大鲵（Andrias davidianus）俗称娃娃鱼，是我国二级水生野生保护动物名录[1]，是一种名贵药用动物，营养价值高并具有活性功能，大鲵的氨基酸营养价值较甲鱼、鲍鱼、燕窝和鱼翅都高[2]，并具有抗衰老[3]、抗菌[4]、抗疲劳[5]、抗皮肤光老化[6]、增强免疫[7]等保健功效，大鲵肌肉、内脏、骨骼、表皮及分泌物均可入药[8]。贵州属于典型的卡斯特地貌地区，山泉溶洞特多，水质清澈富含矿物质，特别适合娃娃鱼的养殖繁殖，贵州有多个大鲵养殖基地。与野生大鲵相比，贵州人工养殖子二代大鲵的肌肉营养成分与野生大鲵相当[9]。人工养殖大鲵在医疗保健行业的具有潜在应用价值和发展前景[10]。
中国大鲵作为我国重要的功能性食品原料之一，在营养保健食品工业有潜在的应用价值[11]。研究表明，大鲵多肽具有良好的抗氧化活性[12-15]，不同来源的蛋白肽具有解酒或者预防酒精性肝损伤的作用[16-18]，市面上也有动物源肽保健酒产品，如蛇肽酒[19]、甲鱼多肽酒[20]，酱香型白酒为纯粮酿造并具有独特风味的，受到越来越多消费者的喜爱，并且酱香型白酒中的某些风味成分本身就具有生理活性，如抗氧化[21]、抗炎症[22]、抗癌[23]等。
本研究以贵州特色资源养殖大鲵和酱香型白酒为原料，制备抗氧化大鲵肽酱香酒。对酸水解、泡制处理、酶水解三种预处理方法进行比较，选出最佳预处理工艺后，在单因素试验基础上，采用响应面试验对其酶解工艺条件进行优化，筛选抗氧化活性高的最佳酶解工艺条件，为大鲵深加工的研究和应用及酱香保健酒的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大鲵（Andrias davidianus）：贵州正安县鹦鹉镇大鲵养殖基地；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美国Sigma公司；胰蛋白酶（5万U/g）、碱性蛋白酶（20万U/g）、胃蛋白酶（1 200 U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力6 000 U/g）：国药集团化学试剂有限公司；中性蛋白酶（20万U/g）、牛血清蛋白标准品（纯度≥98.0%）、福林酚：合肥博美生物有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
TDL-80-2B离心机：上海安亭科学仪器厂；PHS-3C精密pH计：上海日岛科学仪器有限公司；755紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；Labogene真空冷冻干燥机：上海帝博思生物科技有限公司；DK-98-II水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；ME240E电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TDL-80-2B离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 大鲵肽酱香酒预处理
（1）酸水解法
称取大鲵肉10 g→清洗→剁碎→按料液比1∶4（g∶mL）加2.5%或5.0%盐酸40 mL→100 ℃水解9 h→1 mol/L NaOH中和至pH=7（边搅拌，边缓慢加入）→离心（4 000 r/min）→上清液冷冻干燥（-40 ℃、22 h）→大鲵冻干粉→按1∶100比例添加酱香型白酒→澄清（4 000 r/min离心10 min）→大鲵肽酱香酒
（2）泡制处理
称取大鲵肉10 g→清洗→剁碎→按照料液比1∶10（g∶mL）加53%vol酱香型白酒→浸泡30 d→澄清（4 000 r/min离心10 min）→大鲵肽酱香酒
（3）酶水解法
称取大鲵肉10 g→按照料液比1∶4（g∶mL）加水→调节pH→加入不同酶制剂→恒温酶解→沸水浴灭酶10 min→离心（4 000 r/min）→上清液冷冻干燥（-40 ℃、22 h）→大鲵冻干粉→与酱香型白酒一定比例调配→澄清（4 000 r/min离心10 min）→大鲵肽酱香酒
酶制剂的种类和酶解条件见表1。
表1 蛋白酶的水解条件
Table1 Enzymolysis conditions of proteases
1.3.2 大鲵肽酱香酒酶解工艺优化单因素试验
选择最适蛋白酶，设定料液比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g∶mL））、酶添加量（4 000 U/g、5 000 U/g、6 000 U/g、7 000、8 000 U/g）、酶解时间（2 h、3 h、4 h、5h、6 h）、酶解温度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）、pH值（2 h、3 h、4 h、5 h、6 h）5个因素进行单因素试验。以DPPH·清除率和多肽含量为考察指标，研究酶解工艺各因素对大鲵肽酱香酒抗氧化活性的影响。
