甘蔗（Saccharum officinarum）有“果中佳品”的美称，其含有较多的铁元素，故又称“补血果”，甘蔗中还含有大量人体必需的其他微量元素和利于人体健康的氨基酸和维生素类物质[1]。同时甘蔗可改善口干舌燥、消化不良，反胃呕吐、肺热咳嗽等症状，研究表明，甘蔗中含有多糖[2]、黄酮[3]及多酚[4]等活性物质，使甘蔗具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂的功能[5-6]。甘蔗含糖量约为14%～16%[7]，利用甘蔗汁生产酒精不仅可以节约粮食，而且质量高，产量大[8-9]。
菠萝（Ananas comosus）学名凤梨，属凤梨科凤梨属植物，是热带和亚热带地区的著名水果[10]。菠萝营养丰富，有较高含量的糖、蛋白质和脂肪等，还含有大量维生素，其中以维生素C含量最高[11]。此外，菠萝中含有一种叫“菠萝朊酶”的特殊物质，既有溶解阻塞的血凝块和纤维蛋白、改善局部的血液循环的作用[12]，还能有效的酸解脂肪，起到减肥的效果[13]。近几年随着对菠萝的不断研究，已经从菠萝中提取出多种物质，如黄酮[14]、多酚[15]及蛋白酶[16]等物质，但是其提取率较低，还需要进一步对其提取工艺进行研究。果酒是一种以水果为原料，经过酵母利用水果本身的糖分发酵后得到一种低酒精浓度的酒精饮料[17]，其含有丰富的多酚类物质、氨基酸及矿物质等。近年来，研究人员对于混合型果酒的研究进一步加深，研制出了多种多样的新型混合果酒。如刘兴艳等[18]以青梅与甘蔗为原料，成功酿造出一款口味独特，果香浓郁的低度混合型果酒；李凤霞等[19]确定了香蕉菠萝复合果酒的最佳工艺参数，其酿造的混合型果酒有清新果香味，口感饱满爽口，深受人们喜爱。而甘蔗菠萝复合果酒还鲜有报道。
本研究以甘蔗和菠萝为原料制作复合型果酒，以感官评价为考察指标，通过单因素试验确定复合型果酒酿造过程的主要影响因子，采用中心组合设计（central composite design，CCD）响应面分析法对甘蔗菠萝复合型果酒的酿造工艺进行优化，并对其理化指标及微生物指标进行分析，为甘蔗及菠萝资源的深度开发开辟了新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
菠萝、甘蔗：抚顺市农贸市场；安琪果酒酵母（食用级）：宜昌安琪酵母股份公司。
1.1.2 试剂
蔗糖（食用级）：天津市大茂化学试剂厂；果胶酶（50000U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；食盐（食用级）：四川省盐业总公司；白砂糖（食用级）：太古糖业（中国）有限公司；偏重亚硫酸钾（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；维生素C、葡萄糖（均为食用级）：石药集团维生药业石家庄有限公司；柠檬酸（食用级）：河南万邦实业有限公司。
1.1.3 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH 7.4～7.6，121 ℃、101 kPa灭菌20 min[20]。
1.2 仪器与设备
LD210-2R型电子分析天平：沈阳龙腾电子有限公司；DL-1万用电炉：北京中兴伟业仪器有限公司；MM721AAU-PW微波炉：广东美的微博电器制造有限公司；YXQ-LS-50S11高压蒸汽灭菌锅、SW-CJ-2FD无菌操作台、HPX-9052MBE恒温培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；KYC1112恒温振荡器：上海福玛实验设备有限公司；TDL-40B离心机：上海安亭科学仪器厂；721G型可见分光光度计：上海精科仪器有限公司；PB-10酸度计：北京赛多利斯科学仪器有限公司；SJN-WZ101型糖度仪：北京西化仪科技有限公司；WGZ-1B浊度仪：郑州南北仪器设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 甘蔗菠萝复合型果酒酿造工艺流程及操作要点
操作要点：
原料挑选：挑选表面无破损腐烂的且成熟度适中的甘蔗和菠萝。
甘蔗去皮、清洗、榨汁：甘蔗去皮后切成1 cm2的果块，然后将其置于2%盐水中浸泡10 min，除去甘蔗果肉中引起过敏的物质。
菠萝去皮、清洗：菠萝去皮后切成1 cm2的果块，然后将其置于2%盐水中浸泡10 min，除去菠萝果肉中引起过敏的物质。
菠萝打浆及酶解：用榨汁机将经过处理的果肉打成浆状，每100mL添加0.05mg的果胶酶，在25℃条件下酶解6h，分解果肉组织中的果胶，提高出汁率。
护色：甘蔗打浆后应立即护色，防止果汁氧化褐变[19]。按果汁质量加入0.5%的柠檬酸和0.5%维生素C进行护色。
混合：将处理好的甘蔗汁与菠萝汁按照1∶2的体积比倒入发酵瓶内，并搅拌均匀。
成分调整：向混合后的果汁中加入一定量的白砂糖。
过滤：将酶解后果肉浆用灭菌的纱布进行过滤，得果汁。
杀菌：向果汁中添加偏重亚硫酸钾进行杀菌，备用。
