硒（selenium）是人体必需的微量元素，参与了人体的抗氧化和免疫等多个生物学代谢过程，对人体健康具有非常重要的意义，缺硒会引起或诱发克山病、骨骼肌坏死、心脑血管等多种疾病[1-2]。人体硒元素主要来源于日常食物，食物中的硒主要来源于土壤，而我国大部分地区土壤都严重缺硒[3-4]，从而造成了我国食物中缺硒状况。另外，我国天然富硒地区土壤中硒的存在形式主要以硒锑矿为主，硒酸盐为辅，硒矿中的硒形态无法被植物直接吸收利用，硒盐由硒矿经过长期淋溶和风化等作用产生，具有剧毒性且分布极不均匀[5]。以往对转化硒微生物的研究主要集中在利用富硒微生物发酵富硒食品领域，且以有机硒为主[6-7]，而近年来微生物纳米硒（selenium nanoparticles，SeNPs）因具有制备简单、毒性低、活性高等优点成为研究热点。
1 纳米硒简介
纳米硒是指通过化学法或微生物法将硒酸盐或亚硒酸盐还原为纳米形态的硒单质。化学法还原生成的纳米硒单质（图1a）稳定性较差，粒径不均一，生物活性较低；而通过微生物法转化的纳米硒（图1b）稳定性较好，颗粒大小较均一，并能够通过微生物在纳米硒表面的包裹修饰，使得所制备的纳米硒性质更稳定，生物活性更高[8-9]。许定[10]利用透射电镜检测发现，微生物纳米硒表面包裹一层有机物（图1c），通过傅里叶红外光谱（图2）发现，微生物纳米硒与化学纳米硒的基团峰明显不同，而与细胞破碎液的基团峰相似，说明微生物纳米硒中存在与细胞破碎液相似的有机物，并通过电泳手段对有机物进行定量分析，确定了微生物转化生成的纳米硒表面有机物为蛋白质、糖类及少量的脂类，且对纳米硒的稳定性起着重要的作用。
图1 微生物纳米硒与化学纳米硒形态比较
Fig.1 Comparison of morphology of microbial nano-selenium and chemical nano-selenium
a：化学纳米硒电镜扫描结果；b：微生物纳米硒电镜扫描结果；c：微生物纳米硒透射电镜结果。
随后，科研人员利用其他检测手段对微生物纳米硒进行了表征。WANG Y T等[11]利用能量色散X射线分析（energy dispersive X-ray，EDX）和动态光散射（dynamic light scattering，DLS）对转化的纳米硒进行表征，发现纳米硒平均直径为（273.8±16.9）nm，产生了1.37 keV、11.22 keV和12.49 keV三个特定的硒吸收峰值；刘红芳等[9，12]利用光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）对微生物产生的纳米硒进行分析发现，纳米硒颗粒表面存在零价硒（Se0）和负二价硒（Se2-）两种形态，这也说明了微生物纳米硒颗粒表面存在含硒蛋白或多糖的可能性。
图2 微生物纳米硒、化学纳米硒和细胞破碎液的傅里叶变换红外光谱图
Fig.2 Fourier transform infrared spectroscopy of microbial nanoselenium,chemical nano-selenium and cell breaking fluid
微生物纳米硒的活性和安全性也是近几年研究的重点[13]，根据急性毒性数据显示，无机硒的半数致死量（half lethal dose，LD50）为15 mg/kg，有机硒的LD50为30～40 mg/kg，微生物纳米硒的LD50为113 mg/kg，由此可见，微生物纳米硒的急性毒性是所有硒源中最低的[14]。而在慢性毒性方面，通过给小鼠饲喂不同形态的硒发现，微生物纳米硒的毒性也是最低的[15]，现在市场上也出现了与纳米硒相关的具有保健功能的产品，如“硒旺胶囊”，其主要功效成分为纳米硒。
2 可转化纳米硒的微生物种类
纳米硒和其他纳米材料一样，最初是通过各种化学方法合成的，然而，该方法成本较高、副产品有毒，从而推动了纳米硒转化新方法的研究[16]。近年来的研究发现，有些微生物可以转化有毒的金属离子为毒性较小的形态，包括金属沉淀剂或纳米级单质。基于这一特点，研究人员把重点放在利用微生物方法转化纳米硒上[17-18]。
现已发现多种能够用于纳米硒转化的细菌，主要包括变形菌门中的大肠杆菌（Escherichia coli）[19]、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）[20]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[21]、克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）[22]、伯克霍尔德菌（Burkholderia sp.）[23]等；厚壁菌门中的乳杆菌（Lactobacillus）[24]、葡萄球菌（Staphylococcus）[25]、芽孢杆菌（Bacillus sp.）[18]等；放线菌门中的链霉菌（Streptomyce sp.）[26]和双歧杆菌（Bifidobacterium）[27]等以及蓝藻门的节旋藻（Artrospira）[28]。
