生物机体正常情况下拥有完整的氧化-抗氧化平衡机制，当外界条件破坏平衡引起机体发生氧化应激，破坏机体内生物大分子和加速老化，进而引发高血压、缺血性心脏病、关节炎、癌症等疾病[1]。
乳酸菌被公众认为是最安全的食品级微生物，具备抗过敏、缓解乳糖不耐症、提高机体免疫力等生理功能[1-2]。近几年，有专家指出氧化应激与慢性病等密切相关，乳酸菌属于天然的抗氧化剂，通过清除活性氧和自由基、螯合金属离子、多种氧化还原调控系统和激活抗氧化体系等途径发挥抗氧化作用，逐渐引起研究人员的广泛重视[3]。研究发现，乳酸菌具有明显的抗氧化作用，能清除自由基、提高抗氧化酶活力、螯合金属离子等[4]，且被大量体内外试验证实其良好的抗氧化活性[5]。目前研究热衷于检测乳酸菌不同部位的抗氧化能力，通过测定脂质过氧化抑制能力、自由基清除能力和动物学实验来评价抗氧化效果，其中自由基清除能力是应用较多的评价指标，包括清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羟基自由基、过氧化物、超氧阴离子的能力以及过氧化氢能力[6]。黄玉军等[7]对分离自长寿人群肠道6株乳酸菌体外抗氧化活性进行研究发现菌株发酵上清液的抗氧化活性总体要优于菌体和胞内提取物。王曦等[8]对35株乳酸菌的菌体、无细胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力进行研究，抗氧化活性物质较多分布在乳酸菌胞外分泌物中。姚杰玢等[9]也同样发现所研究的8株乳酸菌中发酵上清液对自由基的清除能力远高于完整细胞和无细胞提取物。
本研究拟通过测定羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH 自由基的清除率以及还原能力，对不同来源（干酪、生水牛乳、酸奶、牛乳房边缘）的28株乳酸菌胞外分泌物的体外抗氧化能力进行检测，并分析不同检测方法的相关性，评价不同乳酸菌抗氧化能力，为后期开发乳酸菌抗氧化制剂提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
实验中所用的28 株乳酸菌均保存在广西水牛研究所，其详细信息见表1。
表1 实验所用菌株
Table 1 Strains used in the study
1.1.2 化学试剂
铁氰化钾（分析纯）：天津市博迪化工有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、三氯化铁、无水乙醇（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；三氯乙酸、30%过氧化氢（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；DPPH（分析纯）：美国Sigma公司；维生素C（vitamin C，VC）（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
MRS肉汤培养基：青岛高科园海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-8000紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；SHP-150生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；PB-10 pH计：德国赛多利斯集团；SW-CJ-2F洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；YM 50立式压力蒸汽灭菌器：上海三申医疗器械有限公司；Biofuge Stratos高速冷冻离心机、LP Vortex Mixer旋涡振荡器：赛默飞世尔科技公司。
1.3 方法
1.3.1 乳酸菌的培养及胞外分泌物的制备