酵母活化：将2.0 g果酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）加入5%的葡萄糖溶液中，混合均匀，35℃条件下恒温水浴活化30 min。
接种：将活化后的酵母溶液加入到混合果汁中，并搅拌均匀。
主发酵：在26℃条件下进行主发酵，发酵过程中及时进行搅拌，以便完全发酵。
后发酵：主发酵结束后，将酒液进行过滤，置于一定温度条件下进行后发酵。
陈酿：果酒继续密封保存，于20℃条件下陈酿2月，得甘蔗菠萝复合型果酒。
1.3.2 甘蔗菠萝复合型果酒的感官评价
随机选取10名经专业感官评定训练的同学对甘蔗菠萝复合型果酒进行感官评分，满分100分，评分标准见表1[21]。
表1 甘蔗菠萝复合型果酒的感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of sugarcane and pineapple compound fruit wine
指标 评分要求 评分/分色泽（20分）风格（20分）气味（30分）口感（30分）澄清、透明、有光泽、色泽诱人无夹杂物、色泽不良、久置有微沉浑浊、无光泽、色泽差或氧化变色具有本品特有的风格，典型完美有典型性，不够怡雅无特有风格，失去本品典型性果香、酒香浓厚幽郁、无异味、协调悦人果香、酒香过轻或过重，无异味果香、酒香极轻，风味单一，有异味口感爽口，回味浓口感较爽口，回味轻口感差，无回味16～20 11～15 0～10 16～20 11～15 0～10 21～30 11～20 0～10 21～30 11～20 0～10
1.3.3 甘蔗菠萝复合型果酒酿造工艺优化单因素试验
按照甘蔗菠萝复合型果酒酿造工艺依次考察主发酵温度（20℃、22℃、24℃、26℃、28℃）、甘蔗汁与菠萝汁体积比（4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4）、白砂糖添加量（160 g/L、180 g/L、200 g/L、220 g/L、240 g/L、260 g/L、280g/L）、酵母接种量（60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L）、主发酵时间（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）对甘蔗菠萝复合型果酒感官评分的影响。
1.3.4 甘蔗菠萝复合型果酒酿造工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，以甘蔗汁与菠萝汁体积比（A）、白砂糖添加量（B）、发酵时间（C）、酵母接种量（D）为考察因素，感官评分（Y）为评价指标，按照CCD设计原理，运用Design Expert 8.0.6软件进行响应面设计，响应面试验设计因素与水平见表2。
表2 甘蔗菠萝复合型果酒酿造工艺优化响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface methodology for brewing process optimization of sugarcane and pineapple compound fruit wine
因素 -2 -1 0 1 2 A甘蔗汁∶菠萝汁（V/V）B白砂糖添加量/（g·L-1）C发酵时间/d D酵母接种量/（g·L-1）3∶1 180 4 70 2∶1 200 5 80 1∶1 220 6 90 1∶2 240 7 100 1∶3 260 8 110
1.3.5 甘蔗菠萝复合型果酒质量指标的测定
（1）理化指标
酒精度：参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精计法测定；糖度：采用手持糖度仪测定[19]；酸度：采用PB-10酸度计测定[20]；浊度：采用WGZ-1B浊度仪测定[24]。
（2）微生物指标
采用倾注平板菌落计数法[21]，用灭菌后的吸管吸取1 mL待测酒样于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，在36℃的恒温培养箱中倒置培养24～28 h，再参照GB/T 5750.12—2006《生活饮用水标准检验方法微生物指标》计数原则进行菌落计数。
2 结果与分析
2.1 甘蔗菠萝复合型果酒酿造工艺条件优化单因素试验
2.1.1 主发酵温度对甘蔗菠萝复合型果酒品质的影响
图1 主发酵温度对甘蔗菠萝复合型果酒感官评分的影响
Fig.1 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation of sugarcane and pineapple compound fruit wine
由图1可知，随着发酵温度的逐渐升高，感官评分先升高后降低。当发酵温度为26℃时，甘蔗菠萝复合型果酒的感官评分最高，为76分。发酵温度过低时，果酒酵母的活性降低，不能进行有效的发酵，酒精度过低，影响口感；而温度过高会使果酒酵母失活，无法进行发酵。因此，可确定最佳的甘蔗菠萝复合型果酒发酵温度为26℃，此时甘蔗菠萝复合型果酒的酒精度为8.94%vol。
2.1.2 甘蔗汁与菠萝汁的果汁配比对甘蔗菠萝复合型果酒品质的影响