1.3.3 大鲵肽酱香酒酶解工艺优化响应面试验
在单因素试验结果的基础上，以大鲵肽酱香酒DPPH·清除率（Y）为响应值，选择酶添加量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）及酶解pH（D）为自变量，进行4因素3水平Box-Behnken试验，Box-Behnken试验设计因素与水平见表2。
表2 酶解工艺优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for hydrolysis conditions optimization
1.3.4 大鲵肽酱香酒理化指标的测定
（1）多肽含量的测定[21]
牛血清蛋白标准曲线的绘制：配制20 mg/mL牛血清蛋白对照品溶液，精密移取对照液0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL加入具塞试管中，分别加水至1 mL，再加碱性铜试液1 mL，放置10 min。再逐管加入0.5 mL福林酚试剂，立即混匀，30 min后于波长650 nm处测定吸光度值。以牛血清蛋白质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为横坐标，绘制牛血清蛋白标准曲线，得标准曲线回归方程y=0.239 9x+1.533 0，相关系数R2为0.992 9，按照标准曲线回归方程计算样品中多肽含量。
（2）理化指标的测定
根据中国酒业协会发布的T/CBJ 5102—2019《保健酒》，保健酒中的理化指标有酒精度、甲醇和氰化物，测定方法分别参照国标GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》，GB 5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》和GB 5009.36—2016《食品安全国家标准食品中氰化物的测定》。
1.3.5 大鲵肽酱香酒抗氧化活性测定
（1）DPPH自由基清除率测定
参照青维等[24]的方法略作修改，取2.0 mL样品液，加2 mL浓度为0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液，振荡均匀，避光反应30 min，离心取上清液，于波长517 nm处测吸光度值Ai，取2.0 mL样品液，加2 mL体积分数95%乙醇，测其吸光度值Aj，以2 mL去离子水加入2 mL DPPH自由基溶液，作为对照组，测量其吸光度值A0。以维生素C（vitamin C，VC）为阳性对照，DPPH自由基清除率按以下公式计算：
式中：Ai为样品+DPPH自由基的吸光度值；Aj为样品+体积分数95%乙醇的吸光度值；A0为DPPH自由基+去离子水的吸光度值。
（2）羟自由基（·OH）清除率测定
取1.5 mmol/L 1，10-菲罗啉溶液1.5 mL置入试管中，加入pH 7.4 0.5 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（hosphate buffered solution，PBS）2 mL和1 mL待测液，再加入1 mL 硫酸亚铁溶液混匀，0.1%H2O2溶液1 mL，37 ℃水浴1 h，在波长536 nm条件下测定其吸光度值，以VC为阳性对照，羟自由基（OH·）清除率按以下公式计算：
式中：Ai为有样品和H2O2测得吸光度值；As为无样品，有H2O2测得吸光度值（用1 mL蒸馏水代替待测液）；A0为无样品和H2O2的吸光度值（用蒸馏水替代待测液和H2O2）。
（3）铁离子还原力测定
取待测液1 mL于试管中，依次加入（0.2 mol/L，pH=6.6）磷酸缓冲液和1%铁氰化钾各2.5 mL，于50 ℃水浴锅中水浴20 min，冷却后加入2.5 mL10%三氯乙酸溶液。上述溶液以转速3 000 r/min离心10 min，取上清液5 mL，再加入蒸馏水4.0 mL和0.1%三氯化铁1.0 mL，混匀，静置10 min，在波长700 nm条件下测定其吸光度值A700nm，以VC为阳性对照，吸光度值A700nm越大表明其还原力即抗氧化性越强[25]。
1.3.6 数据处理
试验设3次重复，采用SPSS19.0进行数据处理与分析，结果以“平均值±标准差”表示。采用Design Expert 10.0.4进行响应面试验的设计和分析。
2 结果与分析
2.1 不同预处理方式对大鲵肽酱香酒抗氧化活性的影响
通过DPPH·清除率和多肽含量两个评价指标比较不同预处理对大鲵肽酱香酒抗氧化活性的影响，结果见图1。
图1 不同预处理方法对DPPH·清除率和多肽含量的影响
Fig.1 Effects of different pretreatment methods on DPPH radical scavenging rates and polypeptide contents
