随着人们生活水平的提高，开发富含益生菌、益生元等具有改善人体健康功能的活性物质的保健食品已经成为食品工业的重要发展方向之一[1]。研究证明，益生菌能竞争性抑制肠道致病菌的生长，从而具有维持肠道菌群平衡的功能[2]。此外，某些益生菌还具有抗氧化、同化胆固醇及提高免疫力等特殊保健功能[3]。因此，益生菌尤其是双歧杆菌（Bifidobacterium）和乳杆菌属（Lactobacillus）的益生菌已经被越来越多地应用于食品工业。
目前的消费市场，饮料不仅要具有解渴的功能，消费者更多地追求其补充能量、抗氧化、延缓衰老等特殊功能[4]。果蔬饮料中富含碳水化合物、氨基酸、维生素和矿物质等营养成分，不仅有利于人体健康，也有利于益生菌的生长[5]。甘蓝、苹果、马铃薯等果蔬已经用作益生菌饮料生产的原料[6-7]。研究表明，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）等乳酸菌可以耐受果蔬本身和乳酸菌发酵导致的较高的酸度和较低的pH环境[8-9]。刘磊等[10]以保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）为发酵菌株，进行了浑浊型龙眼果肉乳酸菌发酵饮料加工工艺的优化。李维妮等[11]对益生菌发酵苹果汁的发酵工艺进行了优化并对发酵前后的有机酸的变化进行了分析。郑欣等[12]以荔枝汁为原料，进行乳酸菌发酵果汁的制备营养品质的变化及贮藏稳定性研究。另外，采用苹果山药复合果蔬汁、枸杞胡萝卜复合汁、黄秋葵、桑葚汁等[13-14]为原料进行了乳酸菌发酵饮料的工艺研究。这些研究表明以果蔬汁单独或复合进行益生菌发酵饮料的制备是可行的，为益生菌发酵果蔬制品的开发奠定了基础。
我国葡萄种植面积大，资源丰富。葡萄中不仅含碳水化合物、氨基酸等营养物质，而且含有抗氧化、提高免疫力、抗癌和减少心脑血管疾病风险的多酚、花青素、膳食纤维等功能性成分[15]。目前葡萄主要以鲜食为主，深加工产品主要有葡萄干、葡萄汁和葡萄酒。王舸楠等[16]采用响应面法方法对复合菌种发酵葡萄玫瑰花饮品的发酵工艺进行了优化。但是以葡萄为原料制备富含益生菌的功能性饮料的研究鲜见报道。为了更好地开发功能型葡萄汁饮料，本研究以前期筛选的具有体外降胆固醇降甘油三酯功能的益生菌嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）为菌种，采用单因素试验和正交试验，对影响益生菌生长和代谢的初始pH、接种量、发酵温度和发酵时间等发酵工艺进行了研究和优化，为益生菌发酵葡萄汁饮料的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料和菌株
巨峰葡萄：购于安徽巢湖市，8月初采摘，新鲜，无损伤、病害或腐烂；嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）L2-16：从发酵黄瓜中分离的具有体外降胆固醇和甘油三酯功能的益生菌，美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）接收号KU922757[17]，巢湖学院食品工程实验室保藏。
1.1.2 化学试剂
果胶酶（50 000 U/g）：河南华悦化工产品有限公司；碳酸钠、氢氧化钠（均为分析纯）：国药化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
MRS培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.2 仪器与设备
JYZ-V5 PLUS九阳智能原汁机：九阳股份有限公司；DHG-9140A 电热恒温鼓风干燥箱：上海三发科学仪器有限公司；LDZM-80KCS-Ⅲ立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型超净工作台：苏州净化设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种活化及制备
将-20 ℃保藏的嗜酸乳杆菌L2-16甘油管，接种到装液量为50 mL/150 mL MRS液体培养基中，37 ℃静置培养12 h，用无菌水离心洗涤3次，并用无菌水调至适宜浓度，得到嗜酸乳杆菌菌悬液，备用。
1.3.2 发酵葡萄汁饮料制备
将葡萄除梗后，清洗，用榨汁机压榨，制成新鲜果汁，加果胶酶（果胶酶的添加量0.1 g/kg）于15 ℃条件下酶解10 h，取上清液，采用1 mol/L的碳酸钠调节pH，接种制备的嗜酸乳杆菌菌悬液（接种量0.5%～3.0%），在40 ℃静置发酵至pH不再增加。
1.3.3 益生菌发酵葡萄汁饮料工艺优化单因素试验
将葡萄汁（初始pH 3.3）用1 mol/L的碳酸钠或盐酸将初始pH值分别调节至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0，分别按照0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的接种量接入嗜酸乳杆菌L2-16菌悬液，在20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃、40 ℃发酵12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h，测定嗜酸乳杆菌活菌数并进行感官评价。
1.3.4 益生菌发酵葡萄汁饮料工艺优化正交试验
以葡萄汁发酵的初始pH、接种量、发酵温度及发酵时间为影响因素，设计4因素3水平的正交试验，以嗜酸乳杆菌活菌数和感官评价结果为评价指标，确定最佳的发酵工艺条件。正交试验因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation technology optimization
