红枣（Ziziphus jujubaMill.）在中国有8 000年的种植历史，被列为“五果”之一（栗、桃、李、杏、枣）。红枣富含脂肪、蛋白质，还有丰富的维生素C和B族维生素，有“维生素之王”的美称。史书及现代的药理学均对红枣的营养成分及功效有研究记载：枣中富含的钙和铁，能提高人的免疫力，对防治骨质疏松有重要作用；同时，有大量的研究表明，红枣果中含有8种人体必需氨基酸[1]；红枣中的黄酮类化合物—芦丁，有促进维生素C的积蓄、维持毛细血管的抵抗力、抑制醛糖还原酶等功能；另外，红枣中还含有一种重要的生理活性物质—红枣多糖，可以促进淋巴细胞的增殖，有抗衰老作用；此外，红枣还在降低胆固醇、提高机体免疫力、预防癌症等方面具有显著疗效[2]。新疆独特的坏境、充足的光热资源为红枣的生长提供了优良条件，特别是在阿克苏、和田、喀什等地区，新疆红枣产量大，品质优良。但在加工销售上，红枣以干果为主，产品形式单一、缺乏深加工、附加值不高，严重制约了当地红枣行业的发展。
起泡酒一般以水果为原料，经酵母发酵、醇净、调配而制成。其外观精美，与干红葡萄酒相比更加个性化，且酒精度较低（9%vol～14%vol），可作为开胃酒、餐前酒，可以和任意菜肴搭配。近年来，随着多元文化的传播，起泡酒的需求量也在增加。然而，我国生产的起泡酒数量和种类还较少，多集中于用葡萄为原料生产的起泡酒，红枣起泡酒还鲜见报道[3]。本研究在前期研究的基础上[1]，以新疆红枣为原料制备红枣起泡酒。以酒精度及感官评分为评价指标，采用单因素试验及响应面法对二次发酵工艺进行优化，旨在研制出一款枣味突出、色泽艳丽、口感清爽的红枣起泡酒，并对其理化指标及微生物指标进行分析。本研究对开发红枣新食品，填补市场空缺，提高红枣产品附加值有一定意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
骏枣：新疆天山金冠果业有限公司；蔗糖（食品级）：市售；酒用高活性干酵母BV818（食品级）：安琪酵母（伊犁）有限公司；果胶酶（1 000 U/g）：北京索莱宝生物科技有限公司；酒石酸（食品级）：西安沐森生物工程有限公司；偏重亚硫酸钾（分析纯）：河北润步生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
HWS-28电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；10 L不锈钢发酵罐：上海百仑生物科技有限公司；苏泊尔08P真空加热破壁机：深圳欧亨科技有限公司；XB220A-SCS电子分析天平：上海精科天美贸易有限公司；WZ108/118ATC手持式折射仪：北京万成北增精密仪器有限公司；PHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；M277465型酒精计：河间市宏利玻璃仪器厂；MJX-1500智能霉菌培养箱：上海百典仪器设备有限公司；HG03-XV55NL-1罐头真空度汽酒饮料CO2压力测量仪：北京中西远大科技有限责任公司；日照供应手持浊度测量仪ZD-2A/微机型浊度仪：博特（连云港）仪器有限公司；德国AVM色度计：长沙市驭福仪器设备有限公司；CYE-9001汽酒压力测定器：菏泽海大仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 红枣起泡酒发酵工艺流程及操作要点
操作要点：
预处理：挑选成熟、无病、无霉烂的红枣清洗后沥干水分，去核，1 000 g红枣加入6倍的水，放入破壁机中打浆30 s，并添加0.03%果胶酶。
调整成分：根据理论值17 g/L蔗糖发酵可以产生1%vol的酒精度，按照预期产生的酒精度，用蔗糖调整红枣汁糖度至22°Bx[5-6]。用柠檬酸和碳酸钙调整红枣汁的pH值至3.8。
巴氏杀菌：将调配好的红枣汁于68℃条件下巴氏杀菌30 min，然后冷却至室温[7]，备用。
干酵母活化：称取红枣汁总质量0.03%的酒用高活性干酵母，加入5 mL的5%葡萄糖溶液中，并于37℃条件下活化30 min，做菌种备用[8]。
接种、一次发酵：在本实验室前期红枣甜酒的研究基础上进行一次发酵[9]，向红枣汁中接种0.03%活化好的酵母菌，并在20℃培养箱中进行一次发酵（不封闭）。发酵过程中观察发酵液糖度的变化，发酵50 h后，根据感官评定及酒精度终止一次发酵，此时红枣酒酒精度为6.5%vol，糖度为11 °Bx，pH值为3.8[10-12]。
过滤、巴氏杀菌：将红枣酒过滤，放入68℃水浴锅杀菌30 min。
补糖、二次发酵：根据理论值14.3 g/L蔗糖发酵可产生一个大气压，补加适量蔗糖和酵母，在15℃条件下进行二次封闭发酵[13]。二次发酵中，酵母将蔗糖转化为酒精的同时，主要提高瓶内的二氧化碳，二氧化碳压力升高，提高起泡酒中二氧化碳对口腔浓重而愉快的刺激感，即提高起泡酒的杀口感[14]。检测发酵过程中的气压变化，当发酵罐内气压达到0.35 MPa时终止发酵[15]。
