李子（Prunus salicinaLindl.）别名布霖、嘉庆子，属蔷薇科核果类水果，其果实富含碳水化合物、蛋白质、胡萝卜素、维生素C、抗坏血酸以及铁、钙、磷等多种微量元素[1]，具有降低血压、止咳、清肺、促进消化、美容养颜等功效[2]。我国李子种植历史悠久且面积较大，主产区位于西北及长江流域地区，产量位列世界第一[3]。近年来，由于李子不耐贮藏并且种植面积不断扩大，部分地区出现了“丰产不丰收”的问题，极大的挫伤了果农的积极性。利用发酵工艺对李子进行精深加工，开发李子果酒，不仅能增加果农收入，而且还能够解决李子不耐贮藏、附加值低的问题。同时发酵型李子酒保留了李子的特有风味和营养成分，且具有低酒精度、低含糖量的特点，兼具保健酒和饮料酒的双重功效，深受消费者的喜爱。
目前，国内外研究者针对李子果酒的研究非常少，主要集中于发酵工艺、检测方法及陈酿风味。郭意如等[4]对发酵型李子果酒的部分制作工艺进行了研究，确定了制作李子果酒的最优李子品种、酶制剂和SO2添加量、澄清工艺及发酵温度；刘永衡等[5]采用溶剂萃取法对陈酿30 d和120 d的幸运李子果酒进行气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）联用分析，考察了陈酿时间对李子果酒香气成分的影响。但对于李子果酒发酵过程中理化指标及挥发性物质变化的研究尚未报道。
因此，本研究对李子果酒主发酵过程中的主要理化指标（酒精度、总酸、pH、挥发酸、总糖）进行动态实时监控，并采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）-气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术对其挥发性成分进行分析，为提高李子酒的品质和安全提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
脆红李：永辉超市；白砂糖：成都太古糖业有限公司；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；LALLZYME EX-V复配酶制剂、偏重亚硫酸钾、氢氧化钠、重铬酸钾、硫酸铜、酒石酸钾钠、无水乙醇、硫酸、磷酸：成都市飞腾博川生物公司。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
PHS-3C pH计：深圳天溯计量检测有限公司；CP153分析天平：奥豪斯仪器有限公司；SPME Fiber（75μm）：上海安普实验科技有限公司；Agilent9000GC/5977BMSD气相色谱质谱联用仪、DB-WAXUI色谱柱（30m×0.25mm×0.25μm）：美国安捷伦公司。
1.3 试验方法
1.3.1 李子果酒制备工艺流程及操作要点
原材料选择及预处理→酶解→调整成分→主发酵→过滤→澄清→陈酿→成品
操作要点：
原材料选择及预处理：选取新鲜、饱满、无病虫害的李子果实，用流动清水进行清洗，然后去核破碎打浆。
酶解：向李子果汁中加入0.03 g/L复配酶制剂，以提高李子果浆出汁率和澄清效果。
调整成分：向李子果汁中加入180 g/L白砂糖[4]；加入0.1 g/L偏重亚硫酸钾，以抑制杂菌。
主发酵：将干酵母加入40℃温水中进行活化，在李子果浆中加入0.2 g/L活化酵母，将发酵罐置于26℃条件下发酵7 d，期间进行搅拌使其完全发酵。
过滤、澄清及陈酿：发酵7 d后，采用0.4 g/L的皂土进行下胶处理，将酒液通过纱布和硅藻土进行过滤并移至新的发酵罐中于20℃陈酿2个月[6-7]。
1.3.2 样品收集
将酵母接入李子果浆的时间计为发酵第1天，李子果酒主发酵周期一般为7 d，因此，在李子果酒发酵第1、2、3、4、5、6、7、8天进行取样，所有采集样品均经过4层纱布过滤后进行分析。
1.3.3 理化指标的测定
参照国家标准GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对李子果酒样品的酒精度、总糖含量、总酸含量及挥发酸含量进行测定；采用pH计测定pH值。
1.3.4 挥发性成分分析
采用顶空固相微萃取（HS-SPME）和气相色谱-质谱（GC-MS）联用仪对李子果酒中的挥发性成分进行测定。
