南烛（Lyonia ovalifolia）又名乌饭树（Vaccinium bracteatum Thunb）。其为杜鹃花科、越橘属常绿灌木或乔木，在我国分布范围很广，尤以华东、中南至西南以及台湾等地居多[1]。南烛叶在民间的食用历史悠久[2-3]，侗族有每年三月三利用乌饭树汁染色米饭食用的历史。民国时期用南烛叶染色制成的黑官膳，更是名噪一时。如今乌饭菜肴依旧有迹可循，在江苏无锡就有专门乌米饭产品。很多学者也对其进行了研究探索[4]，发现其叶的提取物具有很好的抑菌[5-9]、降糖[10]、抗氧化[11-16]、抗疲劳[17-18]等效果。在食品生产过程中，为保证品质及增加其耐储藏性，常在食品中应用如苯甲酸、山梨酸及其盐类等的化学防腐剂，这虽然能起到一定的防腐抑菌效果，但其在食品中的用量受到严格的限制。且随着广大消费者对食品质量安全的高度关注，天然防腐剂以其更高的安全性逐渐受到青睐[19]。因此，从南烛叶中开发出一种天然抑菌剂，具有非常高的研究价值。
近年来，章海燕等[20-21]研究发现，南烛叶水提粗黄酮的抑菌效果强于山梨酸钾的抑菌效果，且在研究南烛叶不同提取物的抑菌作用时，发现南烛叶乙醇浸提物比水浸提物抑菌效果更明显；李艳丽等[22]的研究表明，南烛叶乙醇提取液可显著延长馒头、面条等的保质期，效果与化学防腐剂基本相当。但从已有的文献资料来看，大多从南烛叶不同提取条件、不同菌种、不同提取物来比较南烛叶抑菌差异，鲜见不同状态下的南烛叶抑菌效果的比较研究。因此，本研究在相同提取条件下用无菌水分别浸提新鲜南烛叶和南烛叶干粉，比较研究二者水提物对5种供试细菌及6种供试真菌的抑制作用，以期为天然抑菌剂的深度开发及利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与菌种
新鲜南烛叶（水分含量为61.64%，总黄酮含量24.4312mg/g干物质）：采自安徽省宣城市宣州区沈村镇郊区的山上的南烛灌木；南烛叶干粉（水分含量为6.51%，总黄酮含量11.881 2 mg/g干物质）：安徽省宣城市森林之宝农林开发有限公司。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、沙门氏菌（Salmonella）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、红酵母（Rhodotorula）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、毛霉（Mucor）、根霉（Rhizopus）：均由本校食品科学技术学院菌种保藏中心提供；生理盐水（0.85%）：实验室自行配制。
1.1.2 培养基
营养肉汤（nutrient broth，NB）培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，pH自然。
马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextrose agar，PDA）培养基：马铃薯300 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15 g/L，pH自然。
平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基：胰蛋白胨5.0 g/L，酵母膏粉2.5 g/L，葡萄糖1.0 g/L，琼脂15.0 g/L，pH自然。
1.2 仪器与设备
SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵：邦西仪器科技（上海）有限公司；2代XY-100型高速多功能粉碎机：浙江省永康市松青五金厂；722N可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；PHS-25 pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；DK-98-IIA恒温水浴锅、101-2AB型电热鼓风干燥箱、SPX-250BⅢ生化培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；LDZX-50KBS立式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；不锈钢小管（内径6 mm、外径8 mm牛津杯）：上海申源科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 新鲜南烛叶及南烛叶干粉水提物的制备[23]
准确称取经高速多功能粉碎机粉碎的新鲜南烛叶粉末和南烛叶干粉，使其分别含南烛叶干物质10 g，置于烧杯中并分别加入适量无菌水，使其干物质与水质量之比为1∶20（g∶mL），均调节至pH=4.0。同时放入80 ℃恒温水浴锅中提取2 h后抽滤，分别取其滤液并浓缩至10 mL，得到新鲜南烛叶和南烛叶干粉水提物原液，同时置于121℃条件下灭菌20 min，备用。
1.3.2 供试菌悬液的制备[24-27]
