二氧化硫保鲜剂预处理对葡萄酒香气和生物胺含量的影响

刘静芳1,2,张博钦1,2,朱本忠1,段长青1,2,燕国梁1,2*

(1.中国农业大学 食品科学与营养工程学院葡萄与葡萄酒研发中心,北京 100083;2.农业农村部葡萄与葡萄酒重点实验室,北京 100083)

摘 要:为了研究酿酒葡萄适宜的储藏条件,以赤霞珠葡萄为原料,在低温条件下添加不同浓度二氧化硫(SO2)保鲜剂储藏1~4周后,测定酿造所得葡萄酒的香气物质及生物胺含量。结果表明,SO2处理可降低果实腐烂及落果率(3周之内)。储藏时间对葡萄酒香气品质影响最大,延长储藏时间会导致葡萄酒香气品质下降。高浓度SO2(4 g SO2/kg葡萄)处理会增加酯类和苯乙醇的含量,但也使乙酸乙酯含量过高,给葡萄酒带来不良气味。果实储藏后各试验组中生物胺的含量均有所升高(与对照相比),而低浓度SO2试验组中生物胺含量较低。综上所述,低温条件下添加SO2能够在一定时间内保证赤霞珠葡萄的酿造品质,但应尽量缩短储藏时间,最好控制在1周之内。

关键词:赤霞珠葡萄;储藏;二氧化硫;葡萄酒香气;生物胺

葡萄酒是用新鲜的酿酒葡萄或葡萄汁经完全或部分发酵酿成的酒精饮料,随着我国人民生活水平的提高,葡萄酒受到越来越多的欢迎[1]。根据国际葡萄与葡萄酒组织(international organisation of vine and wine,OIV)公布的数据显示,2016年中国葡萄酒消费量初步统计达17.2亿L,增幅位居全球之首[2]。葡萄酒的品质很大程度上取决于其原料—葡萄的品质[3]。与鲜食葡萄不同,酿酒葡萄具有皮厚、粒小、糖度和单宁含量高的特点[4]。一般情况下,采收后的酿酒葡萄会立即进行除梗破碎,并进行发酵,但有时葡萄采收地与生产酿造地距离较远,需要进行运输,在这一过程中不恰当的储藏方式可能会造成酿酒葡萄的腐烂和品质的变化,进而对葡萄酒的品质产生不利的影响。而目前对葡萄储藏方式的研究主要集中在鲜食葡萄[5],而对于酿酒葡萄储藏方式的研究却还是空白。

目前,最为常见的储藏方式就是低温储藏和添加SO2保鲜剂储藏。低温是储藏葡萄(水果)最主要的方式,低温(4 ℃)能够抑制水果呼吸作用和乙烯的合成,从而延缓呼吸高峰期的到来,实现保鲜目的[6]。而在葡萄采后储藏和运输过程中除了葡萄果实自身的变化外,还会受到灰霉菌以及各种细菌(醋酸菌)的侵袭[7]。SO2保鲜剂不仅对灰霉菌有强烈的抑制作用,抑制多酚氧化酶等酶的活性,而且可以降低果实与果梗的呼吸强度,提高果实耐贮性,延长葡萄保鲜期[8-9]。因此,采用保鲜剂结合低温能够有效抑制葡萄果实的呼吸作用以及杂菌的生长与繁殖,是储藏鲜食葡萄的主要方式。

本研究借鉴鲜食葡萄的保鲜方法,在低温(4 ℃)条件下,采用不同剂量的SO2保鲜剂对酿酒葡萄(赤霞珠葡萄)进行预处理,进而进行4周的储藏,将储藏不同周数的红葡萄分别进行酒精和苹乳发酵,通过测定葡萄酒主要成分,香气产物以及生物胺的含量变化来评价该储藏方式的可行性,为酿酒葡萄的储藏提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤霞珠葡萄果实(还原糖含量为230.55 g/L):河北昌黎产区;葡萄专用快速释放型SO2保鲜剂(2号保鲜剂):天津绿达保鲜工程技术有限公司;酿酒酵母(ADT):安琪酵母股份有限公司;乳酸菌(Viniflora® Oenos):丹麦科汉森公司。