1.3.2 红枣起泡酒二次发酵工艺优化单因素试验
参照红枣起泡酒二次发酵工艺，依次考察红枣酒二次发酵初始糖度（13 °Bx、14 °Bx、15 °Bx、16 °Bx、17 °Bx）、酵母添加量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）、发酵温度（11℃、13℃、15℃、17℃、19℃）3个因素对红枣起泡酒感官评分及酒精度的影响[16-17]。
1.3.3 红枣起泡酒二次发酵工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，选取（以一次发酵结束补加糖计）二次发酵初始糖度（A）、酵母接种量（B）、发酵温度（C）为考察因素，以感官评分（Y1）以及酒精度（Y2）为响应值，利用Design-Expert 8.0软件中的Box-Behnken设计进行响应面优化试验。响应面试验因素与水平见表1。
表1 红枣起泡酒二次发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for secondary fermentation process of jujube sparkling wine
水平 A初始糖度/°Bx B酵母接种量/% C发酵温度/℃-1 0 1 13 15 17 0.02 0.03 0.04 11 15 19
1.3.4红枣起泡酒的感官评定
选择10位经过专业培训的人员对红枣起泡酒进行感官评价，具体评分标准见表2[18]。
表2 红枣起泡酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standard of jujube sparkling wine
项目 评价标准 得分/分酒香（25分）色泽、澄清度（20分）香气浓郁，有明显的酒香、酒香协调红枣果香较淡，香味较协调圆润红枣果香过淡，香气刺鼻或没有香味外观清亮，有红枣特有光泽，无杂质、浑浊、串珠状色泽较淡或发暗，有微量浑浊物色泽很深，有沉淀杂质21～25 11～20 0～10 16～20 11～15 0～10杀口感和泡沫特性（30分）杀口感适中，具有红枣的特征果香和果味特点，泡沫细腻持久杀口感较弱，气泡持续性较弱杀口感很轻或没有，有涩感，泡沫持久性很差21～30 11～20 0～10糖酸比（25分）酸甜柔和，口感饱满过酸、过甜或味道偏淡过苦或有其他不良味道21～25 11～20 0～10
1.3.5分析方法
可溶性固形物含量：采用折射仪法测定[19]；酒精度测定：按照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》中的酒精计法测定[20]；菌落总数测定：按照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》测定[21]；致病菌测定：按照GB 29921—2013《食品中致病菌限量》测定[22]；产气量测定：使用CO2压力测量仪测定[23]。
2 结果与分析
2.1 红枣起泡酒二次发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 二次发酵初始糖度对红枣起泡酒品质的影响
二次发酵不同初始糖度对红枣起泡酒感官评分及酒精度的影响见图1。由图1可知，随着二次发酵初始糖度的增加，酒精度及感官评分均呈先升高后下降的趋势。当二次发酵初始糖度为15°Bx时，酒精度及感官评分均达到最大，分别为7.8%vol、91分，红枣起泡酒有醇香，糖酸比适宜，口感良好，产气量0.36 MPa；当初始糖度＜15°Bx之前，酵母菌生长缓慢，酒精度低，醇香味较淡，产气量较低，使得红枣起泡酒的典型性不突出，对口感有着消极影响；当初始糖度＞15°Bx之后，由于蔗糖含量高，使红枣发酵液的渗透压过高，抑制了酵母菌的生长，影响红枣起泡酒二次发酵效率；同时，含糖量过高使红枣起泡酒糖酸比失调，口味较为甜腻。因此，确定最佳二次发酵初始糖度为15 °Bx。
图1 二次发酵初始糖度对红枣起泡酒酒精度及感官评分的影响
Fig.1 Effect of initial sugar content of secondary fermentation on alcohol content and sensory score of jujube sparkling wine
2.1.2 二次发酵酵母接种量对红枣起泡酒品质的影响
二次发酵不同酵母接种量对红枣起泡酒感官评分及酒精度的影响见图2。由图2可知，随着酵母接种量的增加，酒精度及感官评分呈先升高后下降的趋势。当酵母接种量为0.03%时，酒精度及感官评分均最高，分别为7.7%vol、94分，酵母量适宜，发酵完全，产气量为0.35 MPa，起泡酒酒体醇香，无杂味，杀口感较强，红枣起泡酒风味最佳；当酵母接种量＜0.03%时，酵母添加量不足，发酵程度低，不满足酒精度要求，使得红枣起泡酒偏甜，酒香味较弱，二氧化碳的产量不足，杀口感较弱；当酵母接种量＞0.03%时，瓶内气压升高快，而起泡酒内的总糖有限，但酵母增殖作用时要消耗大量的糖，所以会出现有部分酵母不发挥作用，使得起泡酒的杀口感不足，含有少量酵母味，影响风味。因此，确定最佳二次发酵酵母接种量为0.03%。
