柚子中含有类胰岛素、柚皮苷、新橙皮苷、挥发油、维生素B1、维生素B2、烟酸、果糖、葡萄糖、蛋白质、酯类、铁、钙、磷及粗纤维等活性成分[1-3]，具有健脾、止咳、助消化、抗高血压、抗氧化、抗糖尿病、抗血管硬化等保健功能[4]。如今，市面上普遍存在的柚子产品有柚子茶、柚子果冻、金柚凉果、柚子复合酒等，大多以营养保健为主[5]，以柚子幼果为原料制成的产品较为鲜见。目前，我国柚子以鲜食为主。据统计，我国最大的柚子产区—广东省梅州市的总种植面积为2万hm2，总产量达32.5万t[5-6]。金柚种植过程中有大量自然掉落的金柚幼果[7]。自然掉落的幼果为青色，皮厚肉少，销售价值大幅下降，造成大量的经济损失与浪费。据研究，柚皮质量占整个柚子的43%～48%（幼果柚皮所占比例更高）[8]，提高柚皮利用率在金柚幼果高值化利用上具有实际意义。在我国水果产能过剩的情况下，水果酿酒是解决该问题的重要方法；同时酿制的果酒都具有高的营养价值和对人体健康有益的特点[5-6]。
铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛属多年附生草本植物，在福建、广东、广西、云南、贵州等地均有分布[12]，是一味常用的药食两用中药材。有研究表明，其含有丰富的多糖、黄酮类、氨基酸类、生物碱类等活性成分[13-16]，具有养阴生津、抗肿瘤抗突变、降血压、增强机体免疫力及抗氧化等活性功能[17]。有研究表明，石斛花具有既可药用，也可用作香料的成分[15]；许多茶商也将其开发成保健品花茶饮料[18-19]。
每年金柚残次果浪费较多，并且效益不高[11]。为了改善金柚幼果造成的资源浪费和环境污染等问题，本试验在前人制作柚子果酒的基础上[20-22]，利用金柚幼果进行果酒发酵，配合加入铁皮石斛，使果酒兼备其两者活性功能成分，通过探究在金柚幼果的处理方法和发酵过程中的影响果酒发酵质量的因素[23]，优化石斛花金柚幼果功能性果酒的发酵工艺，使果酒更具营养价值和较佳风味，从而提高金柚幼果的利用率和其自身价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
铁皮石斛鲜花：市售；金柚幼果：来自广东梅州沙田柚基地；SY酵母：湖北安琪酵母有限公司；果胶酶（酶活力3 000 U/g）、柠檬酸、β-环糊精：瑞永公司；白砂糖：上海枫未实业有限公司；纤维素酶（酶活700 EGU/g）：诺维信公司；偏重亚硫酸钾（分析纯）：郑州博研生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
PHS-3C精密酸度计：上海雷磁仪器有限公司；UV-1100B分光光度计：美谱达仪器有限公司；DHP-9032生化恒温培养箱：上海一恒仪器有限公司；WYT手持糖度计：成都豪创光电仪器有限公司；MJ-PB40E25SE搅拌机：美的集团；SHJ-4电热恒温水浴锅：上海梅香仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 石斛花金柚幼果果酒工艺流程
原料选取→果皮果肉打浆、护色→酶解→过滤→脱苦→灭酶→加入石斛花水提液、配料→调整糖度和pH→接种→发酵→过滤→加入石斛花→二次发酵→离心→调配→装瓶→灭菌→成品
1.3.2 操作要点
原料选取：选取金柚幼果落果和质量佳的新鲜铁皮石斛花，并且清洗干净。
打浆：将清洗好的果皮、果肉切丁，放入搅拌机，以果皮果肉和水1∶2（g∶mL）的比例加入饮用水，用搅拌机将果皮打浆。加入0.1%的偏重亚硫酸钾进行护色杀菌。
酶解：采用纤维素酶和果胶酶复合酶解，向果浆中加入0.20%果胶酶和0.03%纤维素酶，在50 ℃条件下酶解50 min。酶解后的果浆用4层纱布过滤，收集果汁。
脱苦、灭酶：向果汁中分别加入2.5%的β-环糊精，在45 ℃条件下恒温水浴100 min。把脱苦后的果汁加热至65 ℃保温30 min，后冷却至30 ℃备用。
浸提石斛花：将铁皮石斛花和水按1∶10（g∶mL）料液比在75 ℃水浴浸提30 min，过滤，收集滤液，重复3次，合并3次浸提过滤得的浸提液。以果汁∶石斛花浸提液=1∶1（V∶V）的比例混合。
成分调整：测混合液糖度，加白砂糖调整初始糖度为24%。测混合液pH值，用柠檬酸调整pH值为4.0。
酵母活化、接种：在30～37 ℃条件下活化酵母15 min。按照0.07%的接种量把酵母加入混合液中。发酵前2 d用纱布盖口，使酵母有氧呼吸，充分繁殖。之后采用密闭式发酵，发酵7 d。整个过程控制发酵温度在22 ℃。
二次发酵：发酵结束后，用4层纱布过滤果酒，除去残渣。以1∶10（g∶mL）的比例，把石斛鲜花加入过滤后的果酒，放在2 ℃的环境下，使其二次发酵，后熟。
