紫米又称“紫珍珠”，米粒细长颜色紫黑，在我国湖南、云南、四川、贵州、陕西等地有少量栽培，是一种珍稀谷类。紫米味甘、性温，《本草纲目》记载紫米有滋阴补肾、健脾暖肝、明目活血、抗癌和预防心脏病等作用[1]。与普通大米相比，紫米含有更为丰富的蛋白质、氨基酸、纤维素、矿物质以及花色苷、黄酮类和酚酸类等生物活性物质，使得紫米越来越受到消费者的青睐[2-6]。
酸奶作为一种以牛奶或乳粉为原料的发酵乳制品，因其营养丰富、风味独特、含有活性乳酸菌，具有调节肠道菌群平衡、促进消化吸收等功能，在市场上广受消费者欢迎，近两年其产销量增长速度均高达40%以上。随着“健康中国2030”国民营养计划的开启，消费者的营养健康意识不断增强，具有功能性的谷物酸奶的研究开发逐渐成为热点[7-8]。目前关于紫米酸奶的研究报道比较少，付亮等[9]以西瓜汁和紫米浆为主要原料研制复合酸奶，通过正交试验确定了最佳配方。
本试验将紫米炒制、磨粉后加入牛奶中，经乳酸菌发酵制成一种营养丰富，风味独特的功能性谷物酸奶，并对其工艺条件进行优化，研究紫米酸奶在贮藏过程中品质的变化及对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除率，为紫米深加工探索新途径，进一步丰富市场酸奶种类，具有重要的经济效益和现实意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料和菌株
鲜牛奶、白砂糖：市售；紫米：产自云南省墨江哈尼族自治区；保加利亚乳杆菌（Lactobncillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：运城职业技术学院微生物实验室。
1.1.2 化学试剂
氢氧化钠、无水乙醇：广东光华化学厂有限公司；氯化钠、硼酸、硫酸铜、硫酸钾：国药集团化学试剂有限公司；盐酸、硫酸、无水乙醚、石油醚：天津市大茂化学试剂厂；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美国Sigma公司；碘、氨水：南京化学试剂股份有限公司；试验所用化学试剂均为分析纯。
1.1.3 培养基
MC培养基：大豆蛋白胨5.0 g，牛肉粉3.0 g，酵母粉3.0 g，葡萄糖20.0 g，乳糖20.0 g，碳酸钙10.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，1%中性红溶液5.0 mL。
MRS培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，七水合磷酸氢二钾2.0 g，三水醋酸钠5.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，七水硫酸镁0.2 g，四水硫酸锰0.05 g，琼脂粉15.0 g，蒸馏水1 000 mL。
以上培养基在121 ℃高压灭菌15～20 min。
煌绿乳糖胆盐肉汤（brilliant green lactose bile broth，BGLB）培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile agar，VRBA）培养基：北京奥博星生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
1/10000g220gCPA224S电子分析天平：德国赛多利斯有限公司；FW100高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；SW-CJ-2D超净工作台：苏州净化设备有限公司；LDZX-50KBS高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；GNP-9160隔水式电热恒温培养箱、DHG-9203A电热恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；PB-10 pH计：德国赛多利斯有限公司；TGL-16G高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；GYB40-10S高压均质机：上海东华试验仪器设备有限公司；722N-分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 紫米酸奶加工工艺流程及操作要点
紫米粉的制备：选取颗粒饱满，无虫害的紫米，淘洗一次，沥干后，采用炒制机对紫米进行翻炒，再用高速万能粉碎机进行粉碎，并过100目筛，得到熟紫米粉[10]。
鲜牛奶检验：按照GB 19301—2010《食品安全国家标准生乳》要求的方法对鲜牛乳的蛋白质、脂肪、杂质度、非脂乳固体、微生物等指标进行检验，检验结果均符合国标要求的鲜牛奶可作为原料乳。
混合、均质、灭菌：将紫米粉加入检验合格的鲜牛奶中，高速搅拌机混合均匀，在65 ℃、20 MPa条件下均质3 min，95 ℃灭菌15 min，得紫米鲜牛奶混合液。
接种、灌装、发酵：将灭菌的混合液冷却至42 ℃，加入菌种（保加利亚杆菌∶嗜热链球菌=1∶1），灌装，密封，放入42 ℃的培养箱内发酵4～6 h，待达到凝固状态，酸度达到70°T时停止发酵[11-13]。
后熟：将发酵完毕的酸奶在4 ℃条件下冷藏24 h，得到紫米酸奶成品。
1.3.2 紫米酸奶的工艺优化试验