葡萄糖、果糖、甘油、乙醇、苹果酸、柠檬酸、硼酸、硼砂、无水乙酸钠(纯度均>99%):北京化学试剂公司;甲醇、正己烷(纯度99.9%):美国Tedia公司;乙氧亚甲基丙二酸二乙酯(diethyl ethoxymethylene malonate,DEEMM)、酒石酸、琥珀酸、乳酸、乙酸及生物胺标准品(纯度均>99%):美国Sigma-Aldrich 公司;香气化合物标准品(纯度99%):瑞士Fluka公司、美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

装备有示差折光检测器和紫外分光检测器的Agilent 1200 Series 高效液相色谱仪、Agilent 6890 气相色谱仪、Agilent 5975B质谱仪、聚二甲基硅氧烷/碳筛/二乙烯苯(PDMS/CAR/DVB)萃取头和ZORBAX SB-C18色谱柱:美国安捷伦科技有限公司;HPX-87H色谱柱:美国Bio-Rad公司;UV2450紫外可见分光光度计:日本岛津公司;FA1104电子天平:上海恒平科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 赤霞珠葡萄果实贮藏及酿造流程

将赤霞珠葡萄分别储藏1、2、3和4周,均设SO2无添加(1-N、2-N、3-N、4-N)、低浓度(2 g SO2/kg葡萄)(1-L、2-L、3-L、4-L)和高浓度(4 g SO2/kg葡萄)(1-H、2-H、3-H、4-H)3个梯度,以新鲜的葡萄为对照(0-N),共13个分组,每组设3个重复。将各试验组的赤霞珠葡萄分别放入密封的塑料袋中,扎口储藏,储藏温度为4 ℃,每隔一周取所储藏的赤霞珠葡萄进行葡萄酒发酵试验,发酵罐为3 L玻璃发酵罐。酒精发酵及苹乳发酵结束后,分别收集发酵液,于8 000 r/min条件下离心10 min,取上清液储藏于-20 ℃冰箱,用于各种指标的测定。酿造流程如下:

1.3.2 测定方法

腐烂率及落果率计算公式如下:

主要代谢产物测定[10]:使用高效液相色谱仪进行主要代谢产物的测定。离子交换色谱柱为HPX-87H(300 mm×7.8 mm),其中葡萄糖、果糖、甘油、乙醇的测定使用示差折光检测器,进样量为20 μL,柱温45 ℃,分析时间30 min;主要有机酸(酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、乙酸)的测定采用紫外分光检测器,进样量为10 μL,柱温60 ℃,分析时间30 min。

生物胺的测定[11]:取2 mL离心管,依次加入1 mol/L硼酸-硼砂缓冲液(pH 9.0)430 μL,样品400 μL,衍生试剂(乙氧亚甲基丙二酸二乙酯600 μL和10 mL色谱纯甲醇混合)300 μL,混匀后于超声波中冰浴反应30 min,再置于75 ℃水浴条件下1.5 h以终止反应,经0.22 μm有机系尼龙滤膜过滤后进入高效液相色谱检测。色谱柱为ZORBOX SB-C18(50 mm×3.0 mm),柱温16 ℃,进样量2 μL,分析时间25 min。

香气化合物的测定[12]:使用气相色谱仪和质谱仪进行香气物质的测定。将5 mL发酵样品加入到15 mL样品瓶中,同时加入1 g NaCl、10 μL内标(4-甲基-2-戊醇)后迅速用带有聚四氟乙烯隔垫的盖子密封。将样品瓶置于德国Gerstel多功能自动进样系统的托盘上,系统将自动完成样品萃取及进样。在40 ℃下平衡30 min,待瓶中的气-液相香气物质达到平衡后,将已活化或热解析过的聚二甲基硅氧烷/碳筛/二乙烯苯(PDMS/CAR/DVB)萃取头插入样品瓶的顶空部分,萃取头距离液面1 cm。在40 ℃恒温条件下搅拌萃取30 min,使样品瓶中的香气物质达到气-固和气-液平衡。然后将萃取头插入进样口,250 ℃热解吸8 min,不分流进样。载气为高纯氦气(纯度99.999%),流速:1 mL/min,自动进样。柱温箱升温程序:50 ℃保持1 min,以3 ℃/min的速度升温至220 ℃,保持5 min。质谱接口温度为280 ℃,离子源温度为230 ℃,电子电离(electron ionization,EI)源,离子源能量70 eV,质量扫描范围为29~350 m/z。