合成纳米硒真菌的研究主要集中于酵母，JIMENEZLAMANA J等[29]研究了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在富硒培养基中转化纳米硒的特征及影响条件，获得了良好的纳米硒转化效果；HARILAKRISHNAN H等[30]也利用酵母转化获得了直径为30～100 nm的纳米硒颗粒[30]。除酵母外，转化纳米硒的真菌还有担子菌、子囊真菌和曲霉菌等。如平菇（Pleurotus ostreatus）、黑曲霉（Aspergillus niger）和绿色木霉（Trichoderma viride）在含有硒的平板培养基上生长时，会在真菌菌丝上转化生成可见的单质硒[31]。
3 微生物转化纳米硒机制研究
目前，虽然已发现了许多以硒酸盐为原料，能够转化生成纳米硒的微生物，但由于各种微生物代谢的差异，对硒的转化也存在不同的路径和条件，但总体是通过还原性生物酶的作用将硒酸盐或亚硒酸盐逐步还原生成零价纳米硒的过程。微生物还原硒酸盐生成纳米硒的机制见图3[32-34]。无氧条件下，革兰氏阴性菌可以通过硒酸根离子作为电子受体进行呼吸作用，首先，硒酸根离子进入细胞周质空间，在硒酸盐还原酶ABC（selenate reductase ABC，SerABC）的作用下生成亚硒酸根离子，然后进入细胞膜内，在亚硒酸盐非特异性还原酶的作用下将亚硒酸根还原成纳米硒颗粒，最后通过外泌排到体外[32-33]。而在有氧的条件下，有些菌株对硒酸盐的还原是通过硫酸盐代谢途径进行的，且同时存在同化还原和异化还原，这与酵母类似。在酵母菌中，在低浓度的硒酸盐下，并不还原产生纳米硒，而是产生负二价硒（Se2-），负二价硒（Se2-）不稳定，容易与蛋白或多糖结合，由此生成硒蛋白或硒多糖。在较高硒酸盐浓度下，酵母菌除产生负二价硒（Se2-）外，还会在细胞周质空间还原产生一定量的纳米硒[34]。
图3 微生物还原硒酸盐生成纳米硒的机制
Fig.3 Formation mechanism of nano-selenium by microorganism reduction selenate
由硒酸盐还原成亚硒酸盐的机制已研究的较为透彻，但由亚硒酸盐还原成纳米硒单质的分子机制还未完全阐明，但目前根据先前的研究，有人提出了亚硒酸盐还原为硒单质的5种不同机制的假设[35]，见图4。大部分研究认为，硫酸盐途径中的亚硫酸盐还原酶、硝酸盐途径中的亚硝酸盐还原酶和谷胱甘肽还原酶系统是主要的亚硒酸盐还原酶系统，但不同细菌对亚硒酸盐的代谢途径并不同，可能由单一途径或多个途径共同参与亚硒酸的还原。如在荚膜红细菌（Rhodobacter capsulate）中，低浓度的亚硝酸盐会抑制亚硒酸盐的还原，说明亚硒酸盐是通过硝酸盐代谢途径进行还原的；在丛毛单胞菌（Comamonas sp.）中，添加低浓度的硫酸盐会抑制纳米硒的生成，说明亚硒酸盐是通过硫酸盐代谢途径进行还原的；而在深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum）中，可能是多个途径参与了亚硒酸盐的还原[36-37]。
图4 亚硒酸盐在微生物中的还原机制
Fig.4 Reduction mechanism of selenite in microorganisms
4 微生物纳米硒的应用前景
4.1 微生物纳米硒在医学方面的应用
4.1.1 纳米硒的抗氧化性能
纳米硒进入生物体内后可以通过增强体内抗氧化防御体系中的关键抗氧化酶活性来提高机体的抗氧化性能和有效清除自由基的能力。BAI K等[38]通过给小鼠口服壳聚糖包裹的纳米硒发现，纳米硒可以显著增强体内血清和肝脏中的谷胱甘肽过氧化氢酶（glutathione peroxidase，GPx）活性，同时还能增强超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活性，抑制脂质过氧化，减少紫外线对小鼠的损伤。还有研究报道，进入体内的纳米硒可以与蛋白质结合，防止蛋白发生糖基化修饰，从而抑制了活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生[39]。