分别取28株乳酸菌冻存菌液100 μL于6 mL MRS肉汤培养基中，37 ℃静置培养24 h，活化菌株。活化后按2%接种量接种于MRS肉汤培养基，37 ℃静置培养24 h，收集发酵液，用超纯水将乳酸菌的菌数调整至108 CFU/mL，经8 000 r/min条件下4 ℃离心30 min，收集发酵上清液，即为乳酸菌胞外分泌物，用0.45 μm的滤膜过滤，放入-80 ℃冰箱保存待测。
1.3.2 乳酸菌胞外分泌物的抗氧化活性
为了更直观表明样品的抗氧化能力，选用VC作为阳性对照，将样品抗氧化能力转化为同一清除率数值下对应的VC浓度范围，以VC当量进行对照评价。
（1）DPPH自由基的清除能力测定
参照文献[12]所述方法进行测定，DPPH自由基清除率计算公式如下：
式中：A0为1.5 mL蒸馏水加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的无水乙醇溶液的吸光度值；A1为1.5 mL样品液加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的无水乙醇溶液的吸光度值；A2为1.5 mL样品液加1.5 mL无水乙醇溶液的吸光度值。
（2）羟自由基的清除能力测定
参照文献[13]所述方法并略有修改，羟基自由基清除率计算公式如下：
（3）超氧阴离子自由基的清除能力测定
参考文献[10]所述方法，略有改进，超氧阴离子清除率计算公式如下：
式中：ΔA0为对照组的吸光度值做出曲线的斜率；ΔA1为样品的吸光度值做出曲线的斜率。
（4）还原能力测定
按照参考文献[14]所述方法，以蒸馏水代替FeCl3溶液作为空白调零，于波长700 nm 处测定吸光度值。以吸光度值反映样品的还原能力，吸光度值越大，说明还原能力及抗氧化性越强。
1.3.3 统计分析
采用SPSS20.0统计软件处理实验数据，采用Duncan进行单因素方差分析，采用Pearson进行相关性分析。每个实验进行2次重复，结果以平均值±标准差（X+SD）表示。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌对DPPH自由基清除能力的比较
DPPH 自由基一种以氮为中心稳定性很好的大分子，与具有抗氧化活性的物质反应后在波长517 nm 处吸收峰减弱，以此变化来评价抗氧化能力，DPPH清除率越大表明抗氧化能力越强，是一种常用于评价抗氧化效果的有效方法[8]。本研究在反应体系中加入28株乳酸菌胞外分泌物，测定其对DPPH自由基的清除效果从而确定其抗氧化性能，结果见表2。
表2 28株乳酸菌的胞外分泌物对DPPH自由基的清除率
Table 2 DPPH free radical scavenging rate of extracellular secretions of 28 lactic acid bacteria
注：同一列中标有不同字母的表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由表2可知，28株菌株都表现出一定的DPPH自由基清除能力，清除能力较强且差异较大，清除率为29.80%～74.90%，为0.004～0.010 mg/mL VC当量。其中乳酸菌WC5、ZC1、WM7、GC2、RY1、ZC2、WC1、WC4具有较强的清除能力，均在66%以上，为0.008 mg/mL 以上的VC当量，与其余乳酸菌的DPPH自由基清除能力差异显著（P＜0.05）。同时，研究也发现在菌株在种内和来源也存在着一定的差异。其中菌株ZC1、ZC2、ZM3、ZB4都属于植物乳杆菌，但存在显著的种内差距（P＜0.05）；6株WC都是来源于干酪的戊糖乳杆菌，但WC1、WC4、WC5的DPPH自由基清除率显著高于WC2、WC3、WC6（P＜0.05），表现出相同来源的种内差距；菌株RY1、RB2、RM3为不同来源的乳酸乳球菌，DPPH自由基清除率有显著性差异（P＜0.05），表现出不同来源的种内差距。本研究结果与其他学者[15-16]的研究结果一致，这种差异可能是由不同来源的菌株DPPH自由基的活性物质的含量或种类不同造成的。