离心处理：把果酒装入离心管，放入离心机，在3000r/min条件下离心10 min，再收集上层清液。
后期调味：对果酒的酒精度和酸度调配，使其酒味更佳；再将果酒倒入已经灭菌的玻璃瓶中，密封，使其在70 ℃下水浴恒温20 min。
1.3.3 原料处理方法的确定
果皮榨浆后，向果浆中分别加入不同添加量（0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）的果胶酶以及0.03%纤维素酶，在50 ℃条件下复合酶解50 min。由于金柚幼果中果胶含量较大，以出汁率和可溶性固形物为评价指标，探究不同果胶酶添加量对出汁率的影响。
出汁率=出汁量/原料量×100%；可溶性固形物利用手持糖度计测量。
1.3.4 脱苦方法的确定
向果汁中分别加入0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的柚苷酶，在60 ℃恒温水浴60 min，或者向果汁中分别加入1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的β-环糊精，在45 ℃恒温水浴100 min，然后在初始糖度为22%，pH值为4.0，接种量0.07%，发酵温度为22 ℃的条件下发酵7 d，以感官评价为评价指标，研究两种脱苦材料及其添加量对果酒苦味的影响[24-25]。
1.3.5 果酒发酵工艺优化单因素优化试验
以酵母接种量（0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.11%），发酵温度（16 ℃、19 ℃、22 ℃、25 ℃），发酵时间（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d）以及初始pH（3.6、3.8、4.0、4.2）为考察因素，通过单因素试验考察其对果酒酒精度和感官评分的影响。
1.3.6 果酒发酵工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，以酒精度（Y）为响应值，以酵母接种量、发酵温度、发酵时间以及初始pH值为影响因素，设计4因素3水平响应面试验，优化石斛花金柚幼果果酒的发酵工艺。响应面试验因素与水平如表1所示。
表1 石斛花金幼果功能性果酒发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine
1.3.7 指标检测
（1）感官指标
石斛花金柚幼果果酒的感官评价主要根据色泽、风味、口感、滋味进行评分。选取10名食品专业人员对产品分别评价，取平均值作为产品的最终评分。脱苦工艺优化的感官评价标准见表2，发酵条件优化的感官评价标准见表3。
表2 金柚幼果果汁脱苦工艺优化的感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of debittering process optimization of immature pomelo juice
表3 石斛花金幼果功能性果酒发酵条件优化的感官评分标准
Table 3 Sensory evaluation standards of fermentation conditions optimization of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine
（2）理化指标检测
酒精度、总糖、还原糖、总酸：按GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定。
总黄酮含量的测定：配制0.008 mg/mL、0.032 mg/mL、0.048 mg/mL、0.064 mg/mL和0.08 mg/mL的芦丁标准溶液先加入1.4 mL 5%NaNO2摇匀，放置6 min，再加入1.4 mL 10%的Al（NO3）3，放置6 min；然后加入10 mL 1 mol/L NaOH，混匀，用体积数30%的乙醇稀释至20 mL，10 min后于波长510 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线。取1 mL果酒溶液，按上述步骤反应后，测其吸光度值，按照标准曲线回归方程计算得出总黄酮得率[26]。