由图1可知，酶解处理组的DPPH·清除率与多肽含量高于盐酸水解组和未处理组；酶解组中DPPH·清除率最高（73.32%）的是木瓜蛋白酶组，其次为碱性蛋白酶组（64.13%）；胰蛋白酶组多肽含量最高（15.95 mg/mL），木瓜蛋白酶组次之（14.10 mg/mL）。
值得注意的是，多肽含量最高（15.95 mg/mL）的胰蛋白组DPPH·清除率较低（58.47%），其他组数据也显现出酶解产物多肽含量与其清除自由基的能力不成正相关性的现象。可能因为多肽清除自由基的能力不仅与多肽含量相关，还与其氨基酸组成和结构、分子质量大小等多种因素有关，而不同酶由于其酶切点不同，生成的多肽分子质量、组成和结构有较大区别，导致其抗氧化活性有较大差异。
综合上述结果，选择酶解方式对大鲵肉进行预处理，酶制剂选择木瓜蛋白酶，其DPPH·清除能力最高，多肽含量也较高。
2.2 大鲵肽酱香酒酶解工艺优化单因素试验
2.2.1 料液比对DPPH·清除率和多肽含量的影响
图2 料液比对DPPH·清除率和多肽含量的影响
Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on DPPH radical scavenging rates and polypeptide contents
由图2可知，随着酶解料液比在1∶2～1∶4（g∶mL）范围内的提高，大鲵肽酱香酒清除DPPH自由基能力逐渐升高，料液比1∶4（g∶mL）时达到最高，随后下降；多肽含量随料液比在1∶2～1∶5（g∶mL）范围内提高不断升高，料液比1∶5（g∶mL）时多肽含量最高，随后下降。因此，选择料液比1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL）三个水平进行响应面试验。
2.2.2 酶添加量对DPPH·清除率和多肽含量的影响
图3 酶添加量对DPPH·清除率和多肽含量的影响
Fig.3 Effect of enzyme addition on DPPH radical scavenging rates and polypeptide contents
由图3可知，酶添加量在4 000～6 000 U/g范围，随酶添加量的增加，大鲵肽酱香酒清除DPPH自由基能力逐渐升高，酶添加量为6 000 U/g时达到最高，随后下降，添加量为8 000 U/g时急剧下降；而多肽含量随酶添加量呈现不规律的波动，添加量为5 000 U/g时多肽含量最高，6 000 U/g时多肽含量最低。因此，选择酶添加量5 000 U/g、6 000 U/g、7 000 U/g三个水平进行响应面优化。
2.2.3 酶解时间对多肽含量和DPPH·清除率的影响
图4 酶解时间对DPPH·清除率和多肽含量的影响
Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on DPPH radical scavenging rates and polypeptide contents
由图4可知，随着酶解时间在2～4h范围内的增加，DPPH自由基清除率和多肽含量逐渐升高，并在酶解时间为4 h时，二者达到最高，酶解时间＞4 h后二者均开始下降。因此，选择酶解时间3 h、4 h、5 h三个水平进行响应面优化。
2.2.4 酶解温度对多肽含量和DPPH自由基清除率的影响
图5 酶解温度对DPPH·清除率和多肽含量的影响
Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on DPPH radical scavenging rates and polypeptide contents
由图5可知，在酶解温度为45～65 ℃时，随着酶解温度的知高，DPPH自由基清除率和多肽含量先逐渐升高，二者在55 ℃时达到最高，随后均开始下降。因此，选择酶解时间50 ℃、55 ℃、60 ℃三个水平进行响应面优化。
2.2.5 酶解pH值对DPPH·清除率和多肽含量的影响
由图6可知，酶解pH值在4～5范围内，大鲵肽酱香酒清除自由基能力均较强，酶解pH值为5时最高，随后下降；多肽含量在酶解pH在4～8范围，先增加后减少，也在pH为5时达到最高。因此，选择酶解pH4、5、6三个水平进行响应面优化。
图6 酶解pH值对DPPH·清除率和多肽含量的影响
Fig.6 Effect of hydrolysis pH on DPPH radical scavenging rates and polypeptide contents
2.3 大鲵肽酱香酒酶解工艺优化响应面试验
2.3.1 响应面优化试验结果及方差分析
在单因素试验的基础上，以大鲵肽酱香酒DPPH·清除率（Y）为响应值，选择酶添加量（A），酶解时间（B），酶解温度（C）及酶解pH（D）为自变量，进行4因素3水平Box-Behnken试验，Box-Behnken试验结果见表3，方差分析见表4。
表3 Box-Behnken试验设计结果
Table 3 Results of Box-Behnken experiments design