图2 果汁配比对甘蔗菠萝复合型果酒感官评分的影响
Fig.2 Effect of fruit juice ratio on sensory evaluation of sugarcane and pineapple compound fruit wine
由图2可知，随着甘蔗菠萝复合果汁中菠萝汁比例的提高，感官评分先升高后降低。当甘蔗汁与菠萝汁体积比为1∶2时，甘蔗菠萝复合型果酒的感官评分最高，为84分。当甘蔗汁过多时，其酒液澄清度不高，口味过甜，影响外观及口感；菠萝汁过多时，酒液颜色偏黄，酒精度较低且口感较酸，因此，确定甘蔗汁与菠萝汁的最佳体积比为1∶2，此时甘蔗菠萝复合型果酒的酒精度为9.88%vol。
2.1.3 白砂糖添加量对甘蔗菠萝复合型果酒品质的影响
图3 白砂糖添加量对甘蔗菠萝复合型果酒感官评分的影响
Fig.3 Effect of sugar addition on sensory score of sugarcanepineapple compound fruit wine
由图3可知，随着白砂糖添加量在160～280 g/L范围内的升高，感官评分先升高后降低。当白砂糖添加量为240g/L时，甘蔗菠萝复合型果酒的评分最高，为86分。当白砂糖添加量过低时，其酒液口感发涩；而白砂糖添加量过高时，由于初始时局部产生的酒精过多导致酵母菌死亡，不能继续产生酒精，导致其酒精度较低，同时初始糖度过高使酒液过甜，影响口感。因此，最佳白砂糖添加量为240 g/L，此时甘蔗菠萝复合型果酒的酒精度为10.12%vol。
2.1.4 酵母接种量对甘蔗菠萝复合型果酒品质的影响
图4 酵母接种量对甘蔗菠萝复合型果酒感官评分的影响
Fig.4 Effect of yeast inoculum on sensory evaluation of sugarcane and pineapple compound fruit wine
由图4可知，随着酵母接种量在60～120 g/L范围内不断提高，感官评分先升高后降低。当酵母接种量为100 g/L时，混合型果酒的评分最高，为78分。当酵母接种量过少时，酒液度不高，口味平淡，欠浓郁，影响口感；而酵母接种量过多时，酒精度较高，掩盖了原有的果香味。因此，最佳酵母添加量为100 g/L，此时甘蔗菠萝复合型果酒的酒精度为9.18%vol。
2.1.5 主发酵时间对混合型果酒品质的影响
图5 发酵时间对甘蔗菠萝复合型果酒感官评分的影响
Fig.5 Effect of fermentation time on sensory evaluation of sugarcane and pineapple compound fruit wine
由图5可知，随着主发酵时间在4～10 d范围内不断增加，感官评分先升高后降低。当主发酵时间为6 d时，混合型果酒的评分最高，为81分。发酵时间过短，其酒液发酵不完全，酒味不浓，口味平淡且有较多杂质，影响外观及口感。发酵时间过长，酒精度过高，酒味过浓掩盖了水果的香味，有强烈杀口感。因此，最佳发酵时间为6 d，此时甘蔗菠萝复合型果酒的酒精度为9.53%vol。
2.2 甘蔗菠萝复合型果酒酿造工艺优化响应面试验
2.2.1 回归模型的建立及方差分析
根据单因素试验结果，选取甘蔗菠萝复合型果酒感官评分（Y）为响应值，甘蔗汁与菠萝汁体积比（A）、白砂糖添加量（B）、主发酵时间（C）及酵母接种量（D）为考察因素进行4因素5水平的CCD试验。响应面分析结果与分析见表3，方差分析结果见表4。
表3 甘蔗菠萝复合型果酒酿造工艺优化响应面试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of response surface methodology for brewing process optimization of sugarcane and pineapple compound fruit wine
试验号 A B C D Y感官评分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0-11 0 1 0 1 -1 0 1 0 1 --2 1 0 -1 0 1 1 0 -1 0 1 0 -1 0 1 -1 0 -11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 1 0 1 0 1 0 0 1 2 1 0 -2 1 0 2 1 0 -1 2 1 0 0 -1 0 -1 0 1 0 0 1 0 --1 1 0 0 -0 0 -1 0 -1 0 -1 0 0 1 0 0 -1 0 0 1 0 0 -1 0 1 1 -1 1 0 1 -2 1 0 -1 0 -1 1 -2 1 2 1 0 1 -1-1-1-1-1-1-1 1 1 1 -1 -1 1-1 83 87 88 91 96 76 90 83 93 94 89 79 85 84 86 88 73 81 91 85 85 94 76 83 91 79 87 85 81/分30000089
利用Design-Expert 8.0.6软件对表3试验数据进行多元回归拟合，获得以甘蔗菠萝复合型果酒的感官评分为响应值的回归方程：