香气物质的定性和定量分析:利用质谱全离子扫描图谱,对于已有标准品的物质,依据本试验已建立的相同色谱条件下该化合物的保留时间、保留指数和质谱信息进行定性分析,然后通过各香气物质在模拟酒溶液中的标准曲线来进行定量。

2 结果与分析

2.1 不同剂量SO2处理葡萄后腐烂率及落果率曲线

赤霞珠葡萄果实随储藏时间延长,其腐烂与落果情况分别见图1。由图1可知,腐烂率和落果率均随储藏时间的延长而升高,未添加SO2保鲜剂的葡萄果实,腐烂速度和落果速度最快。添加低浓度SO2保鲜剂的葡萄果实腐烂率和落果率曲线最为平缓,前三周低浓度与高浓度SO2储藏的葡萄差异不显著,腐烂率和落果率约为2%~5%,但储藏至第4周时,葡萄果实的腐烂率和落果率显著提高,且高浓度SO2储藏的葡萄腐烂率(13.6%)明显高于低浓度SO2试验组(8.2%)。以上结果表明,添加SO2保鲜剂在储藏期内可以减缓葡萄果实腐败,降低葡萄果实的腐烂和落果率,但是时间应该控制在3周以内。

图1 赤霞珠葡萄在储藏期间的腐烂率(A)和落果率(B)情况
Fig.1 Decay rates(A)and drop rates(B)of Cabernet Sauvignon during storage

2.2 不同剂量SO2处理葡萄样品酒精发酵后主代谢产物分析

酒精发酵结束后测定各试验组葡萄酒中葡萄糖、果糖、乙醇、甘油以及有机酸(乙酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸和琥珀酸)的含量,结果见表1。

由表1可知,所有酒样均顺利完成发酵过程(还原糖总量降至4 g/L以下)。对照组(0-N)中甘油含量为7.09 g/L,随着葡萄果实储藏时间的延长,葡萄酒中甘油含量下降,使得葡萄酒的圆润感下降[13]。而不同储藏方式对葡萄酒的乙醇产量没有显著影响。乙酸是葡萄酒酒精发酵的副产物,GB 15037—2006《葡萄酒》中规定,葡萄酒挥发酸(以乙酸计)含量≤1.2 g/L。有研究表明,乙酸质量浓度为0.2~0.7 g/L时,对葡萄酒的香气有积极贡献[13]。本研究中所有样品中乙酸含量均<1.2 g/L,但随着储藏时间的延长挥发酸含量开始上升,3周后乙酸质量浓度>0.7 g/L。挥发酸浓度增加可能是腐烂果所感染的细菌及腐败菌引起的,添加低浓度SO2可在一定程度上抑制葡萄的腐烂,减少挥发酸的产生,但也应控制在2周之内。酒石酸是葡萄酒酸味的重要来源,参与葡萄酒味感的平衡[14]。从第2周起(除2-L),与对照相比,各个试验组葡萄酒中酒石酸含量均显著下降。这可能是由于处理组的葡萄醪中SO2含量较高,在发酵前期与酒石酸结合沉淀所致[14]。其他有机酸在葡萄酒中的含量无显著性差异(P>0.05)。

表1 酒精发酵结束后各试验组酒样中的主代谢产物含量
Table 1 Main fermentation products contents of wine samples in each treatment groups after alcoholic fermentation