参照张晶等[8]的方法，并略作修改。在20 mL顶空瓶内加入10 mL李子果酒样，45℃条件下平衡10 min，将萃取头插入顶空瓶中于45℃条件下萃取40 min后拔出，插入气相色谱仪进样口，230℃条件下解吸5 min。
GC条件：载气为氦气（He），流速1 mL/min；无分流进样；程序升温：起始温度35℃，维持3 min；以6℃/min升至150℃，维持1 min；然后再以12℃/min升至230℃，维持3 min。
MS条件：电离方式为电子电离（electronionization，EI）；电子能量为70eV；离子源温度为230℃；接口温度为280℃；质量扫描范围为20～550 u。
定性定量分析：对GC-MS得到的李子果酒质谱数据与美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）11标准谱库进行检索，并结合保留指数进行定性分析；采用面积归一化法确定各挥发性物质的相对含量[9-11]。
2 结果与分析
2.1 李子果酒主发酵过程中总酸含量和pH值的变化
李子果酒发酵过程中总酸含量和pH值的变化过程如图1所示。
图1 李子果酒主发酵过程中总酸含量和pH值的变化
Fig.1 Changes of total acid content and pH of plum fruit wine during main fermentation process
由图1可知，在李子果酒主发酵过程中，随着发酵时间的延长，总酸含量呈现先逐渐下降后趋于稳定的趋势，当发酵1～4 d时，总酸含量由10.13 g/L下降至10.00 g/L；当发酵4～6 d时，总酸含量下降速度加快，从10.00 g/L下降至9.10 g/L；当发酵7～8 d时，总酸含量趋于稳定，主发酵结束，总酸含量为9.13 g/L。pH值变化与总酸含量变化趋势相反，当发酵1～5 d时，pH值由3.67上升至3.75；当发酵5～8 d时，pH值趋于平稳，到主发酵结束时达到3.76。
2.2 李子果酒主发酵过程中酒精度和总糖含量的变化
李子果酒主发酵过程中酒精度和总糖含量的变化情况不仅反映出酵母菌对糖分的利用和酒精的产生情况，也是体现李子果酒发酵进程的重要标志[12]，其变化情况见图2。
图2 李子果酒主发酵过程中酒精度和总糖含量的变化
Fig.2 Changes of alcohol content and total sugar content in plum fruit wine during main fermentation process
由图2可知，在李子果酒主发酵过程中，随着发酵时间的延长，总糖含量呈先下降后趋于稳定的趋势，酒精度则相反。当李子果酒发酵1～5 d时，总糖含量迅速下降，从186.47 g/L下降至22.79 g/L，酒精度迅速上升，从0快速增加至11.90%vol。发酵5 d之后，总糖含量逐渐趋于平稳，而酒精度则缓慢下降。发酵8 d时，总糖含量为22.90 g/L，酒精度为11.10%vol。
2.3 李子果酒主发酵过程中挥发酸含量的变化
挥发酸是评价果酒品质的重要指标，挥发酸含量过高会改变酵母的发酵能力，造成发酵异常，同时会对果酒口感产生较大影响，带给人醋味和尖酸感[13]。其变化情况见图3。
图3 李子果酒主发酵过程中挥发酸含量的变化
Fig.3 Changes of volatile acid content in plum fruit wine during main fermentation process
由图3可知，在李子果酒发酵过程中，随着发酵时间的延长，挥发酸含量呈逐渐上升趋势，当李子果酒发酵1～2 d，挥发酸含量快速上升，从0.07 g/L上升至0.17 g/L；当发酵2～6 d，挥发酸含量虽逐渐增加，但上升速度变缓；当发酵6～8 d，挥发酸含量又快速升高，发酵8 d时，挥发酸含量为0.25 g/L。
