会理石榴（Punica granatum L.）是四川攀西地区的道地特色农产品，既是“无公害”的中国国家地理标志产品，又是中医药、藏医药中常用临床药物，具有良好的“药食同源”之性[1]。现代研究表明，石榴中不仅含有丰富的酚、酮及有机酸类化合物，还富含生物碱和各种人体所需的氨基酸[2-4]。
近年来，随着社会经济发展和人民生活水平的提高，以天然药食资源开发的保健果醋正成为市场新宠。保健果醋不仅在营养、风味、口感上都比传统食醋更佳，而且极大地保留了水果中富含的维生素、氨基酸、矿物质等营养成分，保健功效显著，市场前景广泛[5-7]。目前，以石榴为资源开发的保健果醋鲜有报道，国内外研究主要集中在石榴汁饮料的开发与生产方面。CASSANO A等[8]运用两步膜法建立了一种适用于浓缩石榴汁生产的集成膜工艺，所得浓缩果汁总可溶性固形物含量为520 g/kg，多酚及花色苷的含量分别为16.5%和11.7%，工艺较好的保留其抗氧化活性；刘志国等[9]研究报道石榴茶提取物能明显提高小鼠的运动能力，增加心肌抗氧化指标，显示出较好的抗疲劳抗氧化作用。因此，在前期研究的基础上[10-15]，许世林等[16]创新提出将会理石榴与红曲组合，通过液态发酵等方式制备出石榴红曲保健果醋。
本研究拟在《保健食品功能学评价程序和检验方法》[17]的指导下，对石榴红曲保健果醋的主要营养成分进行分析；同时，分别建立小鼠高糖高脂模型、D-半乳糖氧化损伤小鼠模型，考察石榴红曲果醋的降糖、降脂及体内抗氧化活性，以期为石榴红曲保健果醋相关活性物质的质量控制以及进一步产品开发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
石榴红曲保健果醋[16]：实验室自制。
1.1.2 试剂
磺基水杨酸、芦丁（均为分析纯）：成都科龙试剂有限公司；茚三酮溶液；17种氨基酸标准标样、没食子酸标准品：美国Sigma公司；福林-酚试剂：上海研域生物科技有限公司；小鼠胰岛素（insulin，Ins）酶联免疫分析试剂盒：美国RD公司；空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）试剂盒、总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒、甘油三酯（triglyceride，TG）试剂盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）试剂盒及低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.1.3 实验动物
美国癌症研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠[无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级，18～22 g，全雄，动物生产许可证号：SCXK（川）2015-030]：四川省医学科学院实验动物研究所。
1.2 仪器与设备
S-433D全自动氨基酸分析仪：德国Sykam公司；SN-3001酶标仪：美国Thermo Formo公司；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；PHS-3C-3E数显台式酸度计：上海雷磁仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 石榴红曲保健果醋营养成分分析
氨基酸含量：参考GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》[18]。
总黄酮含量：参考白立敏等[19-20]的测定方法。
总酚含量：参考吴佳[21]的测定方法。
还原糖含量：参照GB/T 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》中的3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定[22]。
总酸含量：参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法测定[23]。
可溶性固形物含量：采用手持糖度计测定[24]。
1.3.2 石榴红曲保健果醋的功能学评价
（1）石榴红曲保健果醋的降糖、降脂活性研究