单因素试验：以滴定酸度，持水力和感官评分为评价指标，研究紫米粉添加量、白砂糖添加量和接种量在不同水平上对紫米酸奶品质的影响，确定每项因素的最优值。设定白砂糖添加量为7%，接种量为0.05%，将紫米粉添加量设定为0、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L，考察紫米粉添加量对酸奶品质的影响；设定接种量为0.05%，紫米粉添加量为20 g/L，将白砂糖添加量水平设定为5%、6%、7%、8%、9%、10%，考察白砂糖添加量对酸奶品质的影响；设定紫米粉添加量为20 g/L，白砂糖添加量为7%，将接种量水平设定为0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%，考察接种量对酸奶品质的影响。
响应面试验：在单因素试验的基础上，以紫米粉添加量（A）、白砂糖添加量（B）、接种量（C）3个因素为试验因素，酸奶的感官评分（Y）为响应值，采用Box-Behnken设计对紫米酸奶的工艺进行优化，Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
水平 A 紫米粉添加量/（g·L-1） B 白砂糖添加量/% C 接种量/%1 2 3 10 20 30 6 7 8 0.04 0.05 0.06
1.3.3 紫米酸奶的贮藏品质测定
在最优工艺条件下制备紫米酸奶，以不添加紫米的酸奶为对照，对酸奶进行感官评价及酸度、pH值、持水力、乳酸菌总数和DPPH自由基清除率测定，并测定紫米酸奶在0～4℃条件下贮藏0d、1d、5d、9d、13d、17d、21d的贮藏品质。
1.3.4 分析检测
（1）感官评价
邀请10名专业的品评人员对紫米酸奶进行感官评价，感官评价从色泽、组织状态、气味和滋味4个方面进行，满分100分，结果以平均值计，紫米酸奶感官评分标准见表2。
表2 紫米酸奶感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of purple rice yogurt
感官指标 评分标准 分数/分色泽（20分）组织状态（30分）呈乳白色略带紫色，颜色均匀，无杂质呈乳白色略带紫色，颜色不均匀，无杂质呈深紫色或乳白色，颜色不均匀，无杂质呈紫黑色，颜色不均匀，有杂质组织细腻，适口，无气泡，无乳清析出组织细腻，适口，无气泡，有少量乳清析出组织粗糙，不均匀，有明显乳清析出组织粗糙，有大量气泡，分层，乳清析出严重18～20 12～17 8～11 1～7 25～30 18～24 10～17 1～9
续表
感官指标 评分标准 分数/分气味（20分）滋味（30分）具有酸奶和紫米香味发酵乳香味偏重紫米气味过重，掩盖酸奶的香味有异常气味酸甜适宜，口感爽滑偏甜，口感一般偏酸，口感一般霉味或酸味，口感粗糙18～20 12～17 8～11 1～7 25～30 18～24 10～17 1～9
（2）理化指标测定
根据GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》中的指标要求，对酸奶中的脂肪含量、非脂乳固体含量、蛋白质含量和酸度分别依据：GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》、GB5413.39—2010《乳和乳制品中非脂乳固体的测定》、GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》和GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》进行测定；pH值测定：参照GB 5009.237—2016《食品pH值的测定》；持水力测定：参考麻泽宇等[14]的方法进行测定。
（3）微生物指标测定
乳酸菌总数测定：按照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》分别计数嗜热链球菌数和保加利亚杆菌数，两者之和即为乳酸菌总数。大肠菌群：按照GB4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》中的平板计数法进行测定。致病菌按照GB 4789.10—2016《食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》和GB 4789.4—2016《食品微生物学检验沙门氏菌检验》中的方法进行测定。
（4）DPPH自由基清除率测定
参考胡锦涛等[15-18]的方法对紫米酸奶的DPPH自由基清除率进行测定。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 紫米粉添加量对紫米酸奶品质的影响
表3 紫米粉添加量对紫米酸奶品质的影响
Table 3 Effect of purple rice flour addition on purple rice yogurt quality
紫米粉添加量/（g·L-1） 酸度/°T 持水力/% 感官评分/分0 10 20 30 40 50 76.2±0.32 78.2±0.23 81.2±0.10 83.3±0.34 84.3±0.54 86.2±0.32 85.35±0.89 89.23±0.78 92.32±0.83 94.72±0.70 95.58±0.99 96.59±0.93 80.2±1.25 83.1±1.14 89.7±1.27 85.5±1.02 82.8±1.08 79.7±1.49
