多依果（Docynia delavayi fruit）又称栘衣果、酸苹果，是蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科（Maloideae）栘[木衣]属（Docynia）热带经济作物云南栘（Docynia delavayi（Franch.）Schneid.）的果实。云南栘主要分布于亚洲，在我国产于云南、贵州、四川等西南各地[1-2]。多依营养丰富，食药两用[3]，其富含多种氨基酸，具有健胃消食和抗疲劳的作用[4-5]；且其还是一味傣药，含有黄酮类[6-13]、多酚类[14-15]等活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化和治疗心血管病的药用价值[16]。多依果是云南省极具地方特色的热带水果，当地人大量采摘食用，栘依产业对提高山区农民收入和生活水平具有重要的意义。
多依果中粗纤维和植物单宁含量较高，生吃时质地酸涩[15]，使得外地受众较少，因而造成了多依果资源的大量浪费。目前，受限于地域环境特征，关于多依果产品的研究开发，报道较少[17]。朱明君等[18]通过人工接种冠突散囊菌（Eurotium cristatum）固态发酵多依果茶饮料，并研究发现发酵后果茶的呈味氨基酸和人体必需氨基酸质量分数升高，这表明通过发酵可以改变多依果鲜果的粗渣口感；冀智勇等[19-20]对多依果的营养成分进行了研究，并在此基础上介绍了多依腌制果、果酱、果脯、果角、果片、果饮料、果醋、果酒的粗加工工艺，但加工方法简单，且没有对工艺参数进行优化。多依果在民间的酒酿历史悠久，但受到技术水平的限制，风味口感各异，难以大规模推广。因此，研究多依果酒的酿造工艺并加以科学优化，既可以将多依果的营养成分保存到果酒中，丰富果酒品种，又可充分利用多依果的野生资源，进而推动多依果产业的现代化发展。
酵母菌生长繁殖的适宜温度为20～25 ℃左右。受亚热带季风气候影响，多依果主产地普洱市四季如春，在10～12月份多依果成熟采摘期时日温差约为18～26 ℃，因此，当地多依果酒酿制多选择自然温度发酵。本研究以多依果为原料，室温（18～26 ℃）发酵多依果酒，以酒精度、可溶性固形物含量及感官评分为评价指标，在单因素试验的基础上，通过响应面法优化多依果酒的酿造工艺参数，旨在酿造一款具有多依果典型香气和富含其多种营养成分的果酒，为多依果产品的开发以及多依果酒的产业化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
多依果（黄熟期）：云南普洱农贸市场；安琪果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；果胶酶（10 000 U/mL）：诺维信生物有限公司；白砂糖（食品级）：深圳安泰生物科技有限公司；焦亚硫酸钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
ME204E分析天平：美国METTLER TLLEDO公司；HC-3618R高速冷冻离心机：安徽中科中佳公司；LH-B55数显折光仪：杭州陆恒生物科技有限公司；PB-10酸度计：北京赛多利斯科学仪器有限公司；GMK-702R糖度测定仪：北京西诺远大科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 多依果酒酿造工艺流程及操作要点
操作要点：
原料预处理：挑选无病虫害、无霉变、无破损的黄熟期多依果，洗净，晾干。
切块、打浆：鲜果称质量，切块，按料液比2∶1（g∶mL）加水，混合打浆。
酶解：添加0.2%的果胶酶于果浆中，室温酶解6 h。
糖度调整：添加试验所需白砂糖量，以达到果酒发酵所需的酒精度要求。
杀菌：添加试验所需的二氧化硫进行灭菌。
酵母活化：称取试验所需酵母菌用量，加入5 mL无菌水，在35 ℃条件下水浴活化30 min，备用。
接种发酵：将活化后的酵母液接入到发酵罐中酶解后的果浆中，室温发酵，并且定期搅拌排气。
过滤、陈酿：发酵液纱布过滤，酒液密封陈酿1～2个月，得多依果酒。
1.3.2 多依果酒酿造工艺优化单因素试验
根据预试验结果确定初始发酵条件为白砂糖添加量24%、二氧化硫添加量6%、酵母菌添加量3%，室温（日温差18～26 ℃）发酵7 d。在此基础上，分别改变白砂糖添加量（20%、22%、24%、26%、28%）、二氧化硫添加量（4%、5%、6%、7%、8%）、酵母菌接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、发酵时间（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d），测定多依果发酵液的酒精度及可溶性固形物含量，并进行感官评定。
1.3.3 多依果酒酿造工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，确定发酵时间为6 d，选取对多依果发酵液酒精度、感官评分具有显著性影响的因子白砂糖添加量（A）、二氧化硫添加量（B）和酵母菌接种量（C）作为考察因素，酒精度（Y）为响应值进行3因素3水平的响应面优化试验，试验因素与水平见表1。