图2 二次发酵酵母接种量对红枣起泡酒酒精度及感官评分的影响
Fig.2 Effect of yeast inoculum of secondary fermentation on alcohol content and sensory score of jujube sparkling wine
2.1.3 二次发酵温度对红枣起泡酒品质的影响
不同二次发酵温度对红枣起泡酒感官评分和酒精度的影响见图3。由图3可知，随发酵温度的升高，红枣起泡酒酒精度及感官评分均呈先升高后降低的趋势。当发酵温度为15℃时，红枣起泡酒酒精度及感官评分最高，分别为7.6%vol、95分，酵母达到其生长繁殖水平的最佳状态，酒体醇香、柔和，杀口感较强，没有苦味；当发酵温度低于15℃时，未能达到酵母最佳生长繁殖水平，产生的酒精少，起泡酒口感不佳，酒香淡；当发酵温度高于15℃时，发酵程度过快，且过高的发酵温度有可能破坏维生素C等营养成分[23]，使起泡酒品质下降，酒体不柔和，杀口感较弱，口味粗糙，苦味较重。因此，确定最佳二次发酵温度为15℃。
图3 二次发酵温度对红枣起泡酒酒精度及感官评分的影响
Fig.3 Effect of secondary fermentation temperature on alcohol content and sensory score of jujube sparkling wine
2.2 红枣起泡酒二次发酵工艺优化响应面试验结果
在单因素试验的基础上，根据Design-Expert 8.0软件中的Box-Behnken试验设计原理进行响应面试验，考察二次发酵初始糖度（以一次发酵结束补加糖计）（A）、酵母接种量（B）、发酵温度（C）3个因素对红枣起泡酒感官评分（Y1）及酒精度（Y2）的影响，响应面试验结果与分析见表3，以红枣起泡酒感官评分为响应值的方差分析见表4，以红枣起泡酒酒精度为响应值的方差分析见表5。
表3 红枣起泡酒二次发酵工艺优化响应面试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of response surface methodology for secondary fermentation process of jujube sparkling wine
试验号A初始糖度/°Bx B酵母接种量/%C发酵温度/℃Y1感官评分/分Y2酒精度/%vol 12 3 4567891 0 11 12 13 14 15 16 17 15.00 13.00 15.00 15.00 15.00 17.00 13.00 17.00 17.00 17.00 15.00 13.00 15.00 15.00 13.00 15.00 15.00 0.04 0.04 0.02 0.03 0.02 0.03 0.03 0.02 0.03 0.04 0.03 0.03 0.03 0.04 0.02 0.03 0.03 11.00 15.00 19.00 15.00 11.00 19.00 19.00 15.00 11.00 15.00 15.00 11.00 15.00 19.00 15.00 15.00 15.00 79 78 78 94 79 77 76 93 81 81 92 77 93 79 76 91 93 7.4 6.8 7.0 8.2 7.2 6.7 6.6 7.3 7.5 7.5 7.6 6.5 7.9 6.7 6.2 8.0 8.0
表4 以感官评分为评价指标的响应面试验回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model for response surface methodology using sensory score as evaluation index
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。下同。
方差来源 平方和 自由度 方差 F值 P值 显著性模型ABCA B***AC BC A2 B2 C2 54.38 18.84 0.084 3.01 2.68 1.51 0.17 140.18 103.24 171.60＜0.000 1 0.003 4 0.780 7 0.126 1 0.145 7 0.259 2 0.694 6＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1******残差失拟项纯误差总和730.61 28.13 0.13 1.50 4.00 2.25 0.25 209.27 154.12 256.17 10.45 5.25 5.20 741.06 91111111117341 6 81.18 28.13 0.13 4.50 4.00 2.25 0.25 209.27 154.12 256.17 1.49 1.75 1.30 1.350.378 1
