柠檬（Citrus limon（L.）Burm.f.）为芸香科柑橘属植物，又称柠果、洋柠檬、益母果等，不仅含有丰富的柠檬酸，而且含有丰富的营养物质，如类黄酮、维生素C、维生素A、维生素E以及Ca、Fe、Zn等多种微量元素，因而具有极高的营养价值和药用价值[1]。柠檬亦被誉为保健水果，可降低胆固醇、预防高血压、心脏病、心血管硬化、口腔溃疡、坏血病、防止结石[2-4]。用柠檬汁酿造的柠檬酒，不仅可保留柠檬原有的特殊香味，且口感良好、营养丰富[3]。柠檬酒的制作与生产已成为柠檬加工产业的重要途径[5-6]。
目前，国内对柠檬酒的研究主要集中在其发酵工艺的优化[1，4，7-9]、发酵菌株的筛选[5]、降酸工艺[6]和澄清工艺等方面[3]。国外研究主要集中于柠檬的挥发性成分及其生物活性[10-12]以及柠檬的功效[13]等方面。针对柠檬酒的挥发性香味物质的研究极少，并且挥发性物质成分及含量是柠檬酒品质和安全的重要指标之一[14]。
因此，本研究采用定量描述性感官评价法对柠檬发酵酒与蒸馏酒进行感官评定，参照相关国标方法对其主要理化指标（总酸、还原糖、可溶性固形物含量）进行检测，并采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术对其挥发性风味成分进行分析，以期为提高柠檬酒的品质和安全提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品柠檬蒸馏酒和柠檬发酵酒：中国科学院广西植物研究所植物功能物质研究与利用重点实验室。
1.1.2 主要试剂二氯甲烷（色谱纯）、无水硫酸钠、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠、酚酞（指示剂）、盐酸、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司；亚甲蓝（指示剂）：国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖标准品（纯度≥99%）：成都西亚试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
WYA-2S数字阿贝折射仪：上海精密科学仪器有限公司；Agilent7890B-7000C气相色谱质谱仪：美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 柠檬酒感官评价
参考牛云蔚等[15-16]的方法进行感官评价，并进行一定改良。选取10点制，0～9分（0分=没味道，9分=味道最强）。评价小组由10人（5男，5女，年龄在23～30岁之间）组成。评价人员根据相关标准进行培训，分别对柠檬蒸馏酒和发酵酒的4种感官属性（酸、甜、苦、涩）进行评价，每个样品重复评价3次。
1.3.2 柠檬酒理化指标测定
参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的滴定法测定总酸含量；参照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》中的直接滴定法测定还原糖含量；参照GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中的折光计法测定可溶性固形物含量。以上理化指标均重复测定3次。
1.3.3 柠檬酒挥发性成分分析
准确量取100 mL样品置于分液漏斗中，加入等量二氯甲烷，摇匀，萃取，静置分层后，放出下层萃取液，重复萃取3次，合并3次萃取液，用无水硫酸钠除去多余水分，采用浓缩仪浓缩至1 mL后，将其定容至5 mL，并用0.22 μm的有机滤膜过滤，采用GC-MS分析挥发性成分[17]。
气相条件：HP-5MS弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度250 ℃，分流比20∶1，流速1.2 mL/min，进样量1 μL。程序升温：初始60 ℃维持5 min，再以5 ℃/min升至240 ℃保持30 min，后运行260 ℃维持3 min。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度为250 ℃，电子能量为70 eV，溶剂延迟时间3.5 min，全扫描模式。