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
利用DesignExpert10.0.4软件进行设计和拟合后，得多元回归方程为Y=+76.37-1.02A+2.92B+0.51C-5.75D+2.53AB+3.24AC-3.21AD-1.09BC+0.68BD+0.22CD-5.44A2-9.38B2-3.68C2-5.59D2。
由表4可知，该模型方程P＜0.000 1，表明此模型有显著意义，失拟项（P=0.376 5＞0.05）不显著，说明该回归模型能充分反映大鲵肽酱香酒清除DPPH自由基能力。决定系数R2=0.961 4，校正决定系数R2adj=0.922 9均＞0.9，说明模型拟合度好，能较好地反映因素和因变量的关系，可信度高，可用于大鲵肽酱香酒清除DPPH自由基能力的推测和分析。
一次项B和D对DPPH·清除效果影响极显著（P＜0.01），交互项AC、AD对DPPH·清除效果影响极显著（P＜0.01），二次项AB对DPPH·清除效果影响显著（P＜0.05），A2、B2、C2和D2对DPPH·清除效果影响极显著（P＜0.01）。各因素显著性程度依次是pH＞酶解时间＞酶添加量＞酶解温度。
2.3.2 各因素间的交互作用分析
响应面三维图谱可以直观地反应各因素间的交互作用，响应曲面越陡峭，表明响应值对因素变化越敏感；反之，曲面坡度相对平缓，则响应值对因素变化不敏感。
由图7可知，AB、AC、AD三组响应曲面坡度较陡，表明酶添加量分别与酶解时间、酶解温度和酶解pH三个因素对DPPH·清除率的交互作用显著（P＜0.05）；其余三组因素对DPPH·清除率的交互作用不显著（P＞0.05），这与表4方差分析结果一致。
图7 各因素交互作用对大鲵肽酱香酒DPPH自由基清除率影响的响应面及等高线
Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on DPPH radical scavenging rate of Andrias davidianus peptide of Moutai-flavor Baijiu
2.3.3 工艺参数优化验证试验结果
通过Design-Expert对模型的分析，得到清除DPPH自由基最佳的大鲵肽酱香酒最佳酶解工艺条件为：酶添加量6 126 U/g、酶解时间4.15 h、酶解温度55.43 ℃、酶解pH 4.46，大鲵肽酱香酒对DPPH自由基的清除率预测值为78.091%。为了便于实际操作，将最佳酶解工艺条件修正为酶添加量6 126 U/g、酶解时间4 h、酶解温度55 ℃、酶解pH 4.5。在此条件下进行3次平行验证试验，得到大鲵酒对DPPH自由基的清除率为（77.98±0.99）%，与预测值接近，证明了此模型拟合准确、可行。
2.3.4 大鲵肽酱香酒体外抗氧化活性测定结果
以VC为阳性对照，测定DPPH·、·OH清除率和还原能力，结果见表5。由表5可知，本实验选用的酱香型白酒DPPH·清除率、·OH清除率和Fe3+还原力（吸光度值A700nm）均很低，分别为（4.72±0.14）%、（3.98±0.11）%和0.010±0.001，而大鲵肽酱香酒DPPH·清除率、·OH清除率和Fe3+还原力（吸光度值A700nm）分别达到（77.98±0.99）%、（70.66±0.70）%和0.651±0.021，其抗氧化活性虽比VC低，但较酱香型白酒有显著提高。
表5 大鲵肽酱香酒抗氧化活性测定结果
Table 5 Results of antioxidant activity of Andrias davidianus peptide Moutai-flavor Baijiu
3 结论
通过比较酸水解、酶水解和直接泡制等不同预处理方法对大鲵肽酱香酒清除DPPH自由基能力和多肽含量的影响，发现酶水解法优于其他两个方法，木瓜蛋白酶为最适酶制剂，以DPPH自由基清除率为评价指标，在单因素试验的基础上，经响应面法优化得到大鲵肽酱香酒酶解工艺为：酶添加量6 126 U/g、酶解时间4 h、酶解温度55 ℃、酶解pH 4.5。此优化条件下，DPPH自由基的清除率为（77.98±0.99）%，羟自由基清除率为（70.66±0.70）%，Fe3+还原能力（吸光度值A700nm）为0.651，多肽含量达（14.20±0.11）mg/mL，酒精度41.6%vol，甲醇含量0.27 g/L，氰化物未检出，均符合T/CBJ 5102—2019《保健酒》的理化要求。结果表明此工艺生产的大鲵肽酱香酒具有较强体外抗氧化活性，活性肽含量较高，为养殖大鲵的产业化发展和酱香保健酒的开发提供有利参考。
[1]ZHOU Z Y,GENG Y,LIU X X,et al.Characterization of a ranavirus isolated from the Chinese giant salamander (Andrias davidianus,Blanchard,1871)in China[J].Aquaculture,2013,387(2):66-73.
