红枣在我国大部分区域都有种植，产量丰富，约占世界枣产量的90%[1]。红枣在中国饮食界具有药食同源的作用，营养价值高，风味好，具有多种生物活性物质，如黄酮、多酚、多糖等，有抗癌、抗过敏、消除疲劳、治疗贫血、增强免疫、抗氧化、化瘀活血等作用[2-4]。在中药方面，红枣还用来预防或治疗某些疾病，如肿瘤、肝硬化和心血管疾病等[5]。红枣果酒有其独特的风味及较高的营养价值、药用价值，且随着人们生活水平的提高，保健养生已经成为潮流，营养价值极高的红枣果酒在市场上的需求量将日益增多。
在果酒的酿造过程中，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的选择对果酒的品质至关重要，酵母菌直接影响枣酒的口感和风味，是决定枣酒品质的关键因素。红枣在酿酒酵母的作用下，产生酒精及多种风味物质，这可能与酵母的发酵特性及红枣的营养成分有关[6]。邹波等[7]分析了4种酿酒酵母（BO213、EC1118、FX10和RV002）在骏枣果酒发酵过程中理化指标和抗氧化能力的变化，结果显示，在4种酿酒酵母中，酵母BO213最适合骏枣果酒的发酵；贾琪等[8]比较了国内外适合发酵果酒的活性干酵母，从安琪SY型葡萄酒果酒专用酵母、法国Lalvin 12葡萄酒专用酵母、帝伯仕·葡萄酒果酒专用酵母、法国Laffort陈酿型红葡萄酒酵母和法国RED STAR Montrechet葡萄酒专用酵母5种酵母中挑选出最适合酿造红枣酒的酵母为法国Laffort陈酿型红葡萄酒酵母。目前酵母筛选主要侧重于香气成分和发酵性能的研究，不同酵母对果酒抗氧化物质和抗氧化活性影响的研究较少[9-10]。
实验选取4种发酵剂对红枣枣浆进行发酵，对发酵后的红枣果酒进行感官评价，并研究其酸度、酒精度、维生素C（vitamin C，VC）含量、氨基酸态氮及总黄酮、多酚含量、还原力羟基自由基清除能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力等抗氧化活性指标，筛选出一种适合红枣果酒发酵的酵母。以期为今后红枣果酒的发酵提供理论意义。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
稷山板枣：市售；安琪SY葡萄酒·果酒专用酵母：安琪酵母股份有限公司；帝伯仕LADELICIEUSE活性干酵母（简称LA-D）：烟台帝伯仕自酿机有限公司；清香型酒曲：泸州市某公司；薯曲：永州市雅大科技实业有限公司。
皂土（食品级）：烟台帝伯仕自酿机有限公司；食用酒精（95%vol±1%vol）：河南鑫河阳酒精有限公司；DPPH（纯度＞97%）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；2,6-二氯靛酚钠、没食子酸、水杨酸、盐酸、福林酚、硫酸亚铁、过氧化氢、乙醇、柠檬酸、无水甲醇、甲醛溶液、抗坏血酸、酚酞、草酸、芦丁、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
WYT型手持糖度计：成都市青羊联合光学仪器成套部；TU-1901型分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；3nh高品质电脑色差仪：深圳时三恩驰科技有限公司；S10-3型恒温磁力搅拌器：上海司乐仪器股份有限公司；pHS-3C酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；998型全营养破壁料理机：中山市十三郎电器有限公司；2.0无磁全钢发酵桶：广东彩塘鹏之豪不锈钢制品厂；DZKW-D2电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；752N型紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；250L型生化培养箱：金坛区西城新瑞仪器厂；TY-150×10型板框过滤机：上海滤盈工业过滤设备有限公司；Agilent 7820A气相色谱仪：美国安捷伦公司。
