乳酸菌是一类能够发酵碳水化合物并且产生乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌[1]。近年来，大量的研究都证实了乳酸菌具有益生特性，特别是在改善人体肠道微环境方面发挥重要作用[2-3]。食品加工过程中，特别是诸如传统发酵香肠、发酵酸鱼、火腿、酱油、奶酪、泡菜等发酵食品的制备过程中往往会加入大量的食用盐，赋予产品风味和抑制杂菌的同时延长食品的保质期[4-6]，但高浓度的盐在一定程度上会抑制发酵过程中乳酸菌的生长，盐胁迫会损伤细胞膜结构，进而导致胞内各种代谢紊乱甚至细胞死亡[7-8]，但是最近的研究显示，盐胁迫具有提高鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）的富硒能力的作用[9]。
新疆拥有牧草地面积约0.511亿km2，是我国重要的畜牧业大省[10]，其中伊犁牧区是新疆最主要的畜牧业基地之一。新疆少数民族有收集动物乳制作发酵奶制品的传统，从牧区奶制品和环境中挖掘菌种资源并加以保护成为一项重要工作[11-12]，蒋艾廷等[13]从新疆塔城传统酸奶中筛选出具有优良产酸性能的30株乳酸菌，并对其自溶度和蛋白酶活力进行了研究；金丹等[14]从新疆塔城地区酸马奶中分离了53株乳酸菌，并筛选出5株能耐受13%乙醇的乳酸菌；张亚川等[15]从新疆伊犁州乳品中初步分离纯化出71株乳酸菌，并从中筛选出3株符合酸乳发酵菌种要求的德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）。目前研究主要集中于乳酸菌的生理特性、生理学功能及其在工业中的应用，对高渗情况下乳酸菌发酵性能的研究较少，而乳酸菌发酵剂的生产性能（包括产香性、产粘性、产酸性）和抗逆性（耐酸耐胆盐能力）直接关系到最终发酵制品的性能，同时也是影响产品质量的一个因素。
本研究利用传统分离技术从新疆牧区土壤中筛选耐盐乳酸菌，通过形态观察及分子生物学技术对其进行鉴定，并对其发酵特性，特别是在高渗环境下（7%、8%NaCl）的发酵性能（耐酸耐胆盐能力）进行研究，以期获得发酵性能好和抗逆性强的优良发酵乳酸菌菌株，为高盐发酵食品的商业发酵剂开发提供研究基础，确保发酵乳等制品有一定的活菌数，食用后能在肠道中定植。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品
土样来源于新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州额敏县牧区，具体信息见表1。
表1 土样来源
Table 1 Source of soil samples
土样编号 来源1 2 3 4天山牧场牧一村11号样撒花海9号样八连沟9号样阿克塔斯12号样
1.1.2 试剂
无水乙醇（纯度≥99.7%）：天津市富宇精细化工有限公司；细菌基因组总脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：北京天根生化科技有限公司；猪胆盐（纯度≥90%）：上海麦克林生化科技有限公司；革兰氏染液：北京索莱宝生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
MRS液（固）体培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。含碳酸钙的MRS（CaCO3-MRS）固体培养基：MRS固体培养基中添加1.5%的碳酸钙。
1.2 仪器与设备
TC-512聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪：英国Techne公司；T100 Power Pac Universal电泳仪、Universal Hood ⅡGel DOC XR凝胶成像系统：美国BioRad公司；CX21FS1光学显微镜：日本Olympus公司；LAC-5040S标准型pH计：上海精密科学仪器有限公司；Bnp-9272智能生化培养箱：上海精宏试验设备有限公司；5424R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；Synergy 2多功能酶标仪：美国BIOTEK仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 乳酸菌的分离
称取1.0 g土壤样品，加入10 mL无菌生理盐水，混匀，静置10 min后取上清液1 mL加至20 mL含有7% NaCl的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养48 h。取菌液在CaCO3-MRS平板上划线，37 ℃培养48 h[16]。挑取溶钙圈较大、革兰氏染色为阳性、接触酶试验为阴性并具有乳酸菌典型形态学特征的菌落，在MRS固体培养基上再次划线分离纯化后斜面保存备用[17]。
1.3.2 筛选耐盐乳酸菌的筛选
将分离纯化得到的乳酸菌菌株进行活化并培养16～18 h后，以2%（V/V）的接种量分别接种至NaCl含量为7%、8%、9%、10%的MRS肉汤培养基中，37 ℃培养24 h，通过培养基浑浊情况的变化筛选出耐盐乳酸菌[18]。
