5]和鲊广椒[6]等谷物发酵食品以乳酸菌为优势菌属，越来越多的研究亦表明，乳酸菌对其品质形成具有较大的影响[7]。顾旭峰等[8]研究指出，乳酸菌亦具有一定的淀粉水解能力，其发酵后的谷物制品营养价值和品质均有进一步提升。经乳酸菌发酵后的大豆肽溶液因有机酸含量显著增加而使得苦腥味减弱[9]，经乳酸菌发酵后的燕麦全谷物中燕麦蛋白和必需氨基酸具有更高的营养价值[10]，乳酸菌协同发酵可进一步提升饼干的风味[11]。筛选具有优良发酵特性的乳酸菌菌株用于谷物食品的生产一直都是研究的热点，陈妍婕等[12-13]分别筛选出了适合糙米乳、酸浆水和发酵糯玉米黏豆包生产的乳酸菌菌株，本团队前期研究发现米酒曲中亦蕴含了丰富的乳酸菌菌株资源[15]。有研究表明[16-17]，氨基酸和有机酸在赋予产品营养的同时，亦可改善产品的风味品质，因而在菌株的筛选过程中氨基酸和有机酸备受关注。
本研究采用纯培养技术，对广西省南宁地区米酒曲中乳酸菌多样性进行解析，在获取乳酸菌菌株并明确其分类地位的基础上，探讨乳酸菌纯种发酵糯米汁的可行性，并揭示乳酸菌在糯米汁中产氨基酸和有机酸的代谢特征，以期为后续筛选用于谷物发酵的优质乳酸菌菌种提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
米酒曲：购于南宁市五里亭农贸市场、琅西菜市场、淡村菜市场和北湖农贸市场，共采集11 个样品，所有酒曲均为南宁本地制作和销售；糯米和白糖：市售。
1.1.2 化学试剂
耐高温α-淀粉酶（3万U/g）、糖化酶（5万U/g）、琼脂粉、羧甲基纤维素钠（均为生化试剂）：湖南鸿鹰祥生物工程有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumammonium bromide，CTAB）、丙三醇、氯化钠、乙酸钠、酚、氯仿和异戊醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；Axygen聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）清洁试剂盒：康宁生命科学吴江有限公司；10×PCR buffer、2.5 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）mix、rTaq酶、Solution I、pMD18-T vector和10×Loadingbuffer：宝生物工程（大连）有限公司；DL 15000 Marker和DL2000Marker：宝日医生物技术（北京）有限公司；引物27F/1495R和M13F（-47）/M13R（-48）：武汉天一辉远生物科技有限公司；草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸标准品（纯度均≥99.99%）：西陇科学股份有限公司；氨基酸混和标准品（各氨基酸浓度均为2.5 μmol/mL，纯度均≥99.5%）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；氨基酸分析仪缓冲液1、缓冲液2、缓冲液5和缓冲液6：英国Biochrom公司。
1.2 仪器与设备
DG250厌氧工作站：英国Don Whitley公司；PTC-100 PCR仪：美国ABI公司；Fluor Chem FC3化学发光凝胶成像系统：美国Protein Simple公司；LC-2K004乐创双门蒸饭车：韩泰电器有限公司；XP07亚力西全自动打浆机：深圳市喜来家具电器有限公司；LRH-150生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；LC-20ADXR高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：日本岛津公司；Biochrom 30+全自动氨基酸分析仪：英国Biochrom公司。
1.3 试验方法
1.3.1 乳酸菌的分离、纯化及保藏
将米酒曲研磨后使用生理盐水倍比稀释后涂布于添加1.0%CaCO3的固体MRS培养基，倒置于30 ℃厌氧工作站中（厌氧条件为85%N2、10%H2及5%CO2）培养2 d。随后选取菌落数在30～300的平皿，挑取形态、大小和颜色各不相同且均具有透明圈的单菌落[18]，采用平板三区划线法划线于MRS固体培养基上，30 ℃厌氧培养2 d。连续划线3次后，挑取单菌落培养于5 mL MRS液体试管中于生化培养箱中30 ℃培养1 d，离心收集菌体后添加30%的甘油冻存于-80 ℃冰箱中备用。