由表3可知，紫米酸奶的酸度、持水力和感官评分随着紫米粉添加量的增加，出现不同的变化。其中紫米酸奶的酸度随着紫米粉添加量的增加而升高，这可能是因为紫米粉中的低聚糖等成分也可作为发酵基质，促进了乳酸菌产酸量的增加；紫米酸奶的持水力随着紫米粉添加量的增加而升高，这主要是因为紫米淀粉的吸水性较强，表现为酸奶的持水力逐渐升高；紫米酸奶的感官评分随着紫米粉添加量的增加表现出先升高后降低的趋势，当紫米粉添加量达到20 g/L时，酸奶呈乳白色略带紫色，既有发酵乳的香味又有紫米香味，组织细腻无乳清析出，当紫米粉添加量＞20 g/L时，酸奶紫米气味过重、掩盖酸奶的香味、组织粗糙且紫米淀粉经过糊化冷却后，导致酸奶凝乳不佳出现分层。因此，紫米粉添加量20 g/L为宜。
2.1.2 白砂糖添加量对紫米酸奶品质的影响
表4 白砂糖添加量对紫米酸奶品质的影响
Table 4 Effect of sucrose addition on purple rice yogurt quality
白砂糖添加量/% 酸度/°T 持水力/% 感官评分/分5 6 7 8 9 1 0 77.9±0.25 79.3±0.40 81.7±0.75 83.2±0.47 85.1±0.22 87.4±0.36 86.23±0.85 91.84±0.90 95.38±0.77 92.79±0.86 91.71±0.62 89.63±0.83 82.8±0.75 86.2±0.98 90.3±0.90 86.2±1.25 83.9±0.94 81.6±1.43
由表4可知，随着白砂糖添加量的增加，酸奶的酸度呈现逐渐升高的趋势，这是由于白砂糖含量的增加为乳酸菌的生长提供了充足的碳源，促进了乳酸菌的产酸从而导致酸度增大。随着白砂糖添加量的增加，酸奶的持水力呈现先升高后降低的趋势，在白砂糖添加量达到7%时，酸奶的持水力达到最高。酸奶的感官评分随着白砂糖添加量的增加呈现先升高后降低的趋势，在白砂糖添加量达到7%时，酸奶的感官评分达到最高，此时产品酸甜可口，口味最佳。当白砂糖添加量＞7%，酸奶口感偏甜，感官评分下降。因此，白砂糖添加量7%为宜。
2.1.3 接种量对紫米酸奶品质的影响
表5 接种量对紫米酸奶品质的影响
Table 5 Effect of inoculum on purple rice yogurt quality
接种量/% 酸度/°T 持水力/% 感官评分/分0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 76.2±0.46 80.5±0.20 82.4±0.38 84.3±0.54 87.2±0.55 89.3±0.33 81.08±0.94 86.08±0.74 95.87±0.29 93.24±0.48 90.72±0.58 89.32±0.69 80.5±0.92 85.1±0.70 90.1±1.14 89.5±0.81 85.7±0.90 83.0±1.10
由表5可知，当接种量＜0.05%时，制作的酸奶产酸量少，持水力差，凝乳状态不佳，酸奶组织不细腻，乳清析出较多，酸奶感官评分不高。当接种量达到0.05%时，乳酸菌产酸量增加，此时制作的酸奶酸度升高，酸奶凝固状态良好，持水力增加，组织细腻，感官评分最高。当接种量＞0.05%时，随着接种量的增加，乳酸菌产酸过多，口感偏酸，酸奶凝乳过度，导致乳清析出，持水力和感官评分均下降。因此，接种量0.05%为宜。
2.2 响应面优化试验结果
选取紫米粉添加量（A）、白砂糖添加量（B）、接种量（C）3个因素为自变量，酸奶的感官评分（Y）为响应值，依据Box-Behnken中心组合设计原理，对紫米酸奶的发酵工艺进行优化。利用Design-Expert V8.0.6 软件，对试验结果进行多元二次拟合分析以及方差分析，Box-Behnken试验设计结果见表6，方差分析见表7。
表6 Box-Behnken试验设计结果
Table 6 Results of Box-Behnken experiments design
试验号 A B C Y 感官评分/分1234567891 0-1 1-1 1-1 1-1-1-1 110000-0000-1-1 11-1-1 11 12 13 14 15 16 17 1000000000 11-1100000 1100000 82.3 84.6 85.8 87.3 84.8 86.1 85.4 88.7 83.9 86.2 85.7 89.5 89.7 90.5 89.1 89.8 91.2
利用Design-Expert V8.0.6软件，对表6结果进行多元二次拟合分析，得回归方程：Y=90.06+1.05A+1.54B+1.04C-0.20AB+0.50AC+0.38BC-2.57A2-2.49B2-1.24C2。
表7 回归模型方差分析
Table 7 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
变异源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性模型ABCA B********AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和104.8 8.82 18.91 8.61 0.61 1.00 0.56 27.76 26.16 6.50 3.14 0.53 2.61 107.95 91111111117341 6 11.64 8.82 18.91 8.61 0.16 1.00 0.56 27.76 26.16 6.50 0.45 0.18 0.65 25.92 19.63 42.10 19.17 0.36 2.23 1.25 61.79 58.23 14.47 0.000 1 0.003 0 0.000 3 0.003 2 0.569 4 0.179 3 0.300 1 0.000 1 0.000 1 0.006 7******0.27 0.843 5