4.1.2 纳米硒的抗肿瘤性能
已有大量研究表明，缺硒与多种癌症的发生都有一定的关系，缺硒可能会增加癌症的发生率。KONG L等[40]证实了纳米硒能够通过蛋白激酶B/小鼠双微体2/雄激素受体（protein kinase B/mouse double minute 2/androgen receptor，PKB/Mdm2/AR）介导的信号通路引起肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞的继续增殖。基于此，研究人员通过在纳米硒表面添加不同的修饰基团，提高纳米硒的诱导性和靶向性，研发一些相关的纳米硒抗癌药物。ZHANG Y等[41]利用三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）在纳米硒的表面进行修饰，最终获得了新型的抗癌药物SeNPs@ATP，使用该药物后，主要出现了sub-G1细胞群大量累积、磷脂酰丝氨酸暴露、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）断裂、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（polyadenosine diphosphate-ribose polymerase，PARP）以及天冬氨酸激酶被激活等现象，说明SeNPs@ATP确实能够诱导癌细胞的凋亡；FENG Y等[42]分别利用不同性质的氨基酸对纳米硒进行修饰，通过人体乳腺癌细胞模型发现，经过氨基酸修饰的纳米硒均能有效抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖，其中经赖氨酸修饰的纳米硒颗粒Lys-SeNPs效果最好。也有研究发现，利用生物多糖修饰的纳米硒能够有效抑制胶质瘤细胞[43]。
另外，以纳米硒作为载体负载抗肿瘤药物也是纳米硒抗癌药物研发的一种策略。国内已经对RDG肽（由精氨酸Arg、甘氨酸Gly和天冬氨酸Asp所组成的短肽）、阿霉素、叶酸等与纳米硒负载，取得了良好的效果[44-45]。另有研究报道，纳米硒的摄入提高了癌细胞对顺铂药物的敏感性，从而降低癌细胞的耐药性[46]。
4.1.3 纳米硒的免疫学效应
硒能通过促进T淋巴细胞、B淋巴细胞、吞噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞的增殖分化来提高动物的免疫力。有研究表明，在肉鸡饲养中，纳米硒添加量达到0.3 mg/kg时，肉鸡的免疫功能器官指数显著增加[47]；在仔猪日粮中添加0.4～1.0 mg/kg的纳米硒，能够显著提高血清中巨噬细胞的数量、抗体细胞的生成数、NK细胞的数量及免疫球蛋白的数量，且纳米硒添加组的作用效果高于亚硒酸钠和硒代蛋氨酸添加组[48]。
4.2 微生物纳米硒在农业上的应用
农产品中的硒主要来源于土壤，而我国大部分地区都属于缺硒的土壤，微生物纳米硒可以用于缺硒地区土壤的补硒和富硒农作物的栽培，不但能够使作物富硒，而且能够提高作物的生长性能、抗氧化等抗逆性能，保护作物减少病原菌等的入侵。董雍等[49]利用红色纳米硒对水稻和柑橘进行喷洒，生产出了符合标准的安全、有效的富硒大米和富硒柑橘；胡万行等[50]利用纳米硒营养液对马铃薯进行叶面喷施，结果发现，纳米硒能显著促进紫色马铃薯的光合作用和生长发育；白娅男等[51]将纳米硒制成了一种含硒叶面肥，对甘蔗进行叶面喷施，为富硒甘蔗蔗笋的生产提供了一种有效的富硒途径；李利军等[52]在猕猴桃栽培过程中喷施纳米硒微生物菌肥，有效提高了猕猴桃的硒含量，改善了猕猴桃的风味品质。
4.3 微生物纳米硒在动物饲养中的应用
硒是哺乳动物中不可缺少的微量元素之一。饲养动物对硒元素的获得主要靠饲料摄取，纳米硒的毒性低、吸收好，应用性能要好于其他形态硒。适量的硒元素不仅可以提高畜禽动物的生长性能、免疫力、繁殖性能，还能够改善动物的肉品质[53]。申惠敏等[54]以公猪为研究对象，将纳米硒添加到日粮中，可提高公猪的精子活力，同时受精率也相应提高，说明纳米硒是一种非常有价值的饲料添加剂。
5 结论与展望
微生物纳米硒是一种最具应用前景的硒形态，本文从宏观上对微生物纳米硒的微生物种类、转化机制及应用进行了综述，对微生物转化纳米硒有了一个全面的认识。但硒元素的作用机制及其在可持续发展中的应用仍需进一步探讨。另外，微生物纳米硒还有一些问题有待解决，包括硒和纳米硒在不同环境下对陆地生物的作用效果以及无机硒、有机硒和纳米硒对土壤微生物活性的影响。
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