1.3.2 乳酸菌的鉴定
采用CTAB法提取分离得到的疑似乳酸菌的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）[19]，并以提取出的DNA为模板，使用27F/1495R引物进行PCR扩增。PCR扩增体系[20]：10×PCR buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP mix 2 μL、引物各0.5 μL、rTaq酶0.2 μL、DNA模板0.5 μL和超纯水18.8 μL。扩增程序[21]：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸90 s，共循环30 次；最后72 ℃再延伸10 min。对电泳结果良好的PCR产物使用清洁试剂盒清洁，将清洁产物连接至pMD18-T载体再转化到大肠杆菌中，最后将鉴定结果为阳性的克隆子寄往武汉天一辉远有限公司进行测序。将返回的序列于美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上进行基本局部比对搜索工具（basic localalignmentsearch tool，BLAST）比对分析，进而明确其种属分类地位。
1.3.3 乳酸菌发酵糯米汁的制作
糯米淘洗后蒸熟，加入干米质量6 倍的纯水搅拌均匀，70 ℃水浴30 min后放入破壁机中破碎约5 min至糊状，并添加0.5%的耐高温α-淀粉酶加热至90 ℃保温1 h后，降温至60 ℃添加0.3%的糖化酶保温1 h，使用8 层纱布过滤后滤液添加琼脂粉、白砂糖和羧甲基纤维素钠，其与滤液质量比分别为0.04%、5.00%和0.15%，分装与500 mL三角瓶中115 ℃15 min灭菌，冷却至室温后按照107 CFU/mL糯米汁接入乳酸菌，30 ℃发酵48 h，发酵结束后8 000 r/min离心10 min，取滤液备用。
1.3.4 乳酸菌纯种发酵糯米汁氨基酸含量的测定
参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》中的方法对发酵糯米汁进行预处理。使用氨基酸标准品绘制标准曲线后，对发酵糯米汁中氨基酸含量进行定量分析。检测条件：色谱柱为磺酸型阳离子树脂、检测波长为440nm和570nm，温度梯度为38℃、50℃和93℃，流速为35 mL/h，缓冲液1、缓冲液2、缓冲液5和缓冲液6分别洗脱9 min、12 min、20 min和6 min。
1.3.5 乳酸菌纯种发酵糯米汁有机酸含量的测定
将糯米汁两倍稀释于0.01 mol/L磷酸二氢钾流动相中，静置30 min后过0.22 μm滤膜，参照杨成聪等[22]的方法并做适当修改对其有机酸的含量进行绝对定量。测试条件：流动相的pH值为2.7、流速为0.8 mL/min、色谱柱型号为Inertsil ODS-SP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、柱温为25 ℃、检测波长为215 nm、进样体积为20 μL。
1.3.6 统计分析
采用主成分分析（principal component analysis，PCA）对乳酸菌发酵糯米汁的氨基酸与有机酸的代谢特征进行分析；使用BioEdit和MEGA5软件构建系统发育树；使用Origin 8.5软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 米酒曲中乳酸菌的分离鉴定
通过纯培养方式，并以菌落形态为判定标准，本研究共从11个米酒曲样品中分离到20 株过氧化氢为阴性的疑似乳酸菌菌株，记为HBUAS53361～HBUAS53364、HBUAS53366～HBUAS53370、HBUAS53373～HBUAS53377、HBUAS53379～HBUAS53380和HBUAS53431～HBUAS53434（HBUAS为湖北文理学院英文名称首字母缩写），部分分离株的菌落形态如图1所示。
图1 部分疑似乳酸菌分离株菌落形态
Fig.1 Colony morphology of some suspected lactic acid bacteria isolates