注:表中数据均以3个生物学重复平均值表示;同一化合物含量后所标识不同的字母表示不同样本之间存在显著性差异(P<0.05)。

2.3 不同剂量SO2处理葡萄样品酒精和苹乳发酵后香气成分分析

2.3.1 香气物质的分类分析

各试验组中赤霞珠葡萄经过酒精发酵和苹乳发酵后,共检测到42种挥发性香气物质,其中酒精发酵后重要的香气物质见表2,苹乳发酵后的重要香气物质见表3。

由表2可知,高级醇是葡萄酒发酵香的重要组成成分,当其含量为250~350 mg/L时,能够增加葡萄酒香气的复杂性,改善其感官品质[15]。本试验所有样品的高级醇含量均低于350mg/L,能够一定程度上增加了葡萄酒香气的复杂性。其中,对照组高级醇含量最高(348.19 mg/L),而储藏2周后的各试验组中高级醇含量均<300 mg/L。苯乙醇具有令人愉快的玫瑰和蜂蜜香气[16],对葡萄酒的香气轮廓具有积极作用。对照组及储藏1周的葡萄酒样品中(除1-N外),苯乙醇含量均>100 mg/L,使得葡萄酒的花香和甜香更为浓郁。但是随着储藏时间的延长,苯乙醇的含量会出现不同程度的下降,不利于葡萄酒的香气品质提升。

酯类物质是葡萄酒中仅次于高级醇的第二大类挥发性物质,这类物质对葡萄酒的果香具有重要的贡献[17]。高浓度SO2处理会促使葡萄酒中乙酸乙酯含量升高,储藏1周后乙酸乙酯含量为107.8 mg/L,是对照组0-N(80.7 mg/L)的1.34倍。而储藏4周后,葡萄酒中乙酸乙酯的含量达到152.9 mg/L,是对照组的1.89倍,这会掩盖葡萄酒本身水果类香气,对葡萄酒产生负面影响[18]。低浓度SO2处理的酒样在第2周时乙酸乙酯含量为78.9 mg/L,但从第3周起,含量明显上升,为110.6~163.1 mg/L。表明即便添加二氧化硫保鲜剂能够一定程度的抑制葡萄的腐烂,但是长时间储藏依旧会导致乙酸乙酯含量的显著升高,对葡萄酒的最终品质带来不利影响。此外,随着葡萄果实储藏时间的延长,葡萄酒中乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯的含量有所增加,并且高浓度的SO2处理的试验组比低浓度试验组更能够促进上述酯类物质的积累,可能是由于二氧化硫抑制了其他杂菌的生长,导致酿酒酵母产酯代谢的增强。

由表3可知,苹乳发酵结束后,各试验组的香气物质出现了不同程度的下降,但是大体趋势与酒精发酵相一致。综上所述,随着储藏时间的延长,高级醇类物质明显下降,而大多数酯类物质的含量有所上升。添加高浓度的二氧化硫保鲜剂能够提高一些重要酯类物质的含量,如乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等,但是却会导致乙酸乙酯含量的超过阈值,进而为葡萄酒带来一些负面的影响。

2.3.2 香气物质的主成分分析

对各试验组酒精及苹乳发酵后的香气物质情况进行主成分分析(principal component analysis,PCA)以揭示各试验组之间的差异见图2。由图2可知,酒精发酵结束后,对照组(0-N)位于第三象限,而其他处理组均位于第一、二、四象限,这表明酒精发酵后不同试验组与对照组的香气轮廓有明显的差异。对照组位于PC1和PC2的负半轴,与香茅醇、异丁醇和苯酚密切相关。而高浓度二氧化硫处理的试验组(除4-H外)与大部分酯类物质和脂肪酸类物质相关性较强,能为葡萄酒提供香蕉味、玫瑰花香、苹果味、草莓味等令人愉快的花香果香气味,并增加葡萄酒香气的复杂性[19]。苹乳发酵结束后,对照组(1-N)与试验组1-N和1-L均位于第四象限,与己酸乙酯、己酸、1-己醇密切相关。而其他试验组(除2-L和2-N外)具有相似的香气轮廓,与乙酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸甲酯等物质相关性较强。上述结果表明,随着储藏时间的延长,葡萄酒的香气轮廓发生了变化。当储藏时间超过三周后,试验组的香气物质与对照组差别明显,而储藏1周对香气物质的影响最小。