定性定量分析：使用工作站软件NIST MS进行数据处理，运用NIST 14谱库与样品色谱峰进行比对分析，并结合保留指数（retention index，RI）进行定性分析。采用面积归一化法进行定量分析，确定各挥发性物质的相对含量。
1.3.4 数据处理
所有实验数据均重复测定3次，所得结果用“平均值±标准偏差”表示。实验数据采用Excel和SAS 9.3统计软件进方差分析和差异显著性分析，显著性水平取P＜0.05。
2 结果与分析
2.1 柠檬酒感官评价结果
感官属性（酸、甜、苦、涩）可以较好的解释酒的口感和味道特征。品评人员主要从酸、甜、苦、涩4个属性对柠檬发酵酒和蒸馏酒的感官特征进行描述，结果见表1。由表1可知，柠檬发酵酒中酸味值（5.167分）最高，甜味值（2.267分）最低，苦味值（3.733分）和涩味值（3.567分）居中。而柠檬蒸馏酒中涩味值（5.267分）最高，甜味值（2.633分）最低，苦味值（4.967分）和酸味值（4.067分）居中。两种酒样除涩味存在显著差异外（P＜0.05），其他3种属性均无显著差异（P＞0.05）。这表明这两种酒的口感差别主要是由涩味属性引起的。
表1 柠檬酒感官评定结果
Table 1 Results of sensory evaluation of lemon wine
注：不同小写字母表示各处理组间（同列）差异显著（P＜0.05）。下同。
酒样柠檬发酵酒柠檬蒸馏酒感官评分/分酸甜苦涩5.167±0.487a 4.067±0.325a 2.267±0.191a 2.633±0.112a 3.733±0.213a 4.967±0.261a 3.567±0.167b 5.267±0.333a
2.2 柠檬酒理化指标分析结果
对柠檬发酵酒和柠檬蒸馏酒的总酸含量、还原糖含量及可溶性固形物含量进行测定，结果见表2。由表2可知，柠檬发酵酒中，总酸含量为6.78 mg/mL，可溶性固形物含量为6.07%，还原糖含量0.16 mg/mL，柠檬蒸馏酒中，总酸含量为0.18 mg/mL，可溶性固形物含量为19.3%，还原糖含量0.07 mg/mL。两种酒样在总酸含量、还原糖含量以及可溶性固形物含量具有明显的差异性（P＜0.05）。
表2 柠檬酒的理化指标
Table 2 Physicochemical indicators of lemon wine
酒样 总酸含量/（mg·mL-1）可溶性固形物含量/%柠檬发酵酒柠檬蒸馏酒还原糖含量/（mg·mL-1）6.78±0.004 6a 0.18±0.000 6b 0.16±0.003 1a 0.07±0.000 5b 6.07±0.1155b 19.30±0a
2.3 柠檬酒挥发性风味化合物分析结果
2.3.1 柠檬发酵酒与蒸馏酒挥发性风味化合物种类及相对含量的差异
由表3可知，通过GC-MS联用技术从柠檬发酵酒中共检测出40种挥发性化合物，其中酯类物质种类最高，为20种；其次是醇类和酸类化合物，均为9种；醛类化合物种类最少，仅为2种。4类挥发性化合物的相对含量为酯类（53.63%）＞醇类（27.48%）＞酸类（12.93%）＞醛类（5.96%）。由表4可知，柠檬蒸馏酒中共检出33种挥发性化合物，其中酯类物质种类数量最多（15种），其次为醇类化合物（5种）、酸类化合物（4种）、杂环类（3种）和烷烃类（3种），烯类（2种）和醛类（1种）较少。7类挥发性化合物的相对含量为酯类（48.43%）＞烯类（27.78%）＞醇类（14.74%）＞酸类（4.19%）＞烷烃类（2.71%）＞杂环类（1.86%）＞醛类（0.29%）。两种柠檬酒挥发性化合物中，酯类化合物的种类和相对含量均最高，醛类化合物含量均最低。
表3 柠檬发酵酒中挥发性风味化合物组成及相对含量
Table 3 Components and relative content of volatile flavor compounds in fermented lemon wine
