薏米是我国传统的滋养食品，其中不仅富含丰富的薏苡酸、薏仁素三萜类化合物、甾醇类化合物和生物碱等功能性成分[4-5]，还含有丰富的氨基酸、粗纤维以及众多微量元素[6-7]。近年的研究表明，薏米具有抗氧化、延缓衰老等功能，薏仁酯也具有抗癌防癌的功效[8-12]。因薏米具有较高营养价值，所以薏米功能性食品也日益增多，其中很早就有研究将薏米粉与脱脂牛乳进行混合后发酵得到新型发酵薏米乳饮品[13]，并对其工艺进行优化[14]。所用的发酵菌种常为保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的混合菌以及从酸菜等其他发酵食品中分离的乳酸菌[15]，但是关于不同菌种发酵对薏米乳产品的影响缺少详细的研究。
代谢组学技术是检测生物体整体代谢特征的技术，随着技术的发展，近年来代谢组学技术已被大量地应用于食品的研究中[16-17]，代谢组学技术可以探索特定食物、食物成分或食物组合的代谢效应，也就是说，了解食物与生物体生物化学反应方面的相互作用。对于国内的研究主要关注某种条件的改变对食品中代谢物质的影响，从而探索某些代谢途径的变化，相关结论为开发新型功能性食品提供理论依据[18-19]。本研究在对不同菌种发酵薏米乳营养品质及感官品质研究的基础上，又利用非靶向代谢组学技术对不同菌种发酵薏米乳产品的差异代谢产物进行更深一步分析，为充分发挥发酵薏米乳产品的营养功能提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
薏米粉：普江市焕荣堂贸易有限公司；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）：法国DANISCO公司；电子舌内部溶液、参比溶液、阴、阳离子溶液：日本Insent公司。
1.2 仪器与设备
FW100 高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；YR-8 超微粉碎机：济南银润包装机械有限公司；手持式阿贝折光仪：上海西光实业有限公司；NDJ-1黏度仪：上海天平仪器厂；SOX 406 脂肪测定仪：苏州贝锐仪器科技有限公司；RE52C旋转蒸发仪：沈阳凯威尔实验仪器有限公司；KDN-04C消化炉：浙江托普仪器有限公司；CT3质构仪：美国TA仪器公司；SA402B电子舌：日本Insent公司；SHP8200 LC/TOFMS液相色谱-飞行时间质谱联用仪：ABSCIEX公司。
1.3 试验方法
1.3.1 发酵薏米乳的制备
薏米磨粉过筛→超微粉碎→加水搅拌→加糖→杀菌→接种发酵→成品
取适量薏米粉过60目筛，室温下经超微粉碎机粉碎至粒径约0.05 mm备用。取薏米粉20 g分别加入300 mL蒸馏水中，70 ℃水浴条件下搅拌5 min，取白糖40 g溶于200 mL蒸馏水中搅拌均匀，并与薏米粉溶液混合搅拌均匀。将混合好的薏米乳于90 ℃条件下杀菌5 min，降温至40 ℃准备接种发酵。
准备上述薏米乳3份，分别加入0.005%的保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌，搅拌均匀后放入37 ℃培养箱中发酵10 h，得到发酵薏米乳样品。样品制备重复3次，并将3次制备的样品进行混合后用于后续试验测定。
1.3.2 不同菌种发酵薏米乳中营养成分含量的测定
可溶性固形物的含量通过手持式折光仪进行测定[20]；蛋白质含量测定按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法[21]；脂肪含量测定按照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中索氏提取法[22]；三萜含量测定参照香草醛-硫酸比色法[23]；多糖含量采用硫酸-苯酚法[24]。
1.3.3 不同菌种发酵薏米乳电子舌味感的测定
