金钗石斛（Dendrobium nobileLindl.）为兰科石斛属多年生附生草本植物，俗称金钗石、扁金钗、扁黄草、扁草或者黄草，因其形似古代妇女头上的饰物金钗而得名[1]。金钗石斛是历版《中国药典》所记载的名贵中药材，其具有滋阴清热、生津益胃、清肝明目和润肺止咳等功效[2]。金钗石斛中含有丰富的有效成分，主要有生物碱、多糖、黄酮、酚、倍半萜类化合物[3]，其中生物碱类成分石斛碱与多糖是主要发挥药理活性的基础物质[4-10]。除此之外，还含有香豆素、甾体、吡喃酮、对羟基苯甲酸、β-谷甾醇、大黄酚类化学成分[11]。现代药理学研究表明金钗石斛具有保肝、抗氧化、增强免疫力、降血糖血脂、缓解体力疲劳、延缓衰老等显著功效[12]，目前已经成为国内外保健食品、医疗药物等领域研究的热点。
复方金钗石斛保健酒以金钗石斛、人参、黄芪、五味子、茯苓为原料，本方中大部分药材使用部位为根茎，药材质地坚韧，细胞壁多糖含量高，在长时间煎煮下，累积溶出率较低，因此非加热的提取方式能增加有效成分的溶出[13]。目前运用于生产上的非加热提取方式工艺主要有静态提取和动态提取，动态提取以渗漉法为代表，静态提取以冷浸法为代表。渗漉提取可连续操作，药材细胞内外可持续维持较高浓度差，浸出效率高，是一个动态过程，相当于无数次浸渍，具有有效成分浸出完全、溶剂利用率高、浸出液杂质少等优势。
本研究采用正交试验，以石斛碱、总黄酮含量、浸膏得率和感官评价得分为指标进行综合评价，对复方金钗石斛保健酒的渗漉工艺进行优化，为原料药材的提取工艺参数提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
金钗石斛饮片：采自泸州合江金钗石斛种植基地；人参、五味子、黄芪、茯苓（经西南医科大学生药教研室税丕先教授鉴定）：泸州百草堂中药饮片有限公司；浓香型白酒（52度）：泸州老窖提供；芦丁对照品（99.05%，批号：153-18-4）：成都普思生物科技股份有限公司；石斛碱对照品（纯度99.70%，批号：111876-201503）、萘对照品（纯度99.6%，批号：111673-201604）：中国食品药品检定研究所；无水乙醇、冰乙酸、香草醛、亚硝酸钠、硝酸铝、高氯酸均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
HX-200型中药粉碎机：浙江省永康市溪岸五金药具店；UV-I800PC紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；ME204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；GC-2010：日本岛津公司；10×50 cm渗漉筒：四川聚合化工有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程及操作要点
药材预处理：将药材粉碎至65～80目的药粉，按人参∶金钗石斛∶黄芪∶五味子∶茯苓（9∶6∶6∶2∶2）的比例混合。
浸润：按照药材粉∶白酒=1∶9的比例加入不同酒精度的浓香型白酒，在室温条件下浸润不同的时间。
渗漉：以不同的流速渗漉至料液比为1∶12。
1.3.2 渗漉工艺优化单因素试验
影响渗漉的主要因素有渗漉速度、提取酒精度以及渗漉前浸润时间[14]。因此分别考察渗漉速度（1 mL/（min·kg）、3mL/（min·kg）、5mL/（min·kg）、7mL/（min·kg）、9mL/（min·kg）），提取酒精度（10%vol、38%vol、42%vol、52%vol、68%vol）；浸润时间（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h）对渗漉效果的影响。
1.3.3 渗漉工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，选择影响渗漉提取的主要因素，渗漉流速（A）、提取酒精度（B）、浸润时间（C）3个因素作为考察对象，以提取的总黄酮、石斛碱含量、浸膏得率以及感官评价的综合评价为考察指标，采用L9（34）正交试验设计，优化渗漉提取工艺。正交试验因素与水平见表1。
表1 复方金钗石斛保健酒渗漉工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimization of percolation process of compound Dendrobium nobile health liquor
水平A渗漉流速mL/（min·kg-1）B提取酒精度/%volC浸润时间/h 1 2 3 1 3 5 38 45 52 18 24 30
1.3.4 测定方法
总黄酮含量：按照参考文献[15-17]的方法进行测定。
石斛碱含量：按照《中国药典》（2015版）石斛碱检测方法进行测定。
浸膏得率：精密量取样品液20mL至质量恒定的蒸发皿中，水浴蒸干后在105℃干燥箱中干燥5 h，于干燥器内冷却至室温，待恒重时精密称定，按照下式计算总固体得率：
感官指标评定方法：参考GB/T 27588—2011《露酒》制定感官评分方法，来评定金钗石斛保健酒的色泽、澄清度、香气及口感，由3名具有5年以上从事白酒的感官评价和酒的质量检测人员组成感官评价小组，对不同处理的金钗石斛保健酒样进行感官评分，记录结果，以3人评分的平均值为最后评分。
评价方法：本课题研究采用多指标试验简易综合评分法[18-21]，考虑到保健酒中君臣佐使关系以及目标功效，根据主成分权重系数大原则，总黄酮含量（ai）权重系数为0.3，石斛碱含量（bi）权重系数为0.3，浸膏得率（ci）权重系数为0.2，感官评分（di）权重系数为0.2。