种类 序号保留时间/min 名称 相对含量/%醇类1234567 8 9 5.462 5.985 7.797 10.132 10.503 11.775 16.454 22.752 23.251 3-吲哚乙醇8-甲基-1,8-壬烷二醇异蒲勒醇1,3-丁二醇对羟基苯乙醇苯乙醇α-松油醇1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）环己烷-1,2-二醇3-乙氧基-1-丙醇2.71±0.482 1.79±0.418 4.10±0.268 3.93±0.050 5.00±0.086 5.26±0.062 2.62±0.239 1.51±0.532 0.54±0.026酯类酸类醛类10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 11.566 12.073 12.250 13.337 13.891 14.296 15.600 18.604 20.013 21.898 22.003 22.180 22.639 23.992 24.105 24.185 24.322 25.315 25.699 25.755 20.964 21.117 23.082 23.678 23.750 25.103 25.160 26.021 27.503 20.795 23.895丁二酸二乙酯辛酸乙酯琥珀酸单乙酯正己酸乙酯丙二酸单乙酯4-羟基肉桂酸乙酯癸酸乙酯二苯基乙酸甲酯柠檬酸三乙酯月桂酸乙酯4-氧代-1,7-庚二酸单乙酯马来酸二乙酯(±)-α-乙酸松油酯十四酸乙酯十六酸乙酯十八酸乙酯乙酸异戊酯反油酸乙酯亚油酸乙酯9-十六碳烯酸乙酯4-羟基苯基-甘氨酸7-辛烯酸对羟基肉桂酸4-酮庚乙酸肉豆蔻酸L-苹果酸(S)-(+)-柠苹酸丁酸油酸丙醛二乙基乙缩醛3-乙氧基-4-丙氧基苯甲醛0.40±0.038 21.74±1.064 12.62±1.026 0.80±0.031 0.53±0.083 2.20±0.732 0.31±0.048 0.61±0.065 0.76±0.059 0.69±0.071 0.58±0.067 0.68±0.070 3.33±0.650 0.43±0.079 1.78±0.201 0.68±0.038 0.24±0.021 0.22±0.034 2.02±0.423 3.00±0.385 0.87±0.189 0.22±0.027 0.22±0.038 5.40±0.729 3.14±0.801 0.99±0.050 1.31±0.345 0.38±0.033 0.39±0.042 0.30±0.072 5.66±0.881
表4 柠檬蒸馏酒中挥发性风味化合物组成及相对含量
Table 4 Components and relative content of volatile flavor compounds in distilled lemon spirit
种类序号醇类12345保留时间/min 8.175 8.683 10.132 11.775 16.341名称3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇顺式-2-丁烯-1-醇对羟基苯乙醇苯乙醇α-松油醇相对含量/%0.45±0.029 0.28±0.015 5.02±0.119 8.23±0.082 0.76±0.058
续表
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2.3.2 酯类化合物比较
两种柠檬酒中酯类化合物的相对含量均最高。柠檬发酵酒中酯类化合物有20种（相对含量为53.63%），主要包括辛酸乙酯、琥珀酸单乙酯、α-乙酸松油酯、9-十六碳烯酸乙酯等；柠檬蒸馏酒中酯类化合物有15种（相对含量为48.43%），主要包括辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、月桂酸乙酯、十六酸乙酯等。两种柠檬酒中的酯类化合物均以辛酸乙酯相对含量最高，分别为21.74%和25.14%。辛酸乙酯是具有梨子香味的挥发性化合物[18]。两种柠檬酒的其他成分差异较大，可能是构成二者香味差异的重要原因。