由表7可知，酸奶工艺优化回归模型（P值=0.0001＜0.01），模型极显著，失拟项（P值=0.843 5＞0.05）不显著，表示试验操作误差很小，其决定系数为R2=0.970 9，说明该模型是拟合良好的模型，可以用于紫米酸奶的工艺优化。分析各因素的F值和P值可知，一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2对紫米酸奶感官评分影响均极显著（P＜0.01）。对A、B、C三个因素影响程度分析可知：B＞A＞C，即白砂糖添加量＞紫米粉添加量＞接种量。
2.2.1 响应面曲面分析
紫米粉添加量、白砂糖添加量和接种量三个因素之间的交互作用的响应面及等高线见图1。由图1可知，3个响应面图都是开口向下的，说明紫米酸奶感官评分在试验设计的范围内存在最大值。根据Design-Expert V8.0.6软件分析得出紫米酸奶的最佳配方工艺为紫米粉添加量22 g/L，白砂糖添加量7%，接种量0.06%。在此优化条件下，紫米酸奶的感官评分预测值为90.7分。
图1 紫米粉添加量、白砂糖添加量和接种量交互作用对紫米酸奶感官品质影响的响应面及等高线
Fig. 1 Response surface plots and contour lines of the interaction between purple rice power addition, sugar addition and inoculum on sensory quality of purple rice yogurt
2.2.2 紫米酸奶工艺配方优化验证试验
在紫米粉添加量22 g/L，白砂糖添加量7%，接种量0.06%的工艺条件下进行验证试验，进行3次平行试验取平均值得到感官评分实际值为91.1分，真实值与回归模型预测值之间的偏差是0.4%（＜1%），说明此模型良好。
2.2.3 紫米酸奶品质分析
按照GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》中的指标要求对最佳工艺制作的紫米酸奶的脂肪、非脂乳固体、蛋白质、酸度、乳酸菌总数、大肠菌群和致病菌进行检测，结果见表8。
表8 紫米酸奶理化及微生物指标检测结果
Table 8 Determination results of physicochemical and microbial indicators of purple rice yogurt
测定指标 紫米酸奶 GB 19302—2010要求脂肪/%非脂乳固体/%蛋白质/%酸度/°T乳酸菌总数/（CFU·g-1）大肠菌群/（MPN·g-1）致病菌/（CFU·g-1）3.02±0.16 15.65±0.14 3.26±0.23 78.2±0.37（9.13±0.21）×108未检出未检出≥2.5-≥2.3≥70≥1×106≤5不得检出
由表8可知，紫米酸奶的理化及微生物指标均满足国标GB 19302—2010要求，表明用最佳工艺制作的紫米酸奶营养丰富、品质良好。
2.3 紫米酸奶的贮藏品质
由图2a～图2d可知，在贮藏期间紫米酸奶和对照酸奶的感官评分和持水力均随着贮藏时间的延长而下降，而紫米酸奶的感官评分和持水力均高于对照酸奶。在pH值和酸度两个指标方面，紫米酸奶的pH值高于对照酸奶，随着贮藏时间的延长pH值均呈下降趋势；紫米酸奶的酸度低于对照酸奶，随着贮藏时间的延长均呈上升的趋势。由图2e可知，紫米酸奶的乳酸菌总数在贮藏期间一直高于对照酸奶，均呈现先升高后下降的趋势，且均在贮藏13 d时达到最大值。说明紫米粉能促进乳酸菌的增殖，紫米酸奶的贮藏品质优于对照酸奶。由图2f可知，紫米酸奶对DPPH自由基清除率高于对照酸奶，且两者均随着贮藏时间的延长而呈现上升的趋势。这是因为酸奶在发酵过程中产生的多肽、氨基酸具有一定的抗氧化能力[19]，而紫米中的花色苷、黄酮类和酚酸类生理活性物质具有较强的抗氧化能力[20-21]，因此紫米粉的添加可以增加酸奶的DPPH自由基清除率。在酸奶贮藏期间，随着发酵的进行，酸奶中的抗氧化成分不断增加，使得两种酸奶对DPPH自由基清除能力不断增强。
图2 紫米酸奶贮藏期间品质变化
Fig. 2 Changes of purple rice yogurt quality during storage
3 结论
在单因素试验基础上，响应面法得到紫米酸奶最优的工艺为紫米粉添加量为22 g/L，白砂糖添加量为7%，接种量为0.06%。在此工艺条件下，紫米酸奶的感官评分为91.1分，与理论预测值90.7分比较接近，表明该模型拟合程度较好。紫米酸奶品质分析结果显示，紫米酸奶的各项品质指标均符合国标要求。在贮藏期间，紫米酸奶的感官评分、持水力、pH、酸度、乳酸菌总数均优于对照酸奶，且紫米酸奶的DPPH自由基清除率明显高于对照酸奶。紫米酸奶是一款贮藏品质稳定，具有更长的货架期和较强抗氧化能力的谷物酸奶。
[1]杨加珍，曾亚文，杜娟，等.紫黑米种质功能成分综合研究与利用[J].生物技术进展，2015，5（1）：47-53.