图2 酒精发酵(A)和苹乳发酵(B)后香气物质主成分分析
Fig.2 Principal components analysis of aroma compounds in wine samples after alcoholic fermentation(A)and malolactic fermentation(B)

2.3.3 香气物质双因素方差分析

以上结果表明,SO2浓度(F1)和储藏时间(F2)是造成干红葡萄酒香气物质含量差异的两个主要因素。采用双因素方差分析(two-way variance analysis)进一步探究哪种因素对香气含量的影响更为显著。

双因素方差分析表明,SO2添加浓度和储藏时间对以下香气物质变化有显著的协同作用(P<0.01):异戊醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、辛酸异戊酯、癸醛。而储藏时间对13种香气物质产生显著性影响见表4。由表4可知,从F值大小可以看出储藏时间对香气物质的影响比SO2浓度更加显著,如:乙酸异戊酯含量受SO2浓度和储藏时间的影响均显著(P<0.001),但储藏时间的影响更大(F1=24.716,F2=47.024)。苹乳发酵后的结果与酒精发酵后相似。以上结果表明储藏酿酒葡萄时,SO2添加浓度和储藏时间会显著影响葡萄酒的香气品质,其中储藏时间影响更大。因此,在优化SO2添加浓度的同时,应严格控制储藏时间。

表4 不同试验组中酒精发酵及苹乳发酵结束后酒样中香气物质的双因素方差分析
Table 4 Two-way variance analysis of aroma compounds of wine samples in different treatment groups after alcoholic fermentation and malolactic fermentation

注:“***”表示双因素方差分析的显著性水平(P<0.001);“**”表示双因素方差分析的显著性水平(0.001<P<0.01);“*”表示双因素方差分析的显著性水平(0.01<P<0.05)。

2.4 不同剂量SO2处理葡萄样品酒精发酵和苹乳发酵后生物胺含量

生物胺是葡萄酒发酵过程中的一类发酵副产物,其含量高低直接决定了葡萄酒的安全品质[19]。葡萄酒中的生物胺一部分来自于葡萄果实本身,另一部分则是发酵过程中由微生物对游离氨基酸脱羧产生[20]。本研究共检测到8种生物胺,包括乙醇胺、组胺、酪胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、精胺和亚精胺。酒精发酵以及苹乳发酵后各个酒样中生物胺含量分别见表5和表6。

表5 酒精发酵结束后葡萄酒中生物胺含量
Table 5 Biogenic amines contents in wines after alcoholic fermentation

注:表中数据均以3个生物学重复平均值表示;同一化合物含量后所标识不同的字母表示不同样本之间存在显著性差异(P<0.05)。

由表5可知,葡萄储藏时间在一周之内的试验组中组胺的含量最低(0.7 mg/L),而随着储藏时间的增加,大部分试验组中组胺的含量会有不同程度的增加(4.0~5.7 mg/L)。酒精发酵后,对照组(0-N)的生物胺总量为36.3 mg/L,而储藏1~4周的试验组中生物胺的含量均高于对照组,其中试验组4-H的生物胺总量最高,是对照组的1.46倍。这说明酿酒葡萄经过储藏后可能会增加葡萄酒中生物胺含量,进而导致葡萄酒的安全性产生不利影响。相比于高浓度SO2试验组,添加低浓度的SO2的能够一定程度上控制生物胺的升高,对果实储藏后的葡萄酒品质有积极作用。由表6可知,苹乳发酵后各试验组中生物胺含量都有不同程度的升高,其中4-H试验组苹乳发酵后(22.4mg/L)组胺的含量是酒精发酵后(5.4 mg/L)的4.1倍。而储藏时间在1周之内的试验组组胺的含量与对照组相似。因此,从葡萄酒的安全性角度考虑,葡萄储藏的时间应该尽量控制在1周之内,添加低浓度的SO2能够一定程度上降低葡萄酒生物胺的含量,具体的机制还需要进一步研究。