在超洁净工作台上，取活化好的菌种，每种供试细菌用接种环挑取一环于100 mL盛有玻璃珠的营养肉汤培养基中，37℃摇床200 r/min振荡培养24 h。使用无菌移液枪分别移取1 mL已培养24 h的细菌菌悬液，置于盛有玻璃珠的100 mL无菌生理盐水中；每种供试真菌用接种环挑取5环置于盛有玻璃珠的100mL无菌生理盐水中。细菌、真菌生理盐水混合液分别于37℃、28℃摇床200 r/min振荡培养2 h，调节其菌液浓度为1×106CFU/mL，制成供试菌悬液。
1.3.3 滤纸圆片法测定[28-29]
用打孔器制成6 mm直径的圆滤纸片，灭菌后备用。采用浸泡法将等量滤纸片分别放入上述制备的新鲜南烛叶、南烛叶干粉水提物以及灭菌生理盐水中，置于200 r/min摇床振荡2 h，使滤纸片充分吸收水提物、生理盐水至饱和。
在无菌操作条件下，用无菌移液枪移取0.1 mL供试菌悬液于制备好的平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，放置片刻。将浸泡好的滤纸片装入无菌平皿，方便夹取。用已灭菌的镊子夹取滤纸片，在平皿壁上沥去多余浸泡液，轻轻放置于培养基平板表面，每个平板等距放入5张滤纸片，其中4张为浸有水提物的滤纸片，1张为浸有无菌生理盐水的滤纸片作对照。细菌于37℃恒温培养箱倒置培养24 h，霉菌及酵母于28℃倒置培养48 h。每一种菌做3次重复试验，记录并计算每个重复试验的数据及平均值。
1.3.4 牛津杯法测定[30-31]
在无菌操作条件下，用无菌移液枪移取0.1 mL供试菌悬液于制备好的平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，放置片刻，用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯平置于平板表面，轻轻按压使每个牛津杯杯底与平板连接紧凑，每个平板等距放入3个牛津杯，其中两个牛津杯用移液枪分别加入0.25 mL无菌新鲜南烛叶水提物，另一个牛津杯加入0.25mL无菌生理盐水作对照。将平板正置于恒温培养箱中，细菌37℃培养24 h，霉菌及酵母28℃培养48 h。每一种菌做3次重复试验，分别测量各个抑菌圈的两个垂直直径大小，计算每个重复试验的平均值。
1.3.5 数据处理
上述数据均采用3次平行样，采用平均值±标准差计算，统计方差分析方法见文献。
2 结果与分析
2.1 新鲜南烛叶与南烛叶干粉水提物滤纸圆片法抑菌效果
新鲜南烛叶与南烛叶干粉水提物滤纸圆片法抑菌试验结果见表1。
由表1可知，根据抑菌圈直径明显＞6 mm有抑菌性，南烛叶干粉与新鲜南烛叶水提物均对5种试验细菌有抑菌作用，但对6种试验霉菌及酵母无明显抑菌效果。南烛叶干粉水提物对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌的平均抑菌圈直径分别为11.38 mm、8.97mm、9.63mm、10.09mm、8.31mm。对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制活性极显著优于新鲜南烛叶（P＜0.01）；而对大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌的抑菌效果与新鲜南烛叶相差不大。可能与滤纸圆片法操作简单，步骤便捷，但水提物浸泡滤纸片法滤纸片所吸收的药液量不好控制，易造成试验误差[32]，不适于进行定量试验有关[33]。
表1 两种水提物对11种供试菌的滤纸圆片法抑菌效果（x±s，n=12）
Table 1 Antibacterial effect of two aqueous extract against 11 tested microbes by filter paper method(x±s，n=12)
注：“-”表示没有明显的抑菌圈；“*”表示与新鲜南烛叶比较差异显著（P＜0.05），“**”表示与新鲜南烛叶比较差异极显著（P＜0.01）。下同。
菌种抑菌圈直径/mm新鲜南烛叶水提物南烛叶干粉水提物生理盐水金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）大肠杆菌（Escherichiacoli）枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）沙门氏菌（Salmonella）啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）红酵母（Rhodotorula）黑曲霉（Aspergillusniger）米曲霉（Aspergillusoryzae）毛霉（Mucor）根霉（Rhizopus）8.58±0.30 8.06±0.76 8.15±0.78 8.30±0.84 8.00±0.49 11.38±0.78**8.97±0.75 9.63±0.96 10.09±0.76**8.31±0.85- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - - - -
2.3 新鲜南烛叶与南烛叶干粉水提物牛津杯法抑菌效果
新鲜南烛叶与南烛叶干粉水提物牛津杯法抑菌试验结果见表2。
表2 两种水提物对11种供试菌牛津杯法抑菌效果（x±s，n=6）