1.3 方法
1.3.1 红枣果酒工艺流程及操作要点
挑选红枣：挑选无腐烂、无虫蛀、色泽新鲜的稷山板枣。
原料处理：用清水冲洗表面污渍、泥土及附着的微生物，将红枣洗净后在清水里浸泡12 h，次日捞出，沥干表面水分，以枣（以浸泡前计）质量2倍的量添加水，打浆备用。
酵母活化、添加：LA-D酵母、安琪酵母以酵母∶糖水（含糖量5%）=1∶10的质量比活化酵母。当糖水温度达到30℃时，将酵母倒入，轻轻搅拌均匀，让酵母悬浮液活化20 min，待有一层细腻的泡沫出现，表明活化成功。并以1 g/1 500 g枣浆的比例接种。清香型曲、薯曲以10g/1500g酒曲与枣浆量的比例直接接种。
添加酒精：按照3%的比例添加食用酒精，用食用酒精代替SO2，进行抑菌处理。
恒温发酵：将枣浆置于发酵桶中在25℃条件下先敞口后密封发酵。发酵过程中，每天搅拌一次，使枣浆通风发酵，发酵12 d后停止发酵。
终止发酵：从枣浆中压榨出枣酒，在90℃条件下加热2 min以终止果酒的发酵。
澄清：向终止发酵后的果酒中添加2.4 g/L的皂土，对红枣果酒进行澄清。待吸附了酒液中胶体成分的皂土逐步沉淀到瓶底，酒体逐渐澄清。随后将枣酒与瓶底沉淀物分离，得到澄清酒液。
过滤、除菌：待调配好的酒液静置一段时间，固液分离，取出上清液，再采用板框压滤机进行过滤，所使用的介质为孔径为0.6～1.5 μm的除菌纸板。
1.3.2 感官评价及营养指标的测定
（1）可溶性固形物的测定：手持糖度计法。
（2）总酸：根据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》采用酸碱滴定法测定。
（3）VC含量测定：2,6-二氯靛酚滴定法。
（4）酒精度测定：参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》使用Agilent 7820A气相色谱仪进行测定。
（5）色度测定：参照马丽娜等[11]的方法对4种发酵剂发酵后的红枣果酒进行色度测定。L*值表示为亮度，L*值越大亮度越大；a*值为正值时表示红度，为负值时表示绿度；b*值为正值时表示黄度，为负值时表示蓝度。
（6）氨基酸态氮含量：根据GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中甲醛值法测定。
（7）总黄酮含量测定：参照彭雪等[12-13]的方法测定。
（8）总多酚含量测定：参照靳玉红等[14]的方法，在波长765 nm处测定吸光度值。
（9）感官评分：参照 GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，制定酸甜型红枣果酒评分标准，由11名专业人员组成感官评定小组进行评定（以自然数打分），取其感官评定分数的平均值作为评定结果，感官评分标准见表1。
表1 酸甜型红枣果酒感官评定标准
Table 1 Sensory evaluation standard for sweet and sour jujube wine
项目 评分/分 评分标准外观（20分）香气（30分）滋味（40分）色泽为琥珀色，酒体澄清透明，有光泽色泽为琥珀色，酒体澄清透明，光泽暗淡色泽琥珀色偏暗，有少量悬浮物或沉淀色泽偏暗、偏枣红，有悬浮物或沉淀有浓郁的枣香气和协调的酒香有明显的枣香和酒香，香味协调枣香、酒香较淡，但无异香香味不足，或有异香，不协调酒体丰满，酸甜适口，无苦味，滋味可口口感偏酸、偏甜、苦，无其他异味口感偏苦，酒质较粗糙口感不协调，有明显的苦味，酒体难以接受，酒质粗糙典型性（10分）18～20 13～17 8～12 0～7 26～30 20～25 15～19 0～14 35～40 25～34 15～24 0～14 9～10 7～8 5～6 0～4具有典型的酸甜枣酒风格具有明显的酸甜枣酒风格基本符合酸甜枣酒风格与酸甜枣酒风格出入较大