表6 苹乳发酵结束后葡萄酒中生物胺含量
Table 6 Biogenic amines contents in wines after malolactic fermentation

注:数据均以3个生物学重复平均值表示;同一化合物含量后所标识不同的字母表示不同样本之间存在显著性差异(P<0.05)。N:未检出。

3 结论

本研究以健康、成熟的赤霞珠葡萄为原料,在低温条件下(4 ℃),采用不同浓度SO2保鲜剂处理不同时间后将葡萄按照常规工艺进行酒精和苹乳发酵,研究SO2保鲜剂预处理对葡萄酒香气和生物胺含量的影响。研究结果表明,低温条件下,添加低浓度和高浓度的SO2均能够降低约4%葡萄腐烂率(3周之内)。储藏时间对葡萄酒香气品质影响最大,延长储藏时间会导致葡萄酒香气品质下降。除此之外,添加高浓度的二氧化硫还能够一定程度上增加葡萄酒中苯乙醇、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯的含量,为葡萄酒带来令人愉悦的花香和果香,增加葡萄酒香气的复杂性,但是会导致乙酸乙酯增加,对葡萄酒香气品质带来负面作用。果实储藏后各试验组中组胺和生物胺总量均有所升高(与对照相比),其中低浓度SO2试验组中组胺和生物胺含量最低,能够一定程度上保证葡萄酒的安全品质。综上所述,可以得出以下结论:在低温条件下(4 ℃),通过SO2保鲜剂预处理能够在一定时间内保证酿酒葡萄的酿造品质,但储藏时间应尽量缩短(控制在1周之内)。

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Effect of pretreatment of sulfur dioxide preservative on aroma and biogenic amines contents in wines

LIU Jingfang1,2,ZHANG Boqin1,2,ZHU Benzhong1,DUAN Changqing1,2,YAN Guoliang1,2*
(1.Centre for Viticulture and Enology,College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China;2.Key Laboratory of Viticulture and Enology,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Beijing 100083,China)

Abstract:In order to investigate the optimal storage conditions of wine grapes,the Cabernet Sauvignon after adding different concentrations of SO2 preservative was stored under low temperature conditions for 1-4 weeks,and the contents of aroma compounds and biogenic amines in wines were determined.The results showed that the fruit decay and fruit drop rate could be reduced by SO2 treatment(in 3 weeks).The storage time had the greatest impact on the aroma quality of wine,and prolonging the storage time would result in a decrease in wine aroma quality.The high concentration of SO2(4 g SO2/kg grape)could increase the contents of esters and phenylethyl alcohol,but also produce excessive ethyl acetate,which could result in negative odor to wines.After storage,the contents of biogenic amines in all treatment groups increased compared with the control,while the treatment group with the low concentration of SO2 had the relatively low biogenic amines contents.In summary,the addition of SO2 under the low temperature could guarantee the brewing quality of Cabernet Sauvignon in a certain period of time,but the storage time should be minimized,preferably within 1 week.

Key words:Cabernet Sauvignon;storage;sulfur dioxide;wine aroma;biogenic amines

中图分类号:TS261.1

文章编号:0254-5071(2020)04-0032-08

doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2020.04.007

引文格式:刘静芳,张博钦,朱本忠,等.二氧化硫保鲜剂预处理对葡萄酒香气和生物胺含量的影响[J].中国酿造,2020,39(4):32-39.

收稿日期:2019-08-13

修回日期:2019-12-01

基金项目:国家重点研发计划课题(2016YFD0400901);现代农业产业技术体系建设专项(CARS-29)

作者简介:刘静芳(1994-),女,硕士研究生,研究方向为食品生物技术。

*通讯作者:燕国梁(1976-),男,副教授,博士,研究方向为酿酒酵母分子生物学。