1.3.3 耐盐乳酸菌的分子生物学鉴定
根据DNA提取试剂盒说明书步骤提取目标耐盐乳酸菌菌株的DNA，以其为模板，采用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）对筛选菌株的16S rDNA序列进行PCR扩增。PCR扩增体系：10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）0.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，Taq酶1.25 U，模板2 μL，双蒸水（ddH2O）定容至25 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34个循环；72 ℃再延伸10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物特异性。将电泳检测合格的PCR扩增产物送至上海生工生物有限公司进行测序。将测序基因序列提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对分析，选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA序列，采用软件Mega5.0构建系统发育树。
1.3.4 筛选菌株在高渗环境下的生长曲线和产酸能力
按2%的接种量将活化培养至对数生长末期的菌株分别接种于含7%、8%NaCl的MRS肉汤培养基中，37 ℃恒温培养48 h，每隔2 h取样在波长600 nm条件下测定样品的OD600nm值和pH值，绘制乳酸菌的生长曲线和产酸曲线。
1.3.5 筛选菌株在高渗环境下的耐酸、耐胆盐胁迫能力
耐酸性能的测定：将活化好的筛选菌株按2%的接种量分别接种到含7%、8%NaCl，pH值为3.0、4.6的MRS液体培养基中，37 ℃条件下培养48 h，每隔2 h取样在波长600 nm条件下测定样品的OD600nm值，绘制乳酸菌的生长曲线，并且每隔2 h取样，测定pH值，绘制产酸变化曲线。
耐胆盐性能的测定：将活化好的筛选菌株按2%的接种量分别接到含7%、8% NaCl，0.10%、0.15%胆盐的MRS液体培养基中，37 ℃条件下培养48 h，每隔2 h取样在波长600 nm条件下测定样品的OD600 nm值，绘制乳酸菌的生长曲线，并且每隔2 h取样，测定pH值，绘制产酸变化曲线。
1.3.6 筛选菌株耐盐性能的测定
将培养至对数末期的菌液，按2%的接种量分别接种于含10%和12%NaCl的MRS液体培养基中，37 ℃条件下胁迫3 h后进行涂布于MRS固体培养基，37 ℃培养48 h后进行菌落计数（N），同时对接种液进行菌落计数（N0），计算存活率，其计算公式如下：
2 结果与分析
2.1 耐盐乳酸菌菌株的分离与筛选
从27个土壤样品中共分离纯化得到64株疑似乳酸菌，通过筛选共获得4株耐盐乳酸菌，编号分别为a、b、c、d。4株乳酸菌均能在含8%NaCl的MRS液体培养基中生长，其中菌株c能够在含9%NaCl的MRS液体培养基中生长，在含10%NaCl的MRS液体培养基中4株菌的生长被明显抑制。
2.2 耐盐乳酸菌菌株的鉴定
2.2.1 形态观察
对筛选出的4株耐盐乳酸菌菌株进行形态学观察，结果见图1。
图1 耐盐乳酸菌的菌落形态及细胞形态
Fig. 1 Colony and cell morphology of salt tolerant lactic acid bacteria
由图1可知，在MRS固体培养基上，4株耐盐乳酸菌的菌落均呈乳白色，并且中央隆起具有湿润表面，边缘整齐，呈乳白色，革兰氏染色结果均为阳性，个体微小，周身无鞭毛与芽孢，符合乳酸菌基本特征。
2.2.2 分子生物学鉴定
4株耐盐乳酸菌菌株的系统发育树见图2。
图2 基于16S rDNA基因序列耐盐乳酸菌菌株的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree of salt tolerant lactic acid bacteria based on 16S rDNA gene sequences
由图2可知，菌株a、b、c与海氏肠球菌（Enterococcus hirae）聚于一支，亲缘关系最近；菌株d与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）聚于一支，亲缘关系最近，因此鉴定菌株a、b、c均为为海氏肠球菌（Enterococcus hirae），菌株d为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
2.3 耐盐乳酸菌的发酵特性
2.3.1 耐盐乳酸菌的生长特性