式中：xi为综合评分，ai为总黄酮含量，mg/L；bi为石斛碱含量，mg/L；ci为浸膏得率，%；di为感官评分；S1、S2、S3、S4分别为总黄酮含量、石斛碱含量、浸膏得率、感官评分的标准差。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 渗漉流速的筛选
表2 流速对渗漉工艺的影响
Table 2 Effect of flow velocity on percolation process
渗漉流速/[mL·（min·kg）-1]总黄酮/（mg·L-1）石斛碱/（mg·L-1）浸膏得率/%感官评价综合评分1 3 5 7 9 170.35 169.38 158.35 144.47 140.28 201.79 194.48 179.93 161.01 159.69 27.96 25.57 22.58 17.78 16.59 68 70 72 74 71 14.09 14.03 13.62 13.00 12.58
由表2可知，随着渗漉速度的增加，渗漉液的综合评分逐渐降低。原因可能是随流速增加，新鲜溶剂与药材的接触时间减少，溶出成分增加，溶出较多黄酮、生物碱和鞣质等苦涩味物质，感官得分随之降低。根据综合评分，选择低流速渗漉能获取较好的提取效果，因此选择渗漉速度为1～5 mL/（min·kg）进行后续正交试验。
2.1.2提取酒精度的筛选
由表3可知，随着提取酒精度的增加，总黄酮含量上升，石斛碱先增后减。感官评价方面，酒精度升高生物碱类成分溶出增加，致使涩麻感明显，感官评价得分下降。因此在酒精度38%vol、42%vol、52%vol时既可保证成分最大限度提取出，又可得到感官较好的浸提液。因此选择提取酒精度为38%vol、42%vol、52%vol进行后续正交试验。
表3 提取酒精度对渗漉工艺的影响
Table 3 Effect of alcohol content on percolation process
提取酒精度/%vol总黄酮/（mg·L-1）石斛碱/（mg·L-1）浸膏得率/%感官评价综合评分12 38 42 52 68 127.84 135.69 149.39 174.96 176.05 162.88 176.78 180.39 185.56 187.01 19.00 26.97 26.53 24.01 19.76 60 77 70 74 52 8.97 10.27 10.41 10.85 10.26
2.1.3 浸润时间的筛选
表4 前浸润时间对渗漉工艺的影响
Table 4 Effect of soaking time on percolation process
浸润时间/h总黄酮/（mg·L-1）石斛碱/（mg·L-1）浸膏得率/%感官评价综合评分6 12 18 24 30 134.00 140.20 150.78 155.84 158.33 156.12 180.13 188.00 192.80 199.99 23.84 25.02 28.03 29.02 29.99 65 68 72 73 73 12.50 13.38 14.30 14.67 14.76
由表4可知，渗漉提取法在正式渗漉前予以适当的浸泡，吸收溶媒使之组织浸润膨胀，将有利于溶质更好地交换。随浸润时间延长，溶剂进入药材组织交换出的成分越多，本试验中浸润时间≥24 h更有利于渗漉效率，功效成分及浸膏得率均呈增加趋势。浸润时白酒中各类成分与药材充分反应，使药香酒香复合协调，随浸润时间增加感官评价增加。因此选择浸润时间18h、24h、30h进行后续正交试验。
2.2 正交试验
表5 复方金钗石斛保健酒渗漉工艺优化正交试验结果与分析
Table 5 Results of orthogonal test for optimization of percolation process of compound Dendrobium nobile health liquor
试验号 A B C 空白 综合评分123456789k1k2k3R 111222333 123123123 123231312 123312231 14.99 14.38 15.07 14.09 13.71 15.25 14.15 14.37 13.85 14.81 14.35 14.13 0.69 14.41 14.15 14.74 0.57 14.87 14.11 14.31 0.76 14.18 14.59 14.51 0.41
由表5可知，影响渗漉的各因素次序为C（浸润时间）＞A（渗漉流速）＞B（提取酒精度），最优水平组合为A1B3C1，综合考虑实际生产的时间成本的影响，将最优工艺调整为A3B3C1，即复方浸泡于9倍体积的52%vol白酒中18 h，以5 mL·（min·kg）-1流速渗漉。
2.3 最佳工艺稳定性试验结果
为了验证最佳工艺的准确性，在最佳渗漉条件下进行验证试验所得渗漉液石斛碱、总黄酮含量、浸膏得率及感官评价分别为183.37 mg/L，219.74 mg/L，24.81%，75分。
3 结论
最终得出的最佳渗漉提取工艺为人参、金钗石斛、黄芪、茯苓、五味子打粉，过65～80目筛，加入9倍体积的52%vol白酒浸润18 h，以5 mL/（min·kg）流速渗漉。所得渗漉液石斛碱、总黄酮含量、浸膏得率及感官评价分别为183.367 mg/L，219.742 mg/L，24.810%，75分。此方法可作为金钗石斛保健酒的最佳渗漉工艺。
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