表5 以酒精度为评价指标的响应试验回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model for response surface methodology using alcohol content as evaluation index
方差来源 平方和 自由度 方差 F值 P值 显著性模型ABCA B*****AC BC A2 B2 C2残差失拟项纯误差总和5.32 1.05 0.061 0.32 0.040 0.20 0.063 1.62 0.58 1.03 0.36 0.17 0.19 5.68 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 0.59 1.05 0.061 0.32 0.040 0.20 0.063 1.62 0.58 1.03 0.051 0.056 0.048 11.51 20.47 1.19 6.23 0.78 3.94 1.22 31.52 11.22 20.09 0.002 0 0.002 7 0.311 0 0.041 2 0.406 8 0.087 4 0.306 4 0.000 8 0.012 2 0.002 9******1.160.427 2
通过Design-Expert 8.0软件对表3的结果进行多元二次回归拟合，得到感官评分（Y1）与二次发酵初始糖度（A）、酵母接种量（B）、发酵温度（C）的回归方程为Y1=87.60+1.88A+0.13B-0.75C-1.00AB-0.75AC+0.25BC-7.05A2-6.05B2-7.80C2；酒精度（Y2）与二次发酵初始糖度（A）、酵母接种量（B）、发酵温度（C）的回归方程为Y2=7.94+0.36A+0.088B-0.20C-0.10AB-0.23AC-0.12BC-0.62A2-0.37B2-0.49C2。
由表4、表5可知，回归方程的模型均极显著（P＜0.01），说明模型构建成功，能反应响应值的变化。失拟项均不显著（P＞0.05），表明回归方程拟合效果较好，模型选择恰当。决定系数R2Y1=0.9399，R2Y2=0.9367，调整决定系数R2AdjY1=0.862 7，R2AdjY2=0.855 4，说明该模型的预测值与实验值具有较好的拟合性，可以用此模型对红枣起泡酒的感官品质和酒精度进行预测。
由表4可知，各因素对感官评分影响的主次顺序为A＞C＞B，即初始糖度＞发酵温度＞酵母接种量。二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项A对结果影响显著（P＜0.05），其他相对结果影响不显著（P＞0.05）。由表5可知，各因素对酒精度影响的主次顺序为A＞C＞B，即初始糖度＞发酵温度＞酵母接种量。一次项A及二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项C对结果影响显著（P＜0.05），其他相对结果影响不显著（P＞0.05）。
通过Design Expert 8.0.6软件对模型进行优化求解，以感官评分和酒精度为双响应值，得到红枣起泡酒二次发酵的最佳发酵工艺参数为二次发酵初始糖度15.27°Bx，酵母接种量0.03%，发酵温度14.78℃，在此发酵条件下，红枣起泡酒的酒精度预测值为7.99%vol，感官评分预测值为92.75分。
考虑实际生产的可行性，将最优二次发酵条件修正为初始糖度15°Bx、酵母接种量0.03%、发酵温度15℃。为验证模型的可靠性，进行验证试验。在此最优发酵条件下得到的红枣起泡酒感官评分实际值为93分，酒精度实际值为7.8%vol，与响应面模型预测值基本一致，证明响应面优化红枣起泡酒二次发酵工艺的结果合理可靠。
2.3 红枣起泡酒质量分析
在优化的发酵工艺下，红枣起泡酒酒精度为7.8%vol，产气量为0.35 MPa。红枣起泡酒细菌总数≤100 CFU/mL，大肠杆菌≤3 MPN/100 mL，致病菌未检出。红枣起泡酒各项指标均符合国家标准GB/T12696—2016《发酵酒及其配制酒生产卫生规范》[24]。
3 结论
本研究以红枣为原料，通过单因素试验和响应面试验优化红枣起泡酒二次发酵工艺。结果表明，红枣起泡酒最佳二次发酵工艺为初始糖度15°Bx、酵母接种量0.03%、发酵温度15℃，在此最优工艺条件下，红枣起泡酒的酒精度为7.8%vol，感官评分为93分。此时红枣起泡酒有明显的酒香、酒香协调，有红枣特有光泽，杀口感适中，泡沫细腻持久、酸甜柔和，口感饱满。本实验为红枣产品的开发提供了新的思路，能够满足消费者需要，增加起泡酒的种类，对于提高红枣附加值，填补市场空缺有一定的意义。
[1]蔡文超.红枣复合甜酒和复合发酵饮料加工工艺的研究[D].石河子：石河子大学，2018.