1.3.3抗氧化活性的测定
DPPH·清除能力测定：参照张玲等[15-16]的方法；还原力测定：参照汪超等[17]的方法测定；羟基自由基清除力的测定：参照谢惠等[18]的方法测定；超氧阴离子自由基清除能力的测定：参照李霄等[19]的方法测定。
2 结果与分析
2.1 不同发酵剂发酵结束后红枣果酒感官评价
表2 不同发酵剂发酵红枣果酒感官评价
Table 2 Sensory evaluation of jujube wine fermented by different fermentation starters
项目 LA-D酵母 安琪酵母 清香型曲 薯曲外观香气滋味典型性总分18.7±1.02 25.0±2.13 36.2±1.75 9.0±1.09 88.5±1.68 17.0±1.35 21.3±2.10 34.0±2.15 7.1±1.01 79.0±1.59 15.0±1.64 20.0±1.76 28.3±2.05 6.0±0.52 69.1±1.48 15.0±1.32 22.3±2.16 25.5±1.95 6.0±0.23 68.2±1.54
由表2可知，由LA-D酵母发酵的红枣果酒感官评价得分最高，为88.5分，具有红枣果酒特有的琥珀色、酒体通透澄清、光泽鲜亮、无明显的悬浮物，酒体滋味丰满、香气协调，典型性较好。LA-D酵母和安琪酵母发酵酒颜色都呈琥珀色，清香型曲和薯曲发酵酒颜色均偏暗，澄清度都较高。LA-D酵母和安琪酵母发酵酒香气协调清爽，清香型曲和薯曲发酵酒气味较浓。LA-D酵母和安琪酵母发酵酒滋味偏酸甜、苦味较小，有枣香味。清香型曲和薯曲发酵酒滋味偏酸涩、苦味重，其中携带曲的味道。这可能与红枣中糖的利用程度以及产酒精量有关[20]。综合评价，LA-D酵母发酵酒优于其他3种发酵酒。
2.2 不同发酵剂发酵过程中可溶性固形物含量的变化
图1 不同发酵剂发酵过程中可溶性固形物含量的变化
Fig.1 Changes of soluble solids content during fermentation process by different fermentation starters
由图1可知，经不同发酵剂酿造的红枣果酒的可溶性固形物随着发酵时间的延长均有显著性下降，其原因是因为酵母利用糖转化成酒精。在发酵结束后，测得酒曲类发酵的红枣果酒较酵母类发酵的红枣果酒的可溶性固形物残留量高，薯曲和清香型曲为10.0°Bx，LA-D酵母和安琪酵母是8.0°Bx。分析原因可能是酵母类发酵性能强。因此选择酵母菌发酵剂作为红枣果酒的发酵剂。
2.3 不同发酵剂发酵过程中酸度的变化
图2 不同发酵剂发酵过程中总酸含量的变化
Fig.2 Changes of total acid content during fermentation process by different fermentation starters
酸度是影响果酒感官的一项重要指标。枣酒中的酸度较小时，不仅可以保持枣酒的果香，调节果酒的酸甜度，而且可以修饰其他滋味，使得红枣果酒的感官达到最好。但枣酒中的酸度过大时，则会严重影响果酒的滋味，使果酒酸苦、有涩味。从图2可以看出，果酒的酸度随着果酒的发酵呈现上升趋势，分析原因可能是由于酵母产酸、有机酸的溶出。薯曲和清香型酒曲上升的趋势较安琪酵母和LA-D酵母快。在发酵12 d后，4种发酵剂发酵酒的总酸含量分别为7.875 g/L（LA-D酵母）、6.375 g/L（安琪酵母）、8.625 g/L（清香型酒曲）和10.875 g/L（薯曲）。结果表明，4种发酵剂产酸能力各不同，但总体而言，酒曲类发酵剂产酸能力较酵母类发酵剂的产酸能力强。
2.4 不同发酵剂对红枣果酒的酒精度和色度的影响
红枣果酒在发酵结束后色泽的变化情况如表3所示。