邬慧颖[19]研究盐胁迫响应基因对菌体分裂增殖的影响结果发现，盐胁迫响应基因膜转运体基因feoA的缺失会使迟滞期被延长并影响菌体的分裂增殖。由图3可知，L.plantarumd d在7%NaCl含量下的最终OD600nm值为1.866，而在8% NaCl含量下的最终OD600 nm值为0.760，E. hirae a、b、c在7%NaCl含量下的最终OD600nm值分别为0.898、0.773、0.873，而在8%NaCl含量下的最终OD600 nm值分别为0.105、0.086、0.117，结果表明，随着NaCl含量的增加，各菌株的生长受到了不同程度的抑制，其中L.plantarumd d的生长特性相对于其他三株更好，E.hirae a、b、c差别不大。
图3 在NaCl含量7%（a）及8%（b）条件下耐盐乳酸菌的生长曲线
Fig. 3 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions
2.3.2 耐盐乳酸菌的产酸特性
由图4可知，随着NaCl含量的升高，各菌株的产酸速率明显降低。L.plantarum d在7%NaCl含量下的最终pH值为3.48，在8%NaCl含量下的最终pH值为3.79，E.hirae a、b、c在7%NaCl含量下的最终pH值分别为4.01、4.08、3.97，而在8%NaCl含量下的最终pH值分别为4.99、5.09、4.63，结果表明，随着NaCl含量的增加，各菌株的产酸受到了不同程度的抑制。其中L.plantarumd d的产酸特性相对于其他三株更好，E.hirae a、b、c差别不大。
图4 耐盐乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）条件下的产酸曲线
Fig. 4 Acid production curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions
2.3.3 耐盐乳酸菌的耐酸性能研究
图5 pH3.0时耐盐乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）条件下的生长曲线
Fig. 5 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions at pH 3.0
图6 pH4.6时耐盐乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）条件下的生长曲线
Fig. 6 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions at pH 4.6
图7 pH3.0时耐盐乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）条件下的产酸曲线
Fig. 7 Acid production curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions at pH 3.0
由图5可知，在7%和8%NaCl含量下，E.hirae a、b、c和L.plantarum d在pH 3.0的酸性环境，均未出现明显的生长。结果表明，在pH 3.0的酸性环境，7%和8% NaCl含量下，E.hirae a、b、c和L.plantarum d 生长均受到明显抑制。
由图6可知，在7%和8%NaCl含量下，L.plantarum d比E.hirae a、b、c更适应pH 4.6的酸性环境，出现明显的生长，同时8%NaCl含量使E.hirae a、b、c和L.plantarum d的生长受到抑制。
由图7可知，在7%和8%NaCl含量下，pH 3.0的酸性环境中E.hirae a、b、c和L.plantarum d几乎不产酸，生长受到明显抑制。
图8 pH4.6时耐盐乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）条件下的产酸曲线
Fig. 8 Acid production curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions at pH 4.6
由图8可知，产酸情况的变化也应证了OD600 nm值的变化结果，在7%和8%NaCl含量下，pH 4.6的酸性环境中E.hirae a、b均在24 h开始产酸，但pH下降幅度不大。E.hirae c几乎不产酸，生长受到明显抑制。L.plantarum d在培养2 h后pH值开始迅速降低，36 h后逐渐停止产酸，最终pH值分别下降至3.42和3.56。
结果表明，在7%、8%NaCl胁迫下，L.plantarum d的酸耐受性较好。
2.3.4 耐盐乳酸菌的耐胆盐性能研究
乳酸菌需能够耐受胃液中的强酸与肠道内的高浓度胆盐，并在人体内大量存活才能发挥其益生作用[20]。由图9可知，在0.10%胆盐胁迫下，在7%和8%NaCl含量条件下，E.hirae a、b、c具有较好的胆盐胁迫抗性，且均在培养24 h达到对数生长末期，而L.plantarum d未有明显生长趋势。海氏肠球菌中E.hirae c抗性最好，E.hirae b最差，0.10%的胆盐对L.plantarum d的抑制作用明显。
图9 0.10%胆盐时耐盐乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）条件下的生长曲线