[2]鲁周民，刘坤，闫忠心，等.枣果实营养成分及保健作用研究进展[J].园艺学报，2010，37（12）：2017-2024.
[3]李超，司合芸，沈志毅，等.起泡酒发展概况及生产工艺分析[J].中外葡萄与葡萄酒，2015（4）：54-57.
[4]李其晔，鲁周民.红枣饮品加工研究进展[J].保鲜与加工，2015，15（5）：57-61.
[5]CAI W C,TANG F X,SHAN C H,et al.Changes in volatile compounds of fermented mixed drink using commercial yeast strain[J].Przem Chem,2018,97(8)：1398-1405.
[6]蔡文超，单春会，李文新，等.响应面法优化沙棘酒的发酵工艺[J].中国酿造，2018，37（6）：199-204.
[7]张峰，李志斌，刘景兰，等.杀菌技术在饮料生产管理中的应用[J].现代营销（学苑版），2013（2）：125-125.
[8]陈敏，梁新乐，励建荣.葡萄酒活性干酵母复水活化条件的研究[J].江苏食品与发酵，2001（2）：6-9.
[9]蔡文超，单春会，杨丽萍，等.红枣复合甜酒的发酵工艺初探[J].中国酿造，2018，37（6）：316-199.
[10]丁彦鹏.红枣果酒加工工艺及苦味研究[D].长沙：中南林业科技大学，2012.
[11]王颉，李长文，和东芹，等.干红枣酒酿造工艺研究[J].中国食品学报，2001，1（2）：19-23.
[12]纪庆柱.发酵型红枣酒加工工艺的研究[D].泰安：山东农业大学，2008.
[13]佚名.红枣发酵起泡酒及其制备方法：CN1904021[P].2007-01-31.
[14]如何选购优质啤酒[J].中国防伪报道，2015（9）：118-118.
[15]王培忠，张宗申，孙尤海，等.草莓起泡酒新工艺关键技术研究[J].中国酿造，2012，31（4）：174-177.
[16]赵金海，吴玉荣.菠萝起泡酒的研制[J].农产品加工（学刊），2010（11）：67-69.
[17]张晓勇，李丹，赵萍，等.混合果汁起泡酒酿造工艺的研究[J].中国酿造，2017，36（9）：187-190.
[18]赵镭，刘文，汪厚银.食品感官评价指标体系建立的一般原则与方法[J].中国食品学报，2008，8（3）：121-124.
[19]聂继云，李静，徐国锋，等.水果可溶性固形物含量测定适宜取汁方法的筛选[J].保鲜与加工，2014，14（5）：62-64.
[20]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 5009.225—2016食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[21]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 4789.2—2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[22]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 29921—2013食品安全国家标准食品中致病菌限量[S].北京：中国标准出版社，2013.
[23]张少云.低甲醇红枣蒸馏酒的固态发酵工艺研究[D].保定：河北农业大学，2018.
[24]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB 12696—2016食品安全国家标准发酵酒及其配制酒生产卫生规范[S].北京：中国标准出版社，2016.