由图1可知，在含有1.0%碳酸钙的MRS培养基中，菌落均形成了透明圈，究其原因可能在于菌株产生的乳酸与碳酸钙发生了反应，同时由于不同菌株产酸能力存在差异，培养基呈现出的透明程度亦不同。此外，菌落均呈现出中央凸起且周围较规则的圆形、外表湿润、有光泽、大小约在2～3 mm、颜色为白色或米黄色，这些均符合乳酸菌的菌落形态特征[23]，故而将所有菌株初步判定为乳酸菌菌株。在对分离株DNA进行提取和16S rRNA序列全长PCR扩增的基础上，采用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增产物质量进行了初步评价，电泳图如图2所示。
图2 分离菌株PCR扩增产物凝胶电泳图
Fig.2 Gel electrophoresis of PCR amplification products of isolated strains
M为DL 2000 DNA Marker；1～4为分离株HBUAS53361～HBUAS53364；5～9为分离株HBUAS53366～HBUAS53370；10～14为分离株HBUAS53373～HBUAS53377；15～16为分离株HBUAS53379～HBUAS53380；17～20为分离株HBUAS53431～HBUAS53434
由图2可知，PCR扩增产物的碱基长度约在1 500 bp左右，符合乳酸菌16S rRNA序列全长的特征，同时各条带清晰且无明显拖尾现象，说明PCR产物浓度和质量均较高，符合后续实验要求。在对PCR产物进行清洁、连接、转化、挑选阳性克隆子测序后，将拼接好的序列进行比对分析，选取相似度≥99%的序列进行系统发育树构建，结果如图3所示。
图3 基于16S rDNA序列乳酸菌分离菌株的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of isolated lactic acid bacteria based on 16S rDNA sequences
由图3可知，20 个分离株被鉴定为5 个属的7 个种，其中HBUAS53362等7 株菌被鉴定为片球菌属（Pediococcus）的戊糖片球菌（P.pentosaceus），HBUAS53364被鉴定为乳杆菌属（Lactobacillus）的植物乳杆菌（L.plantarum）；HBUAS53380被鉴定为乳杆菌属（Lactobacillus）的戊糖乳杆菌（L.pento sus）；菌株HBUAS53368和HBUAS53376被鉴定为乳球菌属（Lactococcus）的台湾乳球菌（L.taiwanensis）；菌株HBUAS53361被鉴定为魏斯氏菌属（Weissella）的类肠膜魏斯氏菌（W.paramesenteroides）；HBUAS53363等4 株菌被鉴定为魏斯氏菌属（Weissella）的融合魏斯氏菌（W.confuse）；HBUAS53366等4 株菌被鉴定为肠球菌属（Enterococcus）中的屎肠球菌（E.faecium）。由图3亦可知，P.pentosaceus占分离株的35%、W.confusa和E.faecium均占分离株的20%、L.taiwanensis占分离株的10%、其余3 种乳酸菌均占分离株的15%。由此可见，P.pentosaceus为米酒曲中的优势乳酸菌。
在明确分离株种属地位的基础上，本研究使用耐高温α-淀粉酶和糖化酶对糯米进行酶解后接种各分离株纯种发酵，通过解析糯米发酵汁中氨基酸和有机酸代谢的特征，从而对各乳酸菌分离株的发酵特性进行了评价。虽然E.faecium可用于食品加工[24]，但近年来越来越多的研究表明其可能存在一定的安全隐患[25]，故而本研究仅评价了除E.faecium外其余16 株乳酸菌的发酵特性。
2.2 发酵糯米汁中氨基酸种类与含量的分析
采用氨基酸分析仪对糯米汁中氨基酸的种类与含量进行了分析评价，结果如表1所示。
表1 发酵糯米汁中氨基酸种类与含量分析结果
Table 1 Results of the kinds and contents of amino acid in glutinous rice juice mg/L
注：“－”表示未检出。下同。