李子果酒发酵过程中，pH值、总酸含量、酒精度、总糖含量以及挥发酸含量的变化与李子果酒的发酵程度和品质密切相关。在发酵过程中，总糖和总酸含量呈下降的趋势，pH值、酒精度及挥发酸含量呈上升趋势，究其原因，可能是由于发酵前4天，微生物处于快速生长繁殖阶段，其代谢活动剧烈，使挥发酸含量快速上升[13]，并迅速利用李子果酒中的糖类物质转化为乙醇，从而导致果酒中酒精含量快速增高，而糖类物质含量迅速下降。随着发酵进程的持续进行，酵母菌可利用的糖类物质变少，同时酒精含量的增加也会对酵母菌的生长和活动产生抑制作用，造成酵母菌分解糖类物质速率降低，酒精度和总糖含量趋于平稳。发酵后期酒精度略微降低是由于乙醇和酰基辅酶A在酿酒酵母细胞内被醇酰基转移酶催化生成相应的酯类造成的[14]。总酸含量降低是由于一些酸类物质在微生物的作用下被分解及利用，如乙酸乙酯的合成途径，酵母在酯化酶的作用下，催化乙酸和乙醇直接合成乙酸乙酯，从而导致总酸含量逐渐降低、pH值升高，而挥发酸含量在主发酵后期依旧呈现出缓慢上升的趋势，所以在之后陈酿过程中需要对陈酿环境以及储藏管理加大控制力度，避免挥发酸含量持续增高对李子果酒口感和品质造成负面影响[15]。
2.4 李子果酒主发酵过程中主要挥发性物质变化
挥发性物质是果酒风味的重要指标[16-17]，其主要来源于水果本身、微生物代谢以及陈酿过程，通过HS-SPMEGC-MS检测及NIST数据库对比发现，李子果酒主发酵过程中主要物质是醇类和酯类物质，其中主要变化的醇类物质有乙醇、1-己醇、异戊醇、异丁醇、顺式-3-己烯-1醇、苯基乙醇，其变化过程见图4。
图4 李子果酒主发酵过程中醇类物质的变化
Fig.4 Changes of alcohols in plum fruit wine during main fermentation process
由图4可知，在李子果酒发酵过程中，随着发酵时间的延长，乙醇、异戊醇、异丁醇的相对含量呈先升高再下降后趋于稳定的趋势；苯基乙醇的相对含量呈先升高后趋于稳定的趋势；1-己醇、顺式-3-己烯-1醇的相对含量呈先下降后趋于稳定的趋势。主发酵结束后，乙醇、异戊醇、异丁醇、苯基乙醇、1-己醇、顺式-3-己烯-1醇的相对含量分别为51.79%、15.74%、4.46%、1.47%、2.09%、0.71%。
主要变化的酯类物质有乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、癸酸乙酯，其变化过程见图5。
图5 李子果酒主发酵过程中酯类物质的变化
Fig.5 Changes of esters in plum fruit wine during main fermentation process
由图5可知，在李子酒发酵过程中，随着发酵时间的延长，乙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯的相对含量均呈逐渐升高的趋势；而3-甲基-1-丁醇乙酸酯和乙酸己酯的总体趋势则表现为先上升后下降。主发酵结束后，乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、癸酸乙酯的相对含量分别为3.91%、4.59%、7.46%、0.75%、3.14%、2.86%。
香气成分是李子果酒品质的重要组成部分，6种醇类物质中1-己醇、异戊醇、顺式-3-己烯-1醇、苯基乙醇这4种醇类物质各自具有独特风味特征，如1-己醇具有水果芬芳的诱人香气，异戊醇为国家规定的食用香精，苯基乙醇具有花香；6种主要的酯类物质也是李子果酒香气构成的重要成分，如辛酸乙酯具有白兰地酒香味，主要用于调味品、香料制造，癸酸乙酯和乙酸异戊酯均可用于调香[18-23]。
3 结论
本研究以李子为原料制作李子果酒，在李子果酒主发酵过程中，随着发酵时间的延长，pH值、酒精度呈先升高后趋于稳定的趋势；总酸、总糖含量呈先下降后趋于稳定的趋势；挥发酸含量呈上升趋势。主发酵结束后，李子果酒的酒精度为11.10%vol、总酸含量为9.13 g/L、pH值为3.76、挥发酸含量为0.25 g/L、总糖含量为22.90 g/L。李子果酒发酵过程中主要的挥发性物质为醇类和酯类，主要变化的醇类包括乙醇、1-己醇、异戊醇、异丁醇、顺式-3-己烯-1醇、苯基乙醇，主要变化酯类包括乙酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、癸酸乙酯。本研究揭示了李子果酒发酵过程中理化指标和挥发性物质的变化规律。
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