2.2 乳酸菌对羟自由基清除能力的比较
生命体代谢过程中在线粒体内产生自由基并释放到细胞质中，其中羟自由基的氧化性极强，与生物大分子发生链式反应造成细胞损伤，乳酸菌细胞内存在螯合Cu2+和Fe2+的天然物质，在此反应之前将自由基清除，从根本上减少羟自由基，测定乳酸菌对羟自由基的清除率能反应其抗氧化效果，羟自由基的清除率越高，表明抗氧化能力越强[17-18]。本实验对28株乳酸菌胞外分泌物的羟自由基清除能力进行了研究，结果见表3。
表3 28株乳酸菌的胞外分泌物对羟自由基的清除率
Table 3 Hydroxyl free radical scavenging rate of extracellular secretions of 28 lactic acid bacteria
由表3可知，所有菌株都表现出一定的羟自由基清除能力，清除率在10.97%～58.67%，为0.04～0.2 mg/mL VC当量。其中菌株GC2、ZC1、WM7、RY1、WM8表现出较强的羟自由基清除能力，达到54%以上，为0.1～0.2 mg/mL VC当量，显著高于其他菌株（P＜0.05），远高于王曦等[6]研究的35株乳酸菌胞外分泌物的羟自由基清除能力，而ZB4表现出最低的还羟自由基清除能力，仅为10.97%，为0.04 mg/mL VC当量。可能是不同乳酸菌所含的清除羟自由基活性物质成分或含量不同造成。另外，菌株在种内和种间也存在着一定的差异，德氏乳杆菌DF1和DY2之间的羟自由基清除能力差异显著（P＜0.05），表现出种内差异；不同种植物乳杆菌ZC1、ZC2、ZM3、ZB4和德氏乳杆菌DF1、DY2之间的羟自由基清除能力差异显著（P＜0.05），表现出种间差异，这可能是不同乳酸菌所含活性物质不同所决定的。
2.3 乳酸菌对超氧阴离子自由基清除能力的比较
超氧阴离子是氧气在需氧生物体内生成的第一种自由基，可以在金属离子的催化作用下发生反应产生活性较高的羟自由基，会对植物组织有损害作用，是抗氧化性能的重要指标。有学者[19]研究发现，人体在摄入某些乳酸菌后，能有效降低活性氧、超氧阴离子和过氧化氢的浓度。本实验对28株乳酸菌胞外分泌物的超氧阴离子自由基清除能力进行了研究，结果见表4。
表4 28株乳酸菌的胞外分泌物对超氧阴离子自由基的清除率
Table 4 Superoxide anion radical scavenging rate of extracellular secretions of 28 lactic acid bacteria
由表4可知，28株乳酸菌的胞外分泌物均具有较强的超氧阴离子自由基清除能力，其清除率在70.83%～98.26%之间。其中有5株乳酸菌GB8、GY7、DY2、GC2、RY1胞外分泌物的清除率＞87%，为0.08～0.30 mg/mL VC当量，并且与其他菌株差异显著（P＜0.05）。同时检测出GY3的清除能力最弱，但其清除率也＞70.83%，为0.06～0.07 mg/mL VC当量。研究表明，乳酸菌清除超氧阴离子的活性物质大部分存在于细胞外，存在于乳酸菌的代谢分泌物中，本研究的乳酸菌的胞外分泌物清除率高于其他学者研究中的其他部位。姚杰玢等[9]对8株乳酸菌的超氧阴离子清除能力进行测定，发现菌株R36的发酵上清液、完整细胞菌悬液和无细胞提取物清除率最高，其中发酵上清液72.02%为三者最高，但远低于本实验中大部分乳酸菌胞外分泌物的超氧阴离子清除率。
2.4 乳酸菌对还原能力的比较
还原能力是指还原酶和非酶复合物抵抗氧胁迫和降低螯合亚铁离子的能力，是体外评价抗氧化活性的关键指标，通过使Fe3+（铁氰化钾）生成Fe2+（亚铁氰化钾），Fe2+再和FeCl3反应生成布鲁士蓝色化合物，测定波长700 nm 处最大吸光值来反应还原能力大小，其抗氧化能力，A700nm值越大，其还原能力越大，抗氧化作用也越大[1，15，21]。