还原力的测定：配制0.060 mg/mL、0.065 mg/mL、0.070 mg/mL、0.075 mg/mL和0.080 mg/mL维生素C标准溶液，加入1%铁氰化钾1 mL，混合物在50 ℃恒温加热20 min，急速冷却，加入2.5 mL10%三氯乙酸，3 500 r/min离心分离10 min。取上层清液2.5 mL，加入去离子水2.5 mL和0.5 mL 0.1%FeCl3，混合均匀，静置10 min后在波长700 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线。然后取1 mL样品液，按上述步骤反应后，测其吸光度值，得出还原力能力[27]。
2 结果与分析
2.1 酶解工艺优化
果胶酶和纤维素酶通过水解金柚幼果中的果胶和纤维素，软化果肉组织，从而提高果汁的可滤性[28-29]。果胶酶的添加量对金柚幼果出汁率影响结果见表4，可知出汁率随着果胶酶添加量增大而增大。当果胶酶添加量＞0.20%时，出汁率的变化不明显。因此，选取果胶酶最适添加量为0.20%。
表4 不同果胶酶添加量对金柚幼果出汁率的影响
Table 4 Effects of different pectinase addition on juice yield of immature pomelo
2.2 脱苦工艺优化
通过表5可知，β-环糊精的去苦效果总体感官评分要比柚柑酶的高，因此后期选用β-环糊精来对柚子酒进行脱苦。添加不同量的β-环糊精后，感官评价结果表明，3.0%与3.5%β-环糊精添加量的感官评价分数相差不大，则说明其去苦效果相差不大。因此，选择β-环糊精最佳添加量为3.0%。
表5 柚苷酶与β-环糊精添加量对金柚幼果果汁的去苦影响
Table 5 Effect of naringinase and β-cyclodextrin addition on the debittering of immature pomelo
2.3 果酒发酵工艺优化
2.3.1 酵母接种量对石斛花金柚幼果功能性果酒品质的影响
在初始pH值为4.0、发酵温度为22 ℃、发酵时间为7 d的条件下，观察不同酵母接种量对石斛花金柚幼果功能性果酒的酒精度及感官评分的影响，结果见图1。
图1 酵母接种量对石斛花金幼果功能性果酒品质的影响
Fig.1 Effect of yeast inoculum on the quality of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine
小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1可知，当酵母接种量达到0.07%时，果酒的酒精度达到最高值；随着酵母接种量增加至0.09%，酒精度稍微下降，感官评分达到最优值。其原因可能是酵母接种量过大，消耗在酵母菌生长繁殖上的糖量加大，用于无氧呼吸中发酵生成酒精的糖相对减少，导致酒精度降低[30]。因此，选择最佳酵母接种量为0.09%。
2.3.2 发酵温度对石斛花金柚幼果功能性果酒品质的影响
在初始pH值为4.0、酵母接种量为0.07%、发酵时间为7 d的条件下，观察不同发酵温度对石斛花金柚幼果果酒的酒精度及感官评分的影响，结果见图2。
图2 不同发酵温度对石斛花金幼果功能性果酒品质的影响
Fig.2 Effect of different fermentation temperatures on the quality of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine
由图2可知，随着发酵温度提高至22 ℃时，果酒的酒精度和感官评分的达到最优值；当发酵温度继续提高，果酒的品质反而下降。其原因可能是在温度较低时，酵母菌生理活动被抑制，代谢不旺盛，导致发酵不彻底，使酒精度过低和风味不足。当发酵温度高于22 ℃时，酵母菌发酵过于旺盛，酒精度逐渐下降，同时酒中果香味会变淡，有少量杂气，给果酒风味带来负面影响。因此，选择最佳发酵温度为22 ℃。
2.3.3 初始pH值对石斛花金柚幼果功能性果酒品质的影响
在酵母接种量为0.07%，发酵温度为22 ℃、发酵时间为7 d的条件下，观察不同初始pH值对石斛花金柚幼果果酒的酒精度及感官评分的影响，结果见图3。
图3 不同初始pH值对石斛花金幼果功能性果酒品质的影响
Fig.3 Effect of different initial pH on the quality of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine
由图3可知，随着初始pH值的升高，果酒的酒精度和感官评价分数都随之提高；在初始pH为4.0时，果酒的酒精度和感官评分达到最优值；当初始pH＞4.0后，两者开始下降。其原因可能是酵母菌适合在偏酸性的环境中生长，当初始pH过低或者过高时，酵母菌的繁殖会受到抑制，导致果酒酒精度低，果酒风味不足。综合来看，选择最佳初始pH值为4.0。
2.3.4 发酵时间对石斛花金柚幼果功能性果酒品质的影响
在初始pH值为4.0、酵母接种量为0.07%、发酵温度为22℃的条件下，观察不同发酵时间对石斛花金柚幼果果酒的酒精度及感官评分的影响，结果见图4。
图4 不同发酵时间对石斛花金幼果功能性果酒品质的影响
Fig.4 Effect of different fermentation time on the quality of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine
由图4可知，在刚开始发酵的3 d中，果酒中出现大量泡沫，酒质浑浊；随着发酵时间的加长，泡沫逐渐消失，果酒开始变得澄清，酒精度逐渐升高；发酵到7 d时果酒的感官评价分数达到最优值，酒香和果香味并存；发酵至9 d、11 d时，酒精度逐渐升高，酒中存在杂气，风味变差，感官评价分数开始降低。因此，选择最佳发酵时间为7 d。
2.4 响应面分析法优化石斛花金柚幼果果酒发酵工艺
2.4.1 响应面试验优化结果与分析
在单因素试验的基础上，以酒精度（Y）为响应值，选取酵母接种量（X1）、发酵温度（X2）、初始pH值（X3）、发酵时间（X4）四影响因素，采用4因素3水平的响应面试验设计，对果酒发酵的酒精度（Y）进行优化，试验设计和结果见表6。
表6 石斛花金幼果功能性果酒发酵工艺优化响应面试验结果与分析
Table 6 Results and analysis of response surface tests for fermentation process optimization of Dendrobium chinensis and immature pomelo functional wine
2.4.2 响应面试验方差分析
利用Design-Expert 8.06软件对表2数据进行二次多元回归拟合，根据试验结果得到二次多项回归方程为：
对该模型进行方差分析，结果如表7所示。
表7 响应面试验结果方差分析
Table 7 Variance analysis of response surface tests results
由表7可知，根据方差分析，当数学模型P值＜0.05，呈显著；失拟项P值＞0.05，呈不显著时，证明该模型显著，表明该模型可以接触响应中的变异，模型模拟效果良好。各因素中，一次项D和二次项B2对酒精度具有显著的影响（P＜0.05）。
方差分析结果中，决定系数R2值为0.813 5，表明模型可以解释81.35%的响应值，可以预测大多数结果；调整决定系数R2值为0.627 0，说明试验可进行优化，调整之后有62.70%的变化来源于试验所考察变量。变异系数为13.04%，数据的离散程度在可接受范围内。
2.4.3 验证试验
根据建立的数学模型，响应值最大时的最优条件为酵母接种量为0.09%、发酵温度24 ℃、初始pH值为3.8、发酵时间为9 d，产品酒精度预测值为11.8%vol。为了验证试验结果的可靠性，根据这个最优配方做试验，验证模型的拟合程度。试验结果表明，实际测得的酒精度为11.9%vol，预测值相对误差0.84%。
2.4.4 产品质量指标
石斛花金柚幼果果酒呈亮黄色，有光泽，澄清度高，而且通过柚子和石斛花香味协调，有突出的柚子香味，石斛花柚子整体协调，入口醇香浓厚，酸甜可口，没有苦味涩味。酒精度为11.9%vol，总糖为52.86 g/L，还原糖为39.78 g/L，总酸为2.53 g/L，总黄酮0.03 g/L，有一定的抗氧化活性，酒中菌落总数＜50 CFU/mL；大肠杆菌未检测出。
3 结论
本试验利用金柚幼果和石斛花为主要原料，加入0.20%果胶酶和0.03%纤维素酶酶解果浆，再以3%β-环糊精配合脱苦，所得金柚幼果出汁率、感官评分较高。通过单因素试验和响应面试验，得到最优石斛花金柚幼果功能性果酒的最优发酵工艺为酵母接种量0.09%、发酵温度24 ℃、初始pH值3.8、发酵时间9 d。在此优化条件下，石斛花金柚幼果果酒的酒精度可以达到11.9%vol。最后通过理化指标检测与市面上普通的柚子风味果酒进行对比，结果证明，石斛花金柚幼果果酒具有丰富的抗氧化物质和较优的抗氧化功能，在为消费者提供了新型产品的同时，还达到了废弃物高利用的目的，对农业可持续发展有着重大意义。
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