表3 不同发酵剂发酵结束后枣酒的色度
Table 3 Chroma of jujube wine after fermentation by different fermentation starters
发酵剂 L*值 a*值 b*值LA-D酵母安琪酵母清香型曲薯曲19.13±0.21 19.01±0.23 19.77±0.22 19.79±0.24 10.69±0.15 10.38±0.18 8.88±0.16 8.12±0.12-7.90±0.14-8.47±0.16-5.05±0.19-4.68±0.11
由表3可知，4种发酵剂发酵红枣果酒的色泽均较亮，b*值均较小，而a*值较大，说明4种发酵剂的发酵酒颜色都偏红色，其来源可能是红枣中的红色素溶进产生的。
不同发酵剂在发酵结束后发酵酒的酒精度情况如图3所示。由图3可知，不同发酵剂的发酵酒酒精度为LA-D酵母（10.6%vol）＞安琪酵母（10.3%vol）＞薯曲（9.0%vol）＞清香型曲（8.5%vol）。表明酵母类发酵剂较酒曲类发酵剂对红枣中糖的利用率更高，将糖转化为酒精的能力更强。
图3 不同发酵剂发酵结束后枣酒的酒精度
Fig.3 Alcohol content of jujube wine after fermentation by different fermentation starters
2.5 不同发酵剂发酵过程中VC含量变化
VC即L-抗坏血酸，为水溶性维生素，理化性质活泼，除有促进胶原蛋白合成、治疗坏血病、防癌、提高人体免疫力等作用外，还有很强的抗氧化作用，可以保护其他抗氧化剂（如维生素A、维生素E、不饱和脂肪酸），防止自由基对人体的伤害[21]。由图4可以看出，安琪酵母、清香型曲这2种发酵剂发酵酒的VC含量在前9天、薯曲在前6天都呈现下降趋势，可能是受光照、氧气等因素的影响而氧化损失。LA-D酵母在前期略微上升后急剧下降，随后又呈现上升趋势，其他3种菌种的VC含量也分别在发酵后期呈现上升趋势。在发酵末期，LA-D酵母发酵果酒的VC含量最高，为213.37 mg/100 mL，分别比安琪酵母、清香型曲、薯曲发酵的红枣果酒的VC含量高约60.00%、62.39%、65.68%。
图4 不同发酵剂发酵过程中VC含量的变化
Fig.4 Changes of VC content during fermentation process by different fermentation starters
2.6 不同发酵剂发酵过程中总黄酮含量的变化
黄酮类化合物是红枣中重要的功能性成分，具有多种生物活性，有清除自由基、抗菌、保肝等生理活性[22-24]。由图5可知，经过不同菌种发酵红枣果酒的过程中，由LA-D酵母发酵的红枣果酒总黄酮含量呈现先下降后上升的趋势，由安琪酵母和酒曲发酵的红枣果酒总黄酮含量呈现先下降后上升再下降的过程。
图5 不同发酵剂发酵过程中总黄酮含量的变化
Fig.5 Changes of total flavonoids content during fermentation process by different fermentation starters
在发酵前期，4种发酵剂的发酵酒的总黄酮含量都有小幅度下降，分析原因可能与黄酮类物质容易发生氧化有关。在发酵中期，4种菌种发酵酒总黄酮含量都有较大幅度上升，分析原因可能是发酵中期酒精度上升，促进了黄酮类物质的溶出。在第9天时，4种菌种发酵果酒总黄酮含量：安琪酵母（3.766 mg/mL）＞薯曲（3.523 mg/mL）＞LA-D酵母（3.312 mg/mL）＞清香型曲（3.138 mg/mL）。在发酵后期，除LA-D酵母外，其他菌种发酵酒的黄酮含量均呈下降趋势，第12天时，总黄酮含量：LA-D酵母（3.490 mg/mL）＞安琪酵母（3.235 mg/mL）＞薯曲（3.122 mg/mL）＞清香型曲（3.016 mg/mL），结果分析可能是果酒在发酵过程中，酵母释放的次级代谢产物会和黄酮类物质反应，生成一些大分子衍生物，或是由于发酵后期的代谢活动以及菌种对营养物质及活性成分的利用导致总黄酮含量下降[25-26]。