由表5可知，28株乳酸菌胞外分泌物均具有一定的还原能力，A700nm值的范围在0.578～0.964，为0.1～0.2 mg/mL VC当量，其中菌株GB8、FB1、RY1、WM8、GY7、RM3、GC2、ZC1 表现出较强的还原能力，均达到0.820以上，显著高于其他菌株（P＜0.05），而菌株FM3的还原能力最低，A700nm为0.578，为0.08 mg/mL VC当量。除了戊糖乳杆菌和干酪乳杆菌之外，其余4个种属均表现出显著种内差异（P＜0.05）；植物乳杆菌ZC1、ZC2、ZM3、ZB4与发酵乳杆菌FB1、FB2、FM3又存在显著种间差异（P＜0.05）。这个结果与[16]研究一致，该研究指出17株乳酸菌的无细胞提取物的还原能力存在种内和种间差异。由此可推断，乳酸菌具还原能力的活性物质也存在代谢分泌物中，但不同属或同属不同菌株的乳酸菌胞外分泌物具有还原能力的活性物质存含量不同。
表5 28株乳酸菌的胞外分泌物的还原能力
Table 5 Reducing capacity of extracellular secretions of 28 lactic acid bacteria
2.5 不同抗氧化活性测定方法间的相关性
体外评价方法属于化学方法，是在体外模拟氧化反应过程，通过测定不同生理状态乳酸菌的还原能力、清除自由基能力等指标，评价其抵抗氧胁迫的能力。由于各种评价指标方法的测定机理不同，单一的化学方法来筛选高抗氧化活性的乳酸菌菌株有一定局限性，因此对所用到方法进行相关性分析，评价其相关性。4种不同的方法测定结果表明，本研究中的不同乳酸菌胞外分泌物均有一定的抗氧化能力，其中菌株GC2在4种方法中均名列前7以上，表现出最强的综合抗氧化能力，菌株ZB4在4种分析方法中均为倒数第四以后，表现出最弱的综合抗氧化能力。本研究通过比较4种体外抗氧化活性分析方法的相关性，结果见表6。
表6 抗氧化活性分析方法间相关性
Table 6 Correlation between different analytical methods of antioxidant activity
注：“*”表示显著相关（P＜0.05）；“**”表示极显著相关（P＜0.01）。
由表6可知，羟自由基与DPPH自由基（R=0.633）、超氧阴离子自由基与还原能力（R=0.488）方法间极显著相关（P＜0.01）；羟自由基与还原能力（R=0.295）方法间显著相关（P＜0.05）。而DPPH自由基与超氧阴离子、还原能力，羟自由基与超氧阴离子自由基方法间没有显著的相关性（P＞0.05）。这与谢丽源[14]的研究结果是一致的。结果表明，化学方法的测定机理不同，而乳酸菌抗氧化作用模式多样，单一方法不具有代表性，应尽量选择几种评价抗氧化的方法。
3 结论
本研究主要对28株乳酸菌胞外分泌物的3种自由基清除率及还原能力进行测定，来源于牛乳房边缘的副干酪乳杆菌GB8 的胞外分泌物对超氧阴离子自由基清除率最高，为98.26%，为0.10～0.30 mg/mL VC当量；还原能力也最强，A700nm值为0.964，为0.1～0.2 mg/mL VC当量。从干酪分离的戊糖乳杆菌WC5对DPPH自由基的清除率最高，为74.90%，为0.01 mg/mL VC当量。干酪乳杆菌GC2对羟自由基清除率最高为58.67%，为0.1～0.2 mg/mL VC当量，其对DPPH的清除率为73.09%，对超氧阴离子自由基清除率为87.50%，还原能力的A700nm值为0.806，表现出最强的综合抗氧化能力。由此，筛选得到GB8、WC5和GC2三株抗氧化能力相对较强的乳酸菌菌株，可用于抗氧化剂的进一步开发应用。同时对不同测定方法间的相关性进行研究，羟自由基与DPPH自由基（R=0.633）、超氧阴离子自由基与还原能力（R=0.488）；羟自由基与还原能力（R=0.295）这几种方法的相关性较高，不同的体外评价抗氧化能力方法所得结果间具有不同的统计学相关性。在本研究的基础上，将筛选出的有效菌株GB8、WC5和GC2进一步做体内抗氧化模型，分析乳酸菌抗氧化的物质成分，分离抗氧化活性物质，并对目前尚不太清除的乳酸菌抗氧化作用机制作深入研究。
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