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型14 ABCDA B********AC AD BC BD CD A2 B2***********C2 D2 54.21 167.05 11.05 13.64 92.18 10.02 13.09 34.57 73.84 20.45 59.11 174.90 105.35 0.16 0.039＜0.000 1＜0.000 1 0.004 6 0.002 2＜0.000 1 0.006 5 0.002 5＜0.000 1＜0.000 1 0.004 0＜0.000 1＜0.000 1＜0.000 1 0.698 6 0.842 6残差失拟项纯误差总和927.53 204.17 13.50 16.67 112.67 12.25 16.00 42.25 90.25 25.00 72.25 213.76 128.76 0.19 0.048 18.33 11.00 7.33 946.87 111111111111111 5 10 5 29 66.25 204.17 13.50 16.67 112.67 12.25 16.00 42.25 90.25 25.00 72.25 213.76 128.76 0.19 0.048 1.22 1.10 1.47 0.750.674 1
由表4可知，回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），回归模型的决定系数R2=0.978 4，调整系数R2Adj=0.958 3，说明该回归模型与试验拟合较好，可以用于对甘蔗菠萝复合型果酒感官评分的理论预测。从回归方程系数显著性检验可知，各因素对甘蔗菠萝复合型果酒感官评价影响程度依次为果汁配比（A）＞发酵时间（C）＞白砂糖添加量（B）＞初始糖度（D）。一次项A、D、交互项AD、BC、CD及二次项A2、B2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项B、C及交互项BD对结果影响显著（P＜0.05），其他相对结果影响不显著（P＞0.05）。
2.2.2 响应面曲面图分析
对甘蔗菠萝复合型果酒感官评分影响显著的交互作用的响应面及等高线见图6。
由图6可知，随着各因素水平的增大，响应值呈先升高后减小的趋势。交互项AD、BC和CD对感官评分影响的响应面均呈现抛物面，即说明3个交互项所在选取的试验范围内，响应值均存在极大值。等高线均呈椭圆形，即说明3个交互项对结果影响显著，与方差分析结果一致。
图6 各因素交互作用对甘蔗菠萝复合型果酒感官评分影响的响应面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory evaluation of sugarcane and pineapple compound fruit wine
运用Design Expert 8.0.6的响应面分析软件对试验结果进行优化，得到混合型果酒的最优酿造条件：甘蔗汁菠萝汁体积比为1∶2、白砂糖添加量225.8 g/L、发酵时间7 d、酵母接种量100 g/L。在此最优条件下，甘蔗菠萝复合型果酒感官评分最大预测值为97.96分。为实际操作方便，将上述最优酿造条件修订为甘蔗汁菠萝汁体积比为1∶2、白砂糖添加量225 g/L、发酵时间7 d、酵母接种量100 g/L，按上述酿造工艺制作甘蔗菠萝复合型果酒，进行3次重复试验，得到甘蔗菠萝复合型果酒感官评分的平均值为96.50分，与预测值接近，说明此响应面法优化得到的甘蔗菠萝复合型果酒酿造工艺在实践中可行。
2.3 甘蔗菠萝复合型果酒的质量指标测定
在最优酿造工艺条件下，制备甘蔗菠萝复合型果酒，测定其理化指标和微生物指标，理化指标测定结果表明，酒精度为10.84%vol，pH值为4.13，糖度为10 °Bx，浊度值为57.9JTU，符合GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》国家标准。微生物测定结果表明，细菌总数75个/mL。细菌总数≤100个/mL符合GB/T 5750.12—2006《生活饮用水标准检验方法微生物指标》国家标准。
3 结论
在单因素试验基础上，通过响应面试验优化甘蔗菠萝复合型果酒的酿造工艺，确定最优酿造工艺为：甘蔗汁与菠萝汁体积比1∶2、白砂糖添加量为225 g/L、发酵时间7 d、酵母接种量为100 g/L、发酵温度为26℃。在此优化条件下，所得的甘蔗菠萝复合型果酒色泽金黄，澄清透明，杂质较少，状态均匀稳定；气味适宜，含有菠萝和甘蔗独特的甜香味；口感香甜爽口，酸甜适中，回味愉快，没有异味，感官评分为96.5分。其酒精度为7%vol，酸度为4.13，糖度为10°Bx，浊度值为57.9JTU，细菌总数为75个/mL，理化指标及微生物指标均符合相关国家标准。本试验为甘蔗菠萝复合型果酒产品的酿造奠定基础，为甘蔗及菠萝资源的深度开发开辟了新的途径。
[1]罗凯.我国的甘蔗资源及其利用[J].亚热带农业研究，1998，13（2）：26-29.