表1 多依果酒酿造工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation technology optimization of Docynia delavayi fruit wine
1.3.4 测定方法
（1）理化指标
酒精度：参考GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中酒精计法测定；总糖、总酸含量：分别参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定、酸碱滴定法测定；可溶性固形物含量：参考GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中折光计法测定。
（2）微生物指标
菌落总数：参考GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》测定；大肠菌群计数：参照GB 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》测定。
（3）感官评价
根据多依果果酒的特点，参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中感官检查与评定方法和标准，制定多依果感官评分标准，并组建感官评定小组20人进行感官评分，取其平均值为评分结果。感官评分标准见表2。
表2 多依果酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Docynia delavayi fruit wine
1.3.5 数据分析
采用Design-Expert 10进行响应面试验设计与分析，采用Origin 2008进行数据处理和图表制作。
2 结果与分析
2.1 多依果酒酿造工艺优化单因素试验
2.1.1 白砂糖添加量对多依果酒发酵的影响
白砂糖添加量对多依果酒发酵的影响见图1。由图1可知，白砂糖添加量在20%～28%的范围内，随着白砂糖添加量的逐渐增加，多依果酒的酒精度和感官评分均呈现先增高后下降的趋势，可溶性固形物含量则呈现先持平后升高的趋势。当白砂糖添加量＜24%之前，白砂糖添加量过低，发酵不充分，导致果酒的酒精度偏低，且口感发涩，感官评分偏低；当白砂糖添加量为24%时，果酒的酒精度达到最高（7.30%vol），此时酒液感官评分也是最佳（96分）；而当白砂糖添加量＞24%之后，可溶性固形物含量急剧上升，残糖量过多，反而不利于酵母菌的繁殖，导致果酒的酒精度下降，而且过甜的口感也使得感官评分不高。因此，确定最佳的白砂糖添加量为24%。
图1 白砂糖添加量对多依果酒发酵的影响
Fig.1 Effect of sugar addition on Docynia delavayi fruit wine fermentation
2.1.2 二氧化硫添加量对多依果酒发酵的影响
二氧化硫在果酒发酵过程中起到杀菌、保鲜、提高其口感质量的作用。二氧化硫添加量对多依果酒发酵的影响见图2。
图2 二氧化硫添加量对多依果酒发酵的影响
Fig.2 Effect of SO2 addition on Docynia delavayi fruit wine fermentation
由图2可知，二氧化硫添加量在4%～8%的范围内，对多依果酒的酒精度影响较小，酒精度、感官评分及可溶性固形物含量均呈现先上升后下降的趋势。当二氧化硫添加量为5%时，酒精度达到最大（8.32%vol），此时果酒感官评分也最高（97分）；当二氧化硫添加量＞5%之后，二氧化硫含量过高，酵母菌的活性受到抑制，可溶性固形物含量增加，感官评分降低。因此，确定最佳二氧化硫添加量为5%。
2.1.3 酵母菌接种量对多依果酒发酵的影响
酵母菌接种量对多依果酒发酵的影响见图3。由图3可知，酵母菌接种量在1%～5%范围内，随着酵母菌接种量的逐渐增加，多依果酒的酒精度呈现先增高后平缓的趋势，感官评分呈现下降趋势，可溶性固形物含量呈现先快速下降后平缓的趋势。当酵母菌的接种量＜3%之前，其接种量与果酒的酒精度呈正相关。当酵母菌接种量为3%时，酒精度最高达到9.48%vol。但当酵母菌接种量＞3%之后，其本身需要消耗果肉的营养物质，导致酒精转化率下降[21]。而且酵母菌的接种量在一定程度上影响了果酒的果香味，使得感官评分一直下降。因此，综合评价酵母菌的最佳接种量为3%。
图3 酵母菌接种量对多依果酒发酵的影响
Fig.3 Effect of yeast inoculum on Docynia delavayi fruit wine fermentation
2.1.4 发酵时间对多依果酒发酵的影响
发酵时间对多依果酒发酵的影响见图4。
图4 发酵时间对多依果酒发酵的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on Docynia delavayi fruit wine fermentation