取50 mL的发酵薏米乳样品于6 000 r/min离心5 min。取上清液5 mL加入5倍体积的蒸馏水，于室温条件下静置2 h，待液体稳定后利用电子舌仪器测定其酸、苦、涩、咸、鲜五种味感的丰富度。试验重复3次。
1.3.4 不同菌种发酵薏米乳样品的物性及黏度的测定
通过TA质构分析仪分析不同菌种发酵薏米乳样品的质构特性。采用直径为2.5 cm的锥底圆柱形探针进行分析，测试前的速率为4.0 mm/s，测试速率1.0 mm/s 进入样品20 mm的深度，测试样品被压缩两次，间隔时间为4 s[25]。记录待测样品的硬度、粘力、胶着性、咀嚼性指数。不同菌种发酵薏米乳样品的黏度通过NDJ-1黏度计进行测定。试验重复三次。
1.3.5 不同菌种发酵薏米乳代谢组学分析
（1）样品预处理
精确移取100 μL待测样品；加入800 μL预冷提取溶液（甲醇∶乙腈=1∶1，V/V）于样品中，高通量组织破碎仪破碎；涡旋混匀后，冰上超声萃取10 min，重复3次；将样品-20 ℃静置30 min；12 000 r/min、4 ℃离心15 min，离心后取上清液，氮气吹干100 μL复溶液（乙腈∶水=1∶1，V/V）复溶备用。试验重复6次。
（2）检测条件
色谱条件为：BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A为水（含0.1%甲酸），流动相B为乙腈∶异丙醇（1∶1）（含0.1%甲酸），流速为0.45 mL/min，进样量为20 μL，柱温为40 ℃，洗脱条件见表1。
表1 发酵薏米乳样品的流动相洗脱梯度
Table 1 Mobile phase elution gradient of fermented coix beverage
质谱条件：样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式，电喷雾毛细管电压，进样电压和碰撞能量分别为20～40 V和6 eV。离子源温度和去溶剂温度分别为100 ℃和350 ℃，载气流量：800 L/h，质谱扫描范围：50～1 000 m/z[26]。
（3）质控
质控（quality control，QC）样品由所有检测样品混合而成，在仪器分析的过程中，每10个分析样品插入一个QC样品。
1.3.6 统计分析
所得数据为三次独立重复试验的平均值，误差采用标准偏差（standard deviation，SD）表示。数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析和Duncan多重比较法分析，图表采用Excel 2013绘制。
代谢组学数据处理：原始数据导入代谢组学处理软件progenesis QI（Waters Corporation，Milford，USA）进行处理，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵，保留非零值50%以上的峰；并对样品数据进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriimination analysis，OPLS-DA）分析；采用HMDB、METLIN等代谢组数据库（http：//www.hmdb.ca/;https：//metlin.scripps.edu）进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 发酵菌种对发酵薏米乳中营养物质含量的影响
由表2可知，不同菌种对发酵薏米乳的蛋白质、脂肪、可溶性固形物含量没有显著影响（P＞0.05）。说明发酵菌种的改变不会引起薏米乳产品蛋白组、脂肪、可溶性固形物含量的总体变化。而对薏米乳样品中的多糖、三萜类化合物含量有一定的影响。其中经植物乳杆菌发酵的薏米乳中三萜类化合物含量较高，为26.19 mg/L，经保加利亚乳杆菌发酵的薏米乳中多糖含量较高，为34.17 mg/L。
表2 发酵菌种对发酵薏米乳产品营养成分及功能物质含量的影响