参考赵兴冉等[25-26]的方法，建立小鼠高糖、高脂复合模型。具体方法：取ICR小鼠，按体质量随机分为两组，除10只为空白组外，其余均为模型组。模型组小鼠尾静脉注射四氧嘧啶溶液60 mg/kg进行血糖造模（空白组注射等体积生理盐水），造模72 h后，小鼠尾尖取血，测定小鼠空腹血糖（FBG），选取空腹血糖浓度≥11.0 mmol/L的合格小鼠进行实验。将合格小鼠按体质量分为模型组、阳性对照组（二甲双胍0.25 g/kg）和红曲石榴保健果醋高（10.0 mL/kg）、中（5.0 mL/kg）、低（2.5 mL/kg）剂量组，每组10只。每日按分组及设计剂量灌胃给药（空白组与模型组给予等体积生理盐水），给药体积为10 mL/kg，每日1次；同时灌胃给予高脂高糖乳液（猪油20%、胆固醇10%、猪胆酸钠0.5%、蔗糖20%）0.2 mL/只，连续灌胃30 d。各组小鼠末次给药后1 h，眼眶取血，分离血清，按试剂盒说明书分别测定小鼠FBG、TC、TG、HDL-C和LDL-C含量及Ins活性，并计算胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index，IAI），其计算公式如下：
IAI=1/（FBG×Ins）
（2）石榴红曲保健果醋的体内抗氧化功能研究
参考王元等[27-28]的方法，建立小鼠D-半乳糖氧化损伤模型。具体方法：取ICR小鼠，按体质量随机分为空白组、模型组、阳性对照组（仙牌灵芝茶5.0 g/kg）和红曲石榴保健果醋高（10.0 mL/kg）、中（5.0 mL/kg）、低（2.5 mL/kg）剂量组，每组10只。除空白组外，每组小鼠颈背部皮下注射D-半乳糖生理盐水溶液300 mg/kg（空白组注射等体积生理盐水），连续注射30d。实验期间按设计剂量和分组同步灌胃给药（空白组与模型组给予等体积生理盐水），给药体积为10 mL/kg，每日1次。各组小鼠末次给药后1 h，眼眶取血，分离血清，按试剂盒说明书分别测定血清中GSH、MDA含量及GSH-Px、CAT、SOD活性。
2 结果与分析
2.1 石榴红曲保健果醋营养成分分析
2.1.1 氨基酸含量分析
石榴红曲保健果醋中游离氨基酸组成及含量见表1。
表1 石榴红曲保健果醋中游离氨基酸组成及含量
Table 1 Composition and contents of free amino acid in pomegranate Monascus health fruit vinegar
续表
注：“*”表示必需氨基酸。
由表1可知，从石榴红曲保健果醋中共检测出17种氨基酸，其中9种为人体必需氨基酸（其中组氨酸为婴幼儿的一种必需氨基酸），必需氨基酸含量占游离氨基酸总量的49%（＞40%），满足联合国粮农组织（food and agriculture organization of the united nations，FAO）/世界卫生组织（world health organization，WHO）提出的理想蛋白质标准[29]。石榴红曲保健醋中各必需氨基酸在总氨基酸中的占比与FAO/WHO规范的氨基酸模式谱[29]进行比较，结果见表2。
表2 石榴红曲保健果醋中人体必需氨基酸比例与模式谱比较
Table 2 Comparison of proportion of essential amino acids in pomegranate Monascus health fruit vinegar and the amino acid pattern spectrum
由表2可知，各必需氨基酸占比均达到FAO/WHO标准，表明石榴红曲保健果醋具有较好的营养价值。此外，甜味氨基酸丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、脯氨酸的总含量占游离氨基酸总含量的43.51%，芳香味氨基酸缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸的总含量占游离氨基酸总含量的33.57%，这使得石榴红曲保健果醋口感微甜，气味清香，饮用有较好的口感，也可以作为调味品进行二次开发利用。
2.1.2 其他营养成分分析
葡萄糖标准曲线的回归方程为y=0.163 3x+0.027 8，相关系数R2=0.994 6；总黄酮的标准曲线的回归方程为y=0.007 4x+0.009 1，相关系数R2=0.995 5；总酚的标准曲线为y=0.150 8x-0.012 7，相关系数R2=0.995 5；R2均＞0.99，可用于石榴红曲保健果酒中还原糖、总黄酮及总酚含量的测定。石榴红曲保健果酒中还原糖、总酸、可溶性固形物、总黄酮及总酚含量的测定结果见表3。