[2]柯欢，祝思雨，陈素勤，等.人工养殖大鲵与甲鱼等食材的蛋白质营养分析[J].农产品加工，2019，10（19）：41-43.
[3]蔡佳佳，刘振珂，李吉华，等.大鲵肉对D-半乳糖诱发小鼠衰老相关指标的影响[J].西部中医药，2015，28（7）：4-7.
[4]金文刚，裴金金，贺屹潮，等.大鲵皮肤分泌物抗菌肽Andricin 01 生物信息学分析[J].黑龙江畜牧兽医，2018（3）：206-208.
[5]郭洁.人工养殖大鲵肉的抗疲劳实验研究[J].健康之路，2016，15（5）：7-8.
[6]赵小忠，魏宁，张良振，等.大鲵低聚糖肽抗皮肤光老化的临床研究[J].中国医疗美容，2014，4（3）：78-80.
[7]曹洁，余龙江，崔永明，等.纯大鲵粉对小鼠抗疲劳作用及免疫功能的影响[J].四川动物，2008，27（1）：149-152.
[8]陈立靖，陶峰勇，鲁庆斌.大鲵的研究进展（英文）[J].上海水产大学学报，2003，12（S1）：110-114.
[9]蒋左玉，姚俊杰，熊铧龙，等.贵州人工养殖子二代大鲵的肌肉营养成分分析[J].贵州农业科学，2013，41（12）：141-143.
[10]HE D,ZHU W M,ZENG W,et al.Nutritional and medicinal characteristics of Chinese giant salamander (Andrias davidianus)for applications in healthcare industry by articial cultivation:A review[J].Food Sci Human Wellness,2018,7(1):1-10.
[11]ZHU W,JI Y,WANG Y,et al.Structural characterization and in vitro antioxidant activities of chondroitin sulfate purified from Andrias davidianus cartilage[J].Carbohydr Polym,2018,196:398-404.
[12]金桥，魏芳，佟长青，等.大鲵糖肽组分的高效液相色谱分析及其抗氧化活性研究[J].北京农学院学报，2011，26（1）：27-29.
[13]胡廷，青维，李美凤，等.大鲵多肽体外抗氧化活性研究[J].食品科技，2018，43（6）：254-258.
[14]张佳婵，王昌涛，李萌，等.大鲵活性肽酶法制备工艺优化及抗氧化性分析[J].食品工业科技，2016，37（12）：217-221.
[15] RAMADHAN A H,PEMBE W M,OMAR K A,et al.Characterization of antioxidant activety of peptide fractions from Chinese Giant Salamander(Andriaus davidianus)protein hydrolysate[J].J Glob Innov Agric Soc Sci,2017,5(1):14-19.
[16]魏颖，尹曼，陈亮，等.玉米肽和姜黄素对酒精性脂肪肝的作用[J].中国食品学报，2019，9（3）：127-132.
[17]隋玉杰.玉米肽的制备条件及其醒酒护肝机理研究[D].武汉：华中农业大学，2006.
[18]席浩，刘沁雪，陈曦，等.乳源六肽预防和降低小鼠急性酒精性肝损伤及其机制[J].安徽医科大学学报，2019，54（10）：1545-1550.
[19]余晓东，和七一.蛇肽保健酒及其制备方法：CN103555527A[P].2014-02-05.
[20]徐怀德，殷金莲，李志成，等.一种甲鱼多肽酒的制作方法：CN2006 10042671.X[P].2006-11-15.
[21]罗强，刘杰，刘志刚.酱香型白酒中活性成分的抗氧化活性[J].食品与发酵工业2019，45（23）：84-89.
[22]罗强，刘杰，刘志刚.酱香型白酒中吡嗪类物质体外抗炎作用研究[J].中国酿造，2019，38（7）：156-160.
[23]Effect of Maotai liquor on P53 gene in primary hepatocellular carcinoma induced by compound factors in rats[J].Chinese Medical Journal,2014,127(2):378-380.
[24]青维，孙强，白鑫华，等.超滤对大鲵多肽抗氧化活性的影响[J].食品工业科技，2016，37（18）：139-142.
[25]盛冉，孙志高，张震，等.鲁氏不动杆菌Acinetobacter lwoffii UL 产类胡萝卜素的纯化与鉴定及其抗氧化活性检测[J].食品与发酵工业，2019，45（3）：99-106.