Table 2 Effect of fermentation strains on the content of nutrients and functional substances in fermented coix beverage
注：小写字母不同代表差异显著（P＜0.05）。下同。
2.2 发酵菌种对发酵薏米乳质构特性的影响
表3 发酵菌种对发酵薏米乳质构特性的影响
Table 3 Effect of fermentation strain on texture characteristics of fermented coix beverage
由表3可知，不同菌种发酵可以改变发酵薏米乳的质构特性，总体来看，经保加利亚乳杆菌发酵的薏米乳其粘力、胶着性以及黏度较大（P＜0.05），说明保加利亚乳杆菌发酵的薏米乳产粘性物质较多，薏米乳的结构较紧密，产品较稳定，而经植物乳杆菌发酵的薏米乳产品结构较松散，瑞士乳杆菌发酵的薏米乳质构特性居中。该结果表明了使用保加利亚乳杆菌发酵的薏米乳质构特性较好。
2.3 发酵菌种对发酵薏米乳电子舌味感的影响
对不同菌种发酵的发酵薏米乳样品进行电子舌味感分析，结果如图1所示。
图1 不同菌种发酵薏米乳电子舌味感雷达图
Fig.1 Radar chart of electronic tongue taste of fermented coix beverage by different strains
从图1可以看出，不同发酵菌种发酵的薏米乳的味感指标存在明显差异，其中甜味、酸味、鲜味差异偏大（P＜0.05），苦味、涩味无明显差异（P＞0.05）。经瑞士乳杆菌发酵的薏米乳显出较大的鲜味，保加利亚乳杆菌发酵的薏米乳甜味值和酸味值相对较高（P＜0.05）。而保加利亚乳杆菌和植物乳杆菌发酵的薏米乳鲜味相似，没有明显差异（P＞0.05）；瑞士乳杆菌和植物乳杆菌发酵的薏米乳甜味和酸味相似，无明显差异（P＞0.05）。
对于不同发酵菌种发酵的薏米乳样品味感值的差异产生原因可能是不同菌种的代谢产物不同导致的。保加利亚乳杆菌通常被用于酸奶的发酵中，其在牛乳中进行发酵，可以产生二乙酰和乙醛等香气成分，从而产生独特的口感[27]。试验中，保加利亚乳杆菌发酵的薏米乳酸味值较高可能由于保加利亚乳杆菌更加适于在薏米乳中发酵，发酵条件适宜，生长速度较快，所以产酸增多，导致薏米乳酸味值较大。而瑞士乳杆菌有较好的发酵适应性，其发酵代谢的薏米乳中可能产生大量鲜味物质。
2.4 发酵菌种对发酵薏米乳代谢产物的影响
2.4.1 发酵薏米乳样品主成分分析
分别对保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌以及植物乳杆菌发酵的发酵薏米乳样品进行非靶向代谢组学的测定，对得到的数据进行主成分分析，可以得出三种不同发酵菌种发酵的薏米乳样品的差异性结果见图2，其中距离越大代表薏米乳样品间的差异越大。由图2可知，质控样本点基本重合，可以得出试验的稳定性较高，具有可靠性。三组样品组间显示较大区别，组内显示出了一定的聚集性。特别地，植物乳杆菌发酵的薏米乳样品与其他两组样品差异较大，而保加利亚乳杆菌和瑞士乳杆菌发酵的薏米乳差异较小。说明经植物乳杆菌发酵的薏米乳与其他两组样品的代谢产物差异较大，为下面的进一步分析提供了可视化的依据。
图2 正负离子模式下不同菌种发酵薏米乳样品主成分分析得分图
Fig.2 Principal component analysis score chart of different strains of fermented coix beverage in positive and negative ion mode
A：保加利亚乳杆菌发酵；B：瑞士乳杆菌发酵；C：植物乳杆菌发酵；QC：质控。
2.4.2 不同菌种发酵薏米乳样品的差异代谢产物分析
三组薏米乳样品差异代谢集Venn图见图3。由图3可知，重叠部分表示多个分组共有的差异代谢产物数目，没有重叠部分代表了差异代谢组中所特有的差异代谢物数目。该图从宏观上反映了代谢产物的特性。其中植物乳杆菌中有31种特有的差异代谢产物。此外，三组差异代谢产物所共有的代谢产物有38种，说明此38种代谢产物受发酵菌种的种类影响较大。