1.3.5 分析检测
（1）嗜酸乳杆菌活菌数
采用平板计数法测定嗜酸乳杆菌活菌数[18]。计数平板表面菌落数，乘以稀释倍数，即为嗜酸乳杆菌活菌数。
（2）益生菌发酵葡萄汁饮料酸度
采用pH计法，按照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》中规定的方法测定发酵葡萄汁饮料的酸度[19]。
（3）益生菌发酵葡萄汁可溶性固形物含量
按照GB T12143—2008《饮料通用分析方法》中规定的方法测定发酵葡萄汁饮料的可溶性固形物含量[20]。
（4）感官评定
参考王舸楠等[16]对葡萄玫瑰花饮品感官评价方法，并根据益生菌发酵葡萄汁饮料的特点进行修改。制备的发酵葡萄汁由10名经训练的专业教师和学生从色泽、香气、风味和体态四方面进行感官评价，满分100分，具体评分细则见表2。
表2 发酵葡萄汁感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented grape juice
2 结果与分析
2.1 益生菌发酵葡萄汁饮料的单因素试验
2.1.1 初始pH对葡萄汁发酵的影响
图1 初始pH值对葡萄汁发酵的影响
Fig.1 Effect of initial pH on grape juice fermentation
由图1可以看出，当初始pH为3.5时，由于酸度过大，对嗜酸乳杆菌的生长产生不利的影响，导致其生长速度减慢，发酵后活菌数较低；在初始pH3.5～5.0，随着初始pH的增大，嗜酸乳杆菌的活细胞数逐渐增大，当初始pH＞5.0时，活菌数呈下降的趋势。在初始pH3.5～4.5，随着初始pH的增大，发酵葡萄汁的感官评分逐渐提高，当初始pH＞4.5时，感官评分呈下降的趋势。因此，综合考虑确定适宜的初始pH值为4.5。
2.1.2 接种量对葡萄汁发酵的影响
图2 接种量对葡萄汁发酵的影响
Fig.2 Effect of inoculum on grape juice fermentation
由图2可以看出，当接种量为0.5%～2.0%时，随着接种量的增大，嗜酸乳杆菌活菌数提高，但随着接种量的继续增大，活菌数不再增加。接种量为0.5%～2.0%时，感官评分随着接种量的增大有增加的趋势，但接种量继续增大，感官评分不再提高反而下降。因此，综合考虑，确定适宜的接种量为2.0%。
2.1.3 发酵温度对葡萄汁发酵的影响
由图3可以看出，发酵温度在20～36 ℃，随着温度的升高，活细胞数逐渐增加，但当温度继续提高，活细胞数显著下降。在20～32 ℃时，随着发酵温度的提高，发酵葡萄汁的感官评分逐渐增加，当温度提高至36 ℃时，感官评分没有明显下降，当发酵温度提高至40 ℃时，感官评分下降。因此，综合考虑活细胞数和感官品质情况，选择较适宜的发酵温度为32 ℃。
图3 发酵温度对葡萄汁发酵的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on grape juice fermentation
2.1.4 发酵时间对葡萄汁发酵的影响
图4 发酵时间对葡萄汁发酵的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on grape juice fermentation
由图4可以看出，发酵时间在12～20 h范围内，随着发酵时间的延长，嗜酸乳杆菌活菌数增大，此后，随着发酵时间的延长，嗜酸乳杆菌活菌数不再显著增加，甚至有下降的趋势。发酵时间在20 h后嗜酸乳杆菌细胞进入到生长的稳定期，死亡率大于繁殖速率。发酵时间在12～24 h范围内，随着发酵时间的延长，感官评分逐渐提高，此后，随着发酵时间的延长，发酵葡萄汁的感官评分呈下降的趋势。因此，综合考虑，确定适宜的发酵时间为24 h。
2.2 益生菌发酵葡萄汁的正交试验
在单因素试验基础上，设计4因素3水平的正交试验，正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。
由表3可知，以活细胞数作为评价指标，对活细胞数影响的主次顺序为发酵时间＞初始pH＞发酵温度＞接种量，最佳发酵工艺条件组合为A2B3C2D2，即最佳初始pH 4.5，接种量2.5%，发酵温度32 ℃，发酵时间24 h。以感官评分作为评价指标，对感官评分影响的主次顺序为初始pH＞接种量＞发酵时间＞发酵温度，最佳发酵工艺条件组合为A2B3C2D3，即最佳初始pH 4.5，接种量2.5%，发酵温度32 ℃，发酵时间28 h。综合考虑活细胞数和感官品质，确定最佳发酵工艺条件为初始pH 4.5，接种量2.5%，发酵温度32℃，发酵时间26 h。在此最佳工艺条件下，进行3次平行验证试验，活细胞数对数平均值为8.87，感官评分平均值为88.3分。
表3 发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation technology optimization
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
3 结论
利用益生菌嗜酸乳杆菌L2-16菌株发酵巨峰葡萄汁，通过正交试验确定葡萄汁发酵饮料的最佳工艺条件为最佳初始pH 4.5，接种量2.5%，发酵温度32 ℃，发酵时间26 h。在此优化条件下，葡萄汁发酵饮料活菌数对数值为8.87，感官评分88.3分，酸度为90.1°T，可溶性固形物含量17.2%。
功能益生菌的葡萄汁发酵饮料的研制，不仅赋予了产品的功能性，延长了葡萄产业链，还可增加葡萄的附加值，有利于葡萄产业的发展，具有较好的市场推广前景。
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