Fig. 9 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions at 0.10% bile salt
图10 0.15%胆盐时耐盐乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）条件下的生长曲线
Fig. 10 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions at 0.15% bile salt
由图10可知，4株菌在0.15%胆盐中的生长趋势与在0.10%胆盐中类似，海氏肠球菌均能生长而植物乳杆菌L.plantarum d未有明显生长趋势，但值得指出的是，E.hirae c在7%NaCl含量下的生长速度和对胆盐的抗性要明显优于E.hirae a和E.hirae b，而在8%NaCl含量下E.hirae c没有表现出类似的优势，这说明在面对胆盐胁迫时，NaCl含量的改变可能会影响到菌株的胁迫抗性。
图11 0.10%胆盐时耐盐乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）条件下的产酸曲线
Fig. 11 Acid production curves of salt-tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions at 0.10% bile salt
由图11可知，在0.10%胆盐的环境中，E.hirae a、b在7%NaCl含量下培养2 h后产生大量有机酸，pH值迅速下降，12 h左右pH值趋于稳定；在8%NaCl含量下，培养10 h左右pH值迅速下降，12～24 h期间，pH值的下降速率明显减小。E.hirae c在7%NaCl含量下，培养6 h左右pH值迅速下降，24 h时产酸停止；在8%NaCl含量下，培养8 h左右pH值迅速下降，24 h左右产酸停止。L.plantarum d在7%和8%NaCl含量下产酸性能均优于海氏肠球菌，但是在8%NaCl含量时，产酸在培养24 h后即停止。
由图12可知，在0.15%胆盐的环境中，7%NaCl含量下，E.hirae a、b在8 h左右pH值开始下降，24 h产酸停止；在8%NaCl含量下，E.hirae a、b、c的产酸曲线几乎相同，12 h开始产酸，pH值迅速下降，24h左右pH值下降减缓。L.plantarum d在7%NaCl含量下，8 h左右pH值迅速下降，与其他3株菌不同的是12 h左右产酸停止，而在8%NaCl含量下，其延滞时间比海氏肠球菌更短。
图12 0.15%胆盐时耐盐乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）条件下的产酸曲线
Fig. 12 Acid production curves of salt-tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions at 0.15% bile salt
结果表明，在7%、8%NaCl胁迫下，E.hirae a、b、c胆盐耐受性较好。
2.4 耐盐乳酸菌的耐盐性能研究
对筛选出的耐盐乳酸菌分别用10%与12%的NaCl胁迫3 h，进一步考察其对NaCl的耐受性，结果见图13。由图13可知，4种耐盐乳酸菌对盐的耐受性差异显著（P＜0.05）。在10%的NaCl含量下，E.hirae a、b、c、L.plantarum d的存活率分别为45.89%、60.69%、47.34%、41.58%；在12%的NaCl含量下，E.hirae a、b、c、L.plantarum d的存活率分别为43.72%、56.13%、39.24%、35.70%。由此可知，E.hirae b对盐的耐受性最好，E.hirae c和E.hirae a次之，L.plantarum d对盐的耐受性最差。
图13 耐盐乳酸菌对盐的耐受性
Fig. 13 Tolerance of salt tolerant lactic acid bacteria to salt
3 结论
从新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州额敏县的土壤样品中分离出64株乳酸菌，从中筛选出4株耐盐乳酸菌（a、b、c及d），通过形态观察及分子生物学技术鉴定菌株a、b及c均为海氏肠球菌（Enterococcus hirae），菌株d为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。在高盐胁迫（7%、8%NaCl）下，L.plantarum d的生长特性、产酸及耐酸性能最好，但耐胆盐能力最差，E.hirae a、b、c的耐胆盐胁迫能力更佳；在10%和12%的NaCl含量下胁迫3 h，4株菌的存活率均能维持在36%以上，其中E.hirae b的耐盐能力最佳，存活率最高。
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