2.7 不同发酵剂发酵过程中总多酚含量的变化
酚类化合物是良好的还原剂，是枣汁中化学性质较为活泼的一类化合物，有清除自由基、抗老化等作用。另外在预防多种疾病中也起着至关重要的作用，如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病和其他慢性病。通过测定总酚含量，可判断出抗氧化性的变化趋势[27-30]。
图6 不同发酵剂发酵过程中总多酚含量的变化
Fig.6 Changes of total polyphenol content during fermentation process by different fermentation agents
由图6可知，经过不同酵母和酒曲的发酵，其总多酚含量变化趋势各不相同，分析原因可能因为多酚类物质易受光照、温度以及微生物活动的影响，因此在发酵过程中变化较大[31]。LA-D酵母发酵酒的总多酚含量随发酵时间的延长其趋势呈现先下降后上升，第6天后逐渐趋于平衡，并在第12天时达到0.212 mg/mL。安琪酵母发酵酒的总多酚含量随发酵时间的延长呈现先上升，于第6天达到最高值0.250 mg/mL后呈下降趋势。清香型曲总多酚的含量随发酵时间的延长呈现先略微降低再逐渐上升，并于第12天时达到最高值为0.273 mg/mL。薯曲发酵的红枣果酒，其总多酚含量随发酵时间的延长基本处于平缓趋势。发酵前期总多酚含量上升可能是枣汁中的多酚被释放，一直到发酵中期酒精度增加，使得多酚更多地溶出，但随着发酵时间的延长多酚被部分氧化而损失，或在发酵中与金属离子发生络合反应，与多糖等大分子发生结合，导致酚类含量降低[11，32]。
2.8 不同发酵剂发酵过程中氨基酸态氮含量的变化
氨基酸态氮含量可直接反映果酒中氨基酸的含量[33]。由图7可知，酵母类发酵酒的氨基酸态氮含量随着发酵时间的延长呈现先下降后上升的趋势，酒曲类发酵酒氨基酸态氮含量随发酵时间的延长呈现先上升后下降的趋势。在红枣果酒发酵末期，LA-D酵母发酵酒和安琪酵母发酵酒的氨基酸态氮含量分别为933.3mg/100mL、840.0mg/100mL，薯曲发酵酒和清香型曲发酵酒的氨基酸态氮含量分别为930.8 mg/100 mL、852.3 mg/100 mL。
图7 不同菌种发酵过程中氨基酸态氮含量的变化
Fig.7 Changes of amino nitrogen content during fermentation process by different fermentation starters
2.9 不同发酵剂发酵过程中抗氧化活性的变化
2.9.1 不同发酵剂发酵过程中DPPH·清除能力的变化
DPPH·是一种化学性质较为稳定的以氮为中心的自由基，不易被清除。若受试物能够清除DPPH·，则表示受试物具有较强自由基清除能力[34]。经过4种不同发酵剂发酵的红枣果酒的DPPH·清除率如图8所示。由图8可知，LA-D酵母发酵酒和清香型曲发酵酒的DPPH·清除率随发酵时间的延长一直呈现上升趋势，而安琪酵母发酵酒和薯曲发酵酒随发酵时间的延长呈先上升后下降再上升的趋势。经LA-D酵母发酵结束后的红枣果酒对DPPH·的清除能力为92.8%，表明红枣果酒是一类比较强的自由基猝灭剂，分析原因可能是红枣果酒中的多酚和黄酮具有良好的自由基清除能力。
图8 不同菌种发酵过程中DPPH自由基清除率的变化
Fig.8 Changes of DPPH radical scavenging activity during fermentation process by different fermentation starters
2.9.2 不同发酵剂发酵对红枣果酒还原力的变化