Table 2 Antibacterial effect of two aqueous extract against 11 tested microbes by Oxford cup method(x±s，n=6)
菌种抑菌圈直径/mm新鲜南烛叶水提物南烛叶干粉水提物生理盐水金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）大肠杆菌（Escherichiacoli）枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）沙门氏菌（Salmonella）啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）红酵母（Rhodotorula）黑曲霉（Aspergillusniger）米曲霉（Aspergillusoryzae）毛霉（Mucor）根霉（Rhizopus）24.92±0.64 12.17±2.70 13.25±1.69 14.79±1.81 9.40±1.79 28.25±0.83**14.75±2.35*16.25±1.23**16.42±1.98**13.69±2.15**- - - - - -- - - - - -- - - - - - - - - - -
由表2可知，根据抑菌圈直径明显大于8 mm有抑菌性，本结果中两种南烛叶水提物均对5种供试细菌都有抑制作用，但对6种试验霉菌及酵母无明显抑菌效果。南烛叶干粉水提物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的平均抑菌圈直径分别达28.25 mm、16.42 mm、16.25 mm、13.69 mm，均极显著优于新鲜南烛叶（P＜0.01），对蜡样芽孢杆菌的平均抑菌圈直径为14.75 mm，显著优于新鲜南烛叶（P＜0.05）。金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈结果表明，两种水提物均对革兰氏阳性菌作用相对较强；沙门氏菌的抑菌圈结果显示，两种水提物对革兰氏阴性菌的抑菌作用相对较弱。这可能与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁的结构层次、组成成分有关。革兰氏阴性菌的细胞壁结构层次与成分较为复杂。而革兰氏阳性菌的细胞壁则主要由磷壁酸和肽聚糖组成，层次单一，成分较为简单[34]。这使得革兰氏阳性菌对理化因子的敏感性强于革兰氏阴性菌[35]。
本试验显示，南烛叶干粉水提物及新鲜南烛叶水提物对5种被测细菌的抑菌圈大小均呈现出金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌＞蜡样芽孢杆菌＞沙门氏菌。李艳丽等[22]研究表明，在牛津杯法测试中，南烛叶乙醇提取物对测试细菌均有抑菌效果，且同种南烛叶水提物对金黄色葡萄球菌的抑菌抑菌圈直径大于大肠杆菌抑菌直径，这与本试验的结果一致。但其结果还显示，牛津杯法测试中南烛叶乙醇提取物对毛霉、曲霉均有明显抑菌效果，这与本试验的结果不一致。原因可能是其南烛叶提取采用乙醇为溶剂，在抑菌试验中其乙醇并未脱除，致使南烛叶醇提物对毛霉、曲霉的抑菌活性物质来源于具有一定杀菌功效的乙醇。
2.4 讨论
在本研究中南烛叶干粉水提物对同种测试细菌的抑制效果优于新鲜南烛叶水提物，根据王立等[36]研究的南烛叶提取物主要成分为总糖约为52.1%，黄酮约为20.6%，蛋白质约为3.08%，脂肪约为0.9%，表明南烛叶提取物中总糖的含量远高于黄酮含量。章海燕等[21]研究的南烛叶水浸提物、乙醇浸提物及粗多糖在相同条件下对大肠杆菌的最低抑菌浓度分别为15.30mg/mL、3.5750mg/mL、13.135mg/mL，表明南烛叶提取物中的粗多糖也具有很好的抑菌效果，且南烛叶粗多糖对大肠杆菌的抑菌效果优于水浸提物。杨冬梅等[37]研究的干香菇干物质提取的粗多糖为11.79 mg/g，而鲜香菇仅为5.37mg/mL，且在同种菌的抑制作用上，干香菇粗提物要优于鲜香菇粗提物。推测南烛叶干粉水提物中的粗多糖含量高于新鲜南烛叶水提物，其与黄酮的共同作用致使南烛叶干粉水提物对同种测试细菌的抑制效果优于新鲜南烛叶水提物，但其中的机理还有待于进一步研究考察。
3 结论
本研究采用滤纸圆片法和牛津杯法对两种南烛叶水提物对11种受试菌的抑菌效果进行了比较研究。结果表明，两种水提物均对被测霉菌及酵母无明显抑菌效果，均对被测细菌有显著的抑制作用。牛津杯法定量试验结果更佳，南烛叶干粉水提物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的平均抑菌圈直径分别达28.25 mm、16.42 mm、16.25 mm、13.69 mm，均极显著优于新鲜南烛叶（P＜0.01），对蜡样芽孢杆菌的平均抑菌圈直径为14.75mm，显著优于新鲜南烛叶（P＜0.05）。
本实验首次将新鲜南烛叶与南烛叶干粉水提物抑菌效果比较作为研究对象，为创新型植物源抑菌剂开辟了一条新途径。而对于南烛叶的抑菌机理、抑菌活性物质成分及含量、量效关系等方面还有待于更进一步的探讨探究。
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