[2]梁征，熊思慧，郭莹，等.紫米蛋白-多酚复合物的结构组成及分子形貌[J].食品科学，2016，37（21）：85-90.
[3]魏银花，申迎宾，王立，等.紫米多酚提取工艺及抗氧化活性研究[J].食品与机械，2013，29（3）：111-115.
[4]王旭，王丹生，王鹏，等.紫米色素的提取及稳定性研究[J].辽东学院学报（自然科学版），2012，19（1）：5-8.
[5]杨宁，熊思慧，何静仁，等.紫米营养功能成分及其游离态与结合态组成的HPLC/LC-MS 分析[J].食品与机械，2017，33（4）：27-32.
[6]ABDEL-AAL E S M,YOUNG J C,RABALSKI I.Anthocyanin composition in black,blue,pink,purple,and red cereal grains[J]. J Agr Food Chem,2006,54(13):4696-4704.
[7]杨淑妮，李理.全谷物酸奶的理化及功能特性研究[J].中国乳品工业，2016，305（4）：18-21.
[8]张小芳，孙艳，刘玉青，等.红豆酸奶配方工艺优化研究[J].食品研究与开发，2019，40（1）：144-149.
[9]付亮，刘诗扬，徐方旭.西瓜和紫米复合酸奶的研制[J].沈阳师范大学学报（自然科学版），2015，33（2）：310-314.
[10]赵延胜，王琪嫄，吴飞，等.响应面优化大麦酸奶工艺及其品质分析研究[J].中国乳品工业，2017，45（10）：42-46.
[11]中华人民共和国卫生部.GB 193029—2010 食品安全国家标准发酵乳[S].北京：中国标准出版社，2010.
[12]熊政委，王文佳，温瑞，等.响应面法优化菊糖酸奶的发酵工艺[J].食品科学，2014，35（13）：156-160.
[13]郭俊花，许先猛，成少宁，等.槐米酸奶加工工艺及DPPH 自由基清除能力研究[J].中国酿造，2016，35（6）：187-191.
[14]麻泽宇，吴峰华，何志平，等.响应面法优化黄秋葵酸奶发酵工艺[J].北方园艺，2019（6）：129-135.
[15]胡锦涛，孔芳，邹木法，等.浆果果渣对酸奶品质和抗氧化性的影响[J].现代食品科技，2018，34（11）：176-184.
[16]叶玉娥.大豆酸奶、葡萄多酚酸奶的制备及抗氧化活性的研究[D].合肥：合肥工业大学，2012.
[17]康凌宇，李超，汤薇.蓝莓核桃酸乳的配方优化及其抗氧化活性[J].食品科技，2018，43（12）：83-87.
[18]王然，张春玉，贾燕妮.酸浆果蜂蜜酸奶发酵及贮藏过程中抗氧化活性的变化研究[J].中国酿造，2019，38（1）：165-170.
[19]FARVIN K H S,BARON C P,NIELSEN N S,et al.Antioxidant activity of yoghurt peptides:Part 2-Characterisation of peptide fractions[J].Food Chem,2010,123(4):1090-1097.
[20]孙田垒.墨江紫米抗氧化能力及六种紫色食品协同抗氧化特性研究[D].泰安：山东农业大学，2014.
[21] ACQUAVIVA R, RUSSO A, GALVANO F. Cyanidin and cyanidin 3-O-β-D-glucoside as DNA cleavage protectors and antioxidants[J].Cell Biol Toxicol,2003,19(4):243-252.