由图4可知，随着发酵时间（5～9 d）的延长，酒精度和可溶性固形物含量整体趋于平缓，感官评分呈现先上升后下降的趋势。当发酵时间为6 d时，酒精度达到最大（8.48%vol），此时酒液感官评分也最高（98分）。发酵时间过长，果香味变淡，感官评分逐渐下降。因此，确定最佳发酵时间为6 d。
2.2 多依果酒酿造工艺优化响应面试验
2.2.1 回归模型的建立与方差分析
根据单因素试验结果，确定室温（18～26 ℃）发酵6 d，选用酒精度（Y）为响应值，以白砂糖添加量（A）、二氧化硫添加量（B）、酵母菌接种量（C）为考察因素，进行3因素3水平的响应面试验，试验设计与结果见表3，方差分析见表4。
表3 多依果酒酿造工艺优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation technology optimization of Docynia delavayi fruit wine
利用Design Expert 10软件对表3的结果进行多元回归拟合分析，得到二次多元回归方程：
Y=9.260-0.220A+0.100B+0.365C+0.180AB-0.010AC-0.110BC-0.635A2+0.045B2+0.015C2
由表4可知，该模型的P值＜0.000 1，极显著，说明所得方程有意义；失拟项P值＞0.05，不显著，说明所构建的模型很好，与试验的差异较小；相关系数R2为0.950 4，调整系数R2adj为0.956 2，差值＜0.2，说明预测值与试验值有较好的相关性，试验误差较小；模型的信噪比为21.788，远大于4，则表明该模型适合用于多依果酒酿造工艺和酒精度的预测。在该模型中，一次项A、C、交叉项AB和二次项A2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项B对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。根据F值大小可知，各因素对多依果酒酒精度影响的主次顺序为：酵母菌接种量（C）＞白砂糖添加量（A）＞二氧化硫添加量（B）。
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
2.2.2 响应面分析
对多依果酒的酒精度产生影响的各因素两两交互作用的响应面及等高线见图5。由图5a可知，响应曲面倾斜度很高，等高线呈椭圆形，说明白砂糖添加量和二氧化硫添加量的交互作用对多依果酒的酒精度有极其显著性影响。由图5b可知，响应曲面有倾斜度，等高线趋于圆形，说明白砂糖添加量和酵母菌添加量的交互作用对酒精度的影响较小。由图5c可知，响应曲面倾斜度不高，等高线接近椭圆形，说明二氧化硫添加量和酵母菌添加量的交互作用对酒精度有影响，但没有达到显著性水平（P＞0.05）。
结合以上结果分析，根据回归方程对试验结果进行优化，得到多依果酒的最优酿造条件为：白砂糖添加量23.69%，二氧化硫添加量4.51%，酵母菌接种量3.97%，在此工艺条件下，室温（18～26 ℃）发酵6 d，多依果酒的酒精度理论值为9.74%vol。根据实际情况，将工艺参数修正为：白砂糖添加量23.7%，二氧化硫添加量4.5%，酵母菌接种量4.0%，按修正后的工艺参数值进行模型的验证试验，得到多依果果酒的实际酒精度为9.82%vol，与理论值接近，说明采用响应面法优化多依果酒酿造工艺条件是准确可行的，该模型有一定的应用价值。
图5 各因素交互作用对多依果酒酒精度影响的响应面及等高线图
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on alcohol content in Docynia delavayi fruit wine
2.3 多依果酒的质量指标测定结果
对按最优工艺参数制备的多依果酒进行感官评价和部分质量指标测定。感官评定结果表明，多依果酒体具有多依果特征香气，与酒香混为一体，色泽为黄橙色，口感醇和，感官评分为98分。质量指标结果表明，酒精度9.82%vol，可溶性固形物含量13.00%，总酸含量7.20 g/L，菌落总数18CFU/mL，大肠菌群＜3MPN/100mL。果酒各指标项目检测结果均符合NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》的标准要求。
3 结论
以云南省普洱市特产的多依果为原料，酒精度、感官评分、可溶性固形物含量为评价指标，在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken响应面法设计和优化试验，确定多依果酒的最佳酿造工艺：白砂糖添加量23.7%，二氧化硫添加量4.5%，酵母菌接种量4.0%，室温（18～26 ℃）发酵6 d。在此最优酿造工艺条件下，多依果酒颜色呈黄橙色，果香与酒香协调，滋味醇厚，感官评分为98分。酒精度为9.82%vol，可溶性固形物含量为13.00%，总酸含量7.20 g/L，菌落总数18 CFU/mL，大肠菌群＜3 MPN/100 mL，各项指标均符合相关果酒行业标准。
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