还原能力是衡量抗氧化能力的重要指标。具有还原性的物质可以发生氧化反应，从而保护其他物质，达到抗氧化的目的[35]。不同菌种发酵对红枣果酒还原力的影响如图9所示。由图9可知，4种发酵剂的还原力呈现先下降后缓慢升高的趋势，在发酵12 d时，LA-D酵母、安琪酵母、清香型曲和酒曲发酵酒的还原力分别为2.425、2.425、2.501、2.487，酒曲类发酵酒的还原力高于酵母类发酵酒的还原力。还原力与多种抗氧化机制有关，分析原因可能是酒曲类菌种发酵枣酒中的物质成分复杂，从而可能影响还原力[27]。
图9 不同菌种发酵过程中还原力的变化
Fig.9 Changes of reducing power during fermentation process by different fermentation starters
2.9.3 不同发酵剂发酵过程中羟基自由基清除率的变化
羟基自由基的化学性质非常活泼，可损伤蛋白质、脂质、核酸等多种生物大分子，尤其对脂质过氧化的作用最强[36]。由图10可以看出，在发酵前期，4种发酵酒的羟基自由基清除能力呈上升趋势，分析原因可能是因为果酒中的维生素等多种具有抗氧化作用的成分被浸提出来。发酵到第6天后，安琪酵母继续呈现上升趋势，并在12d时为97.69%，但清香型曲和薯曲呈现下降后略微上升趋势，LA-D酵母呈现下降趋势，并在12 d时羟基自由基清除率分别为75.68%、72.83%和77.38%。分析原因可能是由于空气的存在导致的[17]。结果表明，用4种不同菌种的发酵酒的羟基自由基清除率安琪酵母最好。
图10 不同菌种发酵过程中羟基自由基清除率的变化
Fig.10 Changes of hydroxyl radical scavenging rate during fermentation process by different fermentation starters
2.9.4 不同发酵剂发酵过程中超氧阴离子自由基清除率的变化
超氧阴离子是一种由氧激发的自由基。生理状态下，由于细胞内存在一些抗氧化酶类可及时清除它们，因而对机体无害。但在病理条件下，氧自由基生成过多或机体抗氧化酶类活性下降可导致其在体内大量积聚对细胞造成损伤[27，37]。从图11可以看出，随着红枣果酒发酵时间的延长，4种发酵酒的超氧阴离子自由基清除率基本均呈上升趋势，最终结果均高于未发酵时，且在发酵结束后，清香型曲（88.16%）和LA-D酵母（88.75%）发酵酒的清除率高于其他2种，安琪酵母为63.60%，薯曲为70.96%。结果表明，由LA-D酵母发酵的红枣果酒的超氧阴离子自由基清除能力最高。
图11 不同菌种发酵过程中超氧阴离子自由基清除率的变化
Fig.11 Changes of superoxide anion radical scavenging rate during fermentation process by different fermentation starters
3 结论
本实验以稷山板枣为原料，经过对LA-D酵母、安琪酵母、清香型酒曲和薯曲4种不同的发酵剂发酵红枣果酒的理化指标和感官评价进行测评，筛选出适合红枣果酒发酵的菌种为帝伯仕LA-D酵母。该酵母发酵性能优良且发酵后的红枣果酒品质优良，香味协调，酸甜可口，枣香味浓郁，苦味较小，酒体澄清呈琥珀色。其发酵结束后酒精度为10.6%vol，总黄酮、总多酚含量分别为3.490 mg/mL、0.212 mg/mL，VC含量和氨基酸态氮含量分别为213.37 mg/100 mL、933.3 mg/100 mL，超氧阴离子自由基清除率为88.75%，DPPH自由基清除率为92.8%，还原力为2.452，羟基自由基清除率为77.38%，具有良好的抗氧化活性。因此，帝伯仕LA-D酵母发酵酒对红枣果酒的开发具有重要价值。
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