图3 不同菌种发酵薏米乳样品维恩图
Fig.3 Venn diagram of fermented coix beverage by different strains
A：保加利亚乳杆菌发酵；B：瑞士乳杆菌发酵；C：植物乳杆菌发酵。
不同菌种发酵的薏米乳样品的差异代谢产物聚类热图见图4。
图4 不同菌种发酵的薏米乳样品差异代谢产物聚类热图
Fig.4 Heat map of differential metabolites in fermented coix beverage by different strains
A：保加利亚乳杆菌发酵；B：植物乳杆菌发酵；C：瑞士乳杆菌发酵。
通过对不同菌种发酵的薏米乳样品进行非靶向代谢组学分析，共检测到了947种差异代谢产物，采用T检验结合正交最小偏二乘判别分析的方法，筛选出组间差异代谢物（同时满足VIP＞1，P＜0.05），并对其进行鉴定。由图4可知，从总体上来看，植物乳杆菌发酵的薏米乳中代谢产物与其他两组差异较大，该结果与PCA相符。其中经植物乳杆菌发酵的薏米乳样品与保加利亚乳杆菌发酵的薏米乳样品相比，共检测出121种差异代谢产物。植物乳杆菌发酵的薏米乳样品与瑞士乳杆菌发酵的薏米乳样品相比，共检测出97种差异代谢产物。其中植物乳杆菌发酵的薏米乳样品中代谢产物与其他两组样品相比，均呈显著上调的差异代谢产物41种，包括短肽：精氨酸-谷氨酸-精氨酸-甘氨酸（Arg-Gln-Arg-Gly）；精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-色氨酸（Arg-Ala-Lys-Trp）；脯氨酸-异亮氨酸-脯氨酸（Pro-Ile-Pro）；L-苯丙氨酸-L-脯氨酸（L-Phe-L-Pro）；吲哚乙酸、泛酸、亚油酸、β-柠檬酰-L-谷氨酸；脂类：脑磷脂（即磷脂酰乙醇胺，phosphatidyl ethanolamine，PE）（16∶1（9Z）/P-18∶1（11Z））、PE（16∶1（5Z）/16∶1（5Z））、PE（15∶0/22∶4（7Z，10Z，13Z，16Z））等。其中均呈显著下调的差异代谢产物23种。
通过对不同发酵菌种发酵的薏米乳样品进行非靶向代谢组学分析可以得出，与其他两组相比植物乳杆菌发酵的薏米乳中的短肽类物质显著增加，脂类物质有所减少。这可能是植物乳杆菌的发酵可以更多分解薏米乳中的蛋白质转化成短肽以及氨基酸等物质。短肽是薏米乳中的功能性物质，研究表明短肽具有降血压、抗氧化等多种功能性作用[28]，通过植物乳杆菌的发酵，其短肽的增多也一定程度地表明了植物乳杆菌发酵的薏米乳更具有营养价值。
3 结论
本研究分别对不同菌种发酵薏米乳产品的品质特性及差异代谢产物进行了较全面的分析，研究了菌种对薏米乳发酵产生的影响。植物乳杆菌发酵的薏米乳可以增加薏米乳中的三萜类化合物含量，保加利亚乳杆菌发酵可以增加薏米乳中的多糖含量；从发酵薏米乳的品质特性可以看出，保加利亚乳杆菌发酵的薏米乳具有较好的粘力、胶着性以及黏度，结构稳定性高；瑞士乳杆菌发酵的薏米乳口感较好。代谢组学技术可以得到全面准确性较高的差异代谢产物，为研究不同菌种对发酵薏米乳中代谢产物的影响提供理论依据。正负离子扫描下的基峰图显示三种不同发酵菌种发酵的薏米乳峰图存在较大差异，其中非靶向代谢组学试验共检测出947种代谢产物，其中植物乳杆菌发酵的薏米乳样品中检测到更多的短肽类化合物、吲哚乙酸、泛酸、亚油酸、β-柠檬酰-L-谷氨酸以及脑磷脂PE（16∶1（9Z）/P-18∶1（11Z））、PE（16∶1（5Z）/16∶1（5Z））、PE（15∶0/22∶4（7Z，10Z，13Z，16Z））等多种功能性成分，说明植物乳杆菌发酵的薏米乳营养价值相对较高。
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