酯类化合物是酒体中最活跃的成分，是果酒整体香气形成的重要组成部分。酯类物质大多赋予果酒水果香气，如辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、柠檬酸三乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯均具有类似水果香味的香气，可使酒变得香醇清甜[18]，是柠檬发酵酒香味的重要来源。
2.3.3 醇类化合物比较
柠檬发酵酒中的醇类物质所占比例仅次于酯类物质，相对含量为27.48%，共检测出9种；而柠檬蒸馏酒中醇类化合物相对含量为14.74%，共检测出5种。醇类化合物是果酒重要的芳香组分，高级醇类物质主要是微生物通过降解代谢途径（Ehrlich代谢机制）和合成代谢途径（Harris代谢机制），通过相应α-酮酸的脱羧作用与加氢还原而实现的[19]。醇类化合物可使果酒香气浓厚丰满，同时也是形成酯类化合物的前体物质，主要呈现清香和青鲜香气[20-21]。两种柠檬酒的醇类物质中的对羟基苯乙醇、苯乙醇相对含量均较高，并均检测出α-松油醇。苯乙醇是酵母菌发酵的特有产物，本身也具有玫瑰香气[21]；α-松油醇有持久的紫丁香香气，对柠檬酒香气的形成具有积极作用[23]。其他醇类化合物，除了异蒲勒醇具有樟脑和薄荷香气外，其余均无明显的香气，但它们也是构成柠檬酒的重要组成成分。
2.3.4 酸类化合物比较
酸类化合物主要是有机酸，其含量的高低对果酒的感官品质有较大影响[24]。柠檬发酵酒中共检测到酸类化合物9种，相对含量为12.93%，主要包括4-酮庚乙酸、肉豆蔻酸、（S）-（+）-柠苹酸、L-苹果酸、4-羟基苯基-甘氨酸、油酸、丁酸、7-辛烯酸、对羟基肉桂酸。柠檬蒸馏酒中共检测到酸类化合物4种，相对含量为4.19%，主要包括正癸酸、肉豆蔻酸、月桂酸、缬草酸。虽然酸类化合物的呈香贡献较小，但可以协调果酒的口感等作用[25]。
2.3.5 其他类化合物比较
柠檬发酵酒和蒸馏酒中醛类物质相对含量分别为5.96%、0.29%，相对含量均最低。柠檬发酵酒中检测到的醛类化合物主要是丙醛二乙基乙缩醛和3-乙氧基-4-丙氧基苯甲醛；柠檬蒸馏酒中检测到的醛类化合物是对甲基苯甲醛。虽然挥发性醛类化合物在柠檬酒中的含量有限，但是也对其香气特征做出了重要的贡献[26]。此外，在柠檬蒸馏酒中检测到烷烃类、烯类和杂环类物质。其中烷烃类物质包括1,1,2,2-四氯乙烷、2,2-二甲基辛烷、2,6,11-三甲基十二烷；烯类物质包括D-柠檬烯、β-石竹烯和3-甲基-6-（1-甲基乙亚基）环己烯；杂环类物质包括1-（7-氧杂双环[4.1.0]庚-1-基）乙酮和3,2',4'-三羟基-4-甲氧基查耳酮。烯类物质在柠檬蒸馏酒中的相对含量仅次于酯类物质，其中D-柠檬烯相对含量为22.15%。D-柠檬烯又称苧烯，是一种环状单萜烯，具有较强的令人愉悦的柠檬样香气但留香时间很短。
3 结论
通过定量描述性感官评价法对柠檬发酵酒和蒸馏酒进行感官评定发现，2种柠檬酒样除涩味存在显著差异外（P＜0.05），其他3种属性均无显著差异（P＞0.05），均以苦、涩、酸味为主，甜味评分最低。通过理化指标检测发现，2种柠檬酒的总酸、还原糖和可溶性固形物含量都具有显著性差异（P＜0.05）。采用GC-MS技术对其挥发性物质组分分析发现，从柠檬发酵酒与蒸馏酒中分别检测出40种、33种挥发性风味物质，且均以酯类物质种类（20种、15种）及相对含量（53.63%、48.43%）最高，与柠檬发酵酒相比，除检测到酯类、醇类、酸类、醛类物质外，柠檬蒸馏酒中还检测到烷烃类、杂环类及烯类物质。
[1]吕蕾，缪园欣，廖明星.柠檬果酒果酒发酵工艺研究[J].食品界，2019（2）：148-149.
[2]董华发，曾晓房，韩珍，等.柠檬休闲制品研发及其展望[J].安徽农业科学，2018，46（13）：30-32.
[3] 郄志民，陈安均，蒲彪.柠檬酒的澄清研究[J].农产品加工（学刊），2007（6）：13-15，18.