[2]程雅芳，曹慕明，陈国品，等.带壳百香果与甘蔗汁混酿复合果酒工艺研究[J].中国酿造，2019，38（3）：201-205.
[3]李新莹，薛海玲，李冉，等.基于响应面分析法优化甘蔗梢提取物中黄酮分离工艺研究[J].西南民族大学学报（自然科学版），2019，45（1）：46-53.
[4]苏杏严，黄光农，宁方尧.蔗梢中黄酮类多酚化合物提取工艺研究[J].甘蔗糖业，2011（2）：20-24.
[5]扶雄，于淑娟，阂亚光，等.从甘蔗中提取天然抗氧化活性物质明[J].甘蔗糖业，2004（5）：37-41.
[6]刘强，宋雨鸿，李慧等.甘蔗渣多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J].南方医科大学学报，2008，28（10）：1191.
[7]韦巧，杨宝玲，高振江.我国甘蔗产业化现状浅析[J].2015，10（4）：247-254.
[8]许旭萍，王晓斐，陈由强，等.适合能源甘蔗酒精发酵酵母生理及发酵特性的研究[J].福建师范大学学报（自然科学版），2009，25（1）：96-100.
[9]PRADEEP P,REDD O V S.High gravity fermentation of sugarcane molasses to produce ethanol：Effect of nutrients[J].Indian J Microbiol,2009,5(16)：1-6.
[10]董定超，李玉萍，梁伟红，等.中国菠萝产业发展现状[J].热带农业工程，2009，33（4）：13-17.
[11]李苗苗.菠萝果实维生素组分和含量变化的研究[D].海口：海南大学，2012.
[12]罗惠波，卫春会，王毅，等.菠萝果酒酿造工艺条件的优化[J].食品与发酵科技，2012，48（3）：94-96.
[13]李静，谭海刚，陈勇等.菠萝果酒的酿造工艺研究[J].青岛农业大学学报（自然科学版），2017，34（1）：47-51.
[14]邓梦琴，何夏怡，何慕怡，等.响应面法优化菠萝蜜果皮黄酮提取工艺[J].食品工业科技，2016，37（5）：67-73.
[15]宋力，薛灵芬，李森，等.回流法提取菠萝皮中多酚及其含量的测定[J].信阳师范学院学报（自然科学版），2016（4）：592-595.
[16]李淑喜，黎新明.菠萝蛋白酶的提取及其在医药中的应用[J].广州化工，2009，37（2）：52-53.
[17]陆寿鹏.果酒工艺学[M].北京：中国轻工业出版社，1999：79-83.
[18]刘兴艳，李梅，侯嘉丽，等.青梅甘蔗复合发酵酒加工工艺[J].食品与发酵工业，2013，39（4）：135-141.
[19]李凤霞，胡元庆，林瑞炳，等.香蕉菠萝复合果酒发酵工艺参数的研究[J].酿酒科技，2017（11）：36-39.
[20]李松涛.食品微生物学检验[M].北京：中国计量出版社，2008：77-81.
[21]李静，谭海刚，陈勇，等.菠萝果酒的酿造工艺研究[J].青岛农业大学学报（自然科学版），2017，34（1）：47-51.
[22]夏天.苦瓜澄清饮料的研制[D].成都：西华大学，2010.
[23]柯强，张世红，段文猛.大学化学实验与学习指导[M].北京：化学工业出版社，2013：97-101.
[24]李洁艳，蔡勇，顾燕.精炼菜籽油中蜡含量浊度计测定法研究[J].现代农业科技，2017（17）：251-252.