表3 石榴红曲保健果醋中其他营养成分含量
Table 3 Content of other nutrients in pomegranate Monascus health fruit vinegar
由表3可知，石榴红曲保健果醋中总酸含量为5.82 g/100 mL，可溶性固形物含量为10.67g/100mL，符合GB/T18187—2000《酿造食醋》要求；同时测得石榴红曲保健果醋中活性成分还原糖含量为15.74 g/100 mL，总黄酮含量为8.25 mg/mL，总酚含量为20.82 mg/mL。结合文献调查[30]，提示果醋中富含的总酚、总黄酮类物质可能具有心血管活性及抗氧化的潜在活性，但需进一步功能学评价来验证。
2.2 石榴红曲保健果醋的功能学评价
2.2.1 石榴红曲保健果醋的降糖、降脂活性研究
表4 石榴红曲保健果醋对小鼠糖代谢及胰岛素抵抗指数的影响
Table 4 Effect of pomegranate Monascus health fruit vinegar on glucose metabolism and insulin resistance indexes in mice
注：与模型组比较，“*”表示差异显著（P＜0.05）；“**”差异极显著（P＜0.01）。下同。
由表4及表5可知，与空白组比较，经小剂量注射四氧嘧啶和高脂高糖乳液喂养小鼠30 d后，模型组小鼠血清FBG、TC、TG和LDL-C含量显著升高（P＜0.01），Ins活性（P＜0.05）和HDL-C含量（P＜0.01）显著降低，小鼠胰岛素敏感指数（IAI）显著下降（P＜0.01），表明小鼠糖代谢和脂质代谢均出现紊乱，建模成功。与模型组相比较，阳性对照组和石榴红曲保健果醋均能降低小鼠FBG、TC、TG和LDL-C含量，升高HDL-C含量，提高机体的IAI敏感指数，其中高剂量（10.0 mL/kg）的石榴红曲保健果醋效果明显（P＜0.05），但对血清Ins活性没有显著影响（P＞0.05）。
表5 石榴红曲保健果醋对小鼠脂质代谢的影响
Table 5 Effect of pomegranate Monascus health fruit vinegar on lipid metabolism of mice
2.2.2 石榴红曲保健果醋的体内抗氧化功能研究
表6 石榴红曲保健果醋对小鼠抗氧化功能的影响
Table 6 Effect of pomegranate Monascus health fruit vinegar on antioxidant function of mice
由表6可知，与空白组比较，经连续30 d皮下注射D-半乳糖后，模型组小鼠血清中的SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH含量均显著降低（P＜0.01），MDA含量显著升高（P＜0.01），表明模型小鼠体内抗氧化系统功能受损，建模成功。与模型组比较，阳性对照组和石榴红曲保健果醋均能降低小鼠血清中MDA的含量，升高CAT、GSH-Px、SOD活性及GSH含量，其中高剂量（10.0mL/kg）石榴红曲保健果醋效果显著（P＜0.05），说明石榴红曲保健具有较好的抗自由基损伤、降低脂质过氧化物形成、增强机体抵抗氧化损伤的作用。
3 结论
本研究从石榴红曲保健果醋中共检测出17种氨基酸，总氨基酸含量为171.9 mg/100 g，其中9种为人体必需氨基酸，占游离氨基酸总量的49%，满足FAO/WHO提出的理想蛋白质标准，且各必需氨基酸占比均达到FAO/WHO标准。相关活性物质检测结果表明，石榴红曲保健果醋营养丰富，总黄酮、总酚、还原糖、总酸和可溶性固形物的含量分别为8.25 mg/mL、20.82 mg/mL、15.74 g/100 mL、5.82 g/100 mL，18.67 g/100 mL。功能学评价结果表明，10.0 mL/kg石榴红曲保健果醋能明显降低高糖高脂小鼠血清中FBG、TC、TG和LDL-C含量，升高HDL-C含量，提高机体IAI，具有降血糖和血脂功能；明显降低小鼠血清MDA含量，升高CAT、GSH-Px、SOD活性及GSH含量，具有体内抗氧化活性。
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