[4]韦玉芳，梁敏，费寅.柠檬酒的研制与鸡尾酒的创作[J].南宁职业技术学院学报，2010，15（2）：89-92.
[5]何胥霞.柠檬多肽制备及其多肽酒发酵工艺的研究[D].成都：西华大学，2019.
[6]邓奥宇，关统伟，王鹏昊，等.柠檬果酒两步法快速降酸工艺研究[J].食品工业科技，2017，38（22）：95-99.
[7]梅明鑫.沃尔卡姆柠檬酒酿造工艺研究[D].重庆：西南大学，2018.
[8]邱爱东，刘达玉，唐江，等.柠檬糯米风味果酒生产技术[J].农产品加工，2015（13）：40-42.
[9]张凤琴，朱海良，王肖肖，等.新型果酒饮料的发酵条件研究[J].巢湖学院学报，2014，16（6）：75-79.
[10] HAMDAN D, EL-SHAZLY A. The chemical constituents of Egyptian citrus species.An examination of the volatile oil and light petrolum fraction of rough lemon(Citrus jambahri Lush.)leaf[J].Eur Sci J,2014,10(15):94-115.
[11] HOJJATI M, BARZEGAR H. Chemical composition and biological activities of lemon(Citrus limon)leaf essential oil[J].Nutr Food Sci Res,2017,4(4):15-24.
[12]MARTA KS,SZOPA A,EKIERT H.Citrus limon(lemon)phenomenon-A review of the chemistry,pharmacological properties,applications in the modern pharmaceutical, food, and cosmetics industries, and biotechnological studies[J].Plants,2020,9(1):119.
[13]MAHENDRA P.Lemon:A versatile fruit of multiple uses[J].Agr World,2017,3:52-54.
[14]许春华，肖作兵，牛云蔚，等.电子鼻和电子舌在果酒风味分析中的应用[J].食品与发酵工业，2011，37（3）：163-167.
[15]牛云蔚，张晓鸣，肖作兵，等.樱桃酒感官评价与电子舌感官分析的相关性研究[J].食品工业科技，2012，33（16）：105-107.
[16] CAYUELA J A, PUERTAS B, CANTOS-VILLAR E. Assessing wine sensory attributes using Vis/NIR[J].Eur Food Res Technol,2017,243(6):941-953.
[17]康明丽，潘思轶，范刚，等.柑橘果酒酿造过程中挥发性风味化合物的变化[J].食品科学，2015，36（18）：155-161.
[18]孙子羽，满都拉，陈佳，等.黑枸杞乳清酒发酵工艺优化及挥发性风味物质分析[J].中国酿造，2019，38（11）：54-58.
[19]程军，秦伟帅，赵新节.葡萄酒酿造中高级醇的形成机制与调节[J].中国酿造，2011，30（12）：9-11.
[20]刘璇，赖必辉，毕金峰，等.不同干燥方式芒果脆片香气成分分析[J].食品科学，2013，34（22）：179-184.
[21]刘婷婷，马岩石，李娜，等.全果发酵与果渣发酵对欧李果酒香气特征的影响[J].食品科学，2016，37（12）：99-104.
[22]凌育赵，刘经亮.柿子果酒香气成分的GC/MS 分析[J].现代食品科技，2011，27（12）：1530-1532.
[23]于倩，蒋玉梅，李霁昕，等.霞多丽葡萄、苦水玫瑰及其混合发酵酒的香气比较分析[J].食品工业科技，2012（22）：172-177.
[24]王博.不同酵母对蓝莓酒中有机酸的影响[D].沈阳：沈阳农业大学，2018.
[25]LACHENMEIER D W,HAUPT S,SCHULZ K.Defining maximum levels of higher alcohols in alcoholic beverages and surrogate alcohol products[J].Regul Toxicol Pharm,2008,50(3):313-321.
[26]杨亮，何珺珺，罗楚翔，等.采用GC×GC-TOF-MS 分析酱香型白酒缺陷酒挥发性风味物质[J].中国酿造，2019，38（8）：67-72.