由表1可知，在发酵糯米汁中仅检测出6 种氨基酸，分别为天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、异亮氨酸和亮氨酸，而在未发酵糯米汁中共检测出10种氨基酸，除上述6 种氨基酸外，还检测出了苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和苏氨酸。由表1亦可知，作为一种用糯米发酵酿制而成的甜黄酒，江苏丹阳封缸酒的氨基酸含量远高于本研究中各分离株制备的发酵糯米汁[26]。导致这种现象的原因可能在于，黄酒的发酵是多菌种参与的过程，其中霉菌具有较强的产蛋白酶能力，而糯米汁的制作仅使用乳酸菌进行纯种发酵，乳酸菌自身蛋白水解能力较差；黄酒制作时使用蒸熟后的糯米进行固态发酵，而本研究将蒸熟后的糯米加水和蛋白酶酶解后进行液态发酵，糯米汁中自身蛋白含量就明显低于前者。此外，酶解后的糯米汁中部分氨基酸被乳酸菌生长利用掉，可能是导致发酵糯米汁中氨基酸种类偏少的原因。
2.3 发酵糯米汁中有机酸种类与含量的分析
基于HPLC技术发酵糯米汁中有机酸种类与含量的分析，以有机酸质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制有机酸标准曲线，得到标准曲线回归方程、相关系数、有机酸含量测定结果如表2所示。
由表2可知，相关系数R2均＞0.99，表明7 种有机酸的标准曲线回归方程均有较高的可信度。未发酵糯米汁中仅检出5种有机酸，有机酸总量为793.75 mg/L，乳酸菌发酵糯米汁中共检出7种有机酸，有机酸总量的范围在1 901.78～16 144.68 mg/L。由此可见，乳酸菌发酵可明显提升糯米汁中有机酸的含量。蒸熟的糯米经α-淀粉酶和糖化酶酶解后，淀粉部分水解为葡萄糖，为乳酸菌的发酵提供了碳源。由表2亦可知，乳酸的含量范围在1 595.11～4 559.03 mg/L，为含量最多且变幅最大的有机酸，这说明不同分离株在糯米汁中的产酸能力不同，此外部分分离株发酵的糯米汁中并不存在酒石酸、苹果酸和乙酸，这可能亦与菌株代谢特性有关。
表2 糯米汁中有机酸种类与含量分析结果
Table 2 Results of the kinds and contents of organic acid in glutinous rice juice
2.4 发酵糯米汁中有机酸的主成分分析
采用PCA对乳酸菌发酵糯米汁中有机酸和氨基酸的代谢特征进行了评价，发酵糯米汁中有机酸与氨基酸的因子载荷图见图4。
由图4可知，7种有机酸可分为2个主成分（principal component，PC），其中PC1由草酸、酒石酸、苹果酸、乙酸和琥珀酸等5个指标构成，其方差贡献率为74.41%；PC2由柠檬酸和乳酸2个指标构成，其方差贡献率为16.93%。由图4亦可知，PC1中5 个指标均在X轴正方向，PC2中2 个指标均在Y轴正方向，故而在因子得分图中位于第一象限的分离株产有机酸的能力相对较强，而位于第三象限的分离株呈现出相反的趋势。基于PC1和PC2的因子得分图如图5所示。
图4 发酵糯米汁中有机酸与氨基酸的因子载荷图
Fig.4 Factor loading diagram of organic acids and amino acids in fermented glutinous rice juice
图5 发酵糯米汁中有机酸与氨基酸的因子得分图
Fig.5 Factor score diagram of organic acids and amino acids in fermented glutinous rice juice
由图5可知，仅有W.confuse HBUAS53367位于第一象限，表明其在发酵糯米汁中产有机酸能力相对较强，而P.pentosaceus HBUAS53362、P.pentosaceus HBUAS53375、P.pentosaceus HBUAS53379、P.pentosaceus HBUAS53432、P.pentosaceus HBUAS53433、W.confuse HBUAS53370和L.taiwanensis HBUAS53368均位于第三象限，表明其产有机酸能力相对较弱。
3 结论
南宁地区米酒曲中乳酸菌具有较高的多样性，且戊糖片球菌（P.pentosaceus）为其中的优势乳酸菌。使用除屎肠球菌外的乳酸菌分离株进行发酵糯米汁制备，发现所有分离株均不产氨基酸，乳酸为发酵糯米汁中主要有机酸，其中融合魏斯氏菌（W.confuse）HBUAS53367产有机酸能力较强，可用于后续进一步研究。
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