乳蛋白在加工或者胃肠消化过程中由于酶的作用能够产生生物活性肽，被认为是许多生物活性肽的重要来源。生物活性肽含有2～20个氨基酸残基，以不同排列和组成方式构成，具有免疫调节、降血压、抑菌、抗氧化、抗癌等作用[1-4]，可对多种代谢和生理功能进行积极调节，从而影响机体健康[5]。近年来，随着消费者对生活质量提高的持续关注以及功能性食品的开发，生物活性肽成为医药、食品等领域的研究热点。
干酪富含乳蛋白，在加工过程特别是在成熟过程中，因自身存在的降解蛋白质的纤溶酶、凝乳酶和微生物活动所释放的蛋白酶、肽酶等的作用，产生了具有抗氧化、抑菌和降血压等功能的多肽。已在Blue、Danablue、Munster、Camembert和Brie等干酪中发现了水溶性肽和体积分数为70%乙醇可溶性肽均具有显著抗氧化作用[6]。在Pecorino Romano干酪水溶性提取物中发现了抑菌肽[7]。在Cheddar干酪中鉴定出了6条具有血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）抑制作用的多肽[8]。干酪生物活性肽的形成与蛋白质降解密切相关，而凝块pH值、盐含量、成熟条件、发酵剂等均影响蛋白质降解[9]，因此不同干酪的多肽组成和生物活性具有差异[10]。
牦牛乳硬质干酪以生活在青藏高原海拔3 000 m以上的牦牛乳为原料，经凝乳、发酵、排乳清等工序后制作而成，成熟期长，营养价值高。前期研究发现，提高成熟温度能够促进牦牛乳硬质干酪的蛋白质降解，加快干酪成熟[11]，本文拟研究成熟温度和时间对牦牛乳硬质干酪中生物活性肽的影响，以探究牦牛乳硬质干酪生物活性肽的形成规律，为深入挖掘牦牛乳硬质干酪的功能特性提供科学依据和参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牦牛乳：采自甘肃省天祝藏族自治县抓喜秀龙乡；CHOOZIT型乳酸菌发酵剂[保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）]：丹麦丹尼斯克公司；精制小牛凝乳酶（酶活力10万U/g）：兰州生物技术有限公司；金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaures）、大肠杆菌（Escherichia coli）：本实验室保藏；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；牛肉膏（生化试剂）：北京双旋微生物培养基制品厂；蛋白胨（生化试剂）：上海中秦化学试剂有限公司；琼脂（生化试剂）：上海山浦化工有限公司；马尿酰-组氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL）、血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）：美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
干酪槽：本实验室自制；TGL-20高速台式冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；UV-5100真空包装机：广东中山市名康包装机械厂；723紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；Scientz-10ND真空冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；HZQ-X300电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 干酪制作
参考刘兴龙等[12]的方法制作干酪。新鲜干酪在5℃、10℃、15℃分别成熟4、5、6个月后，将不同成熟阶段的干酪储藏在-18℃备用。
1.3.2 干酪水溶性多肽的提取
参考RIZZELLOCG等[7]的方法提取。以料液比1∶3（g∶mL）加入50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0），150 r/min、40℃恒温振荡1h后，4℃、4 200 r/min离心30 min，除去上层脂肪后，滤纸真空过滤，将滤液pH值调至4.6，4℃、7 500 r/min离心10 min后，即获得上清液，上清液通过0.22μm滤膜过滤，真空冷冻干燥，-18℃储藏备用。
1.3.3 干酪水溶性多肽抗氧化活性测定
参考SUN T等[13]的方法略作改进。将2 mL样液和2 mL 0.125 mmol/L DPPH溶液，充分振摇后，置于暗处室温反应30 min，再在波长517 nm处测得吸光度值A，以等体积无水乙醇代替DPPH溶液，测得吸光度值Ab，以等体积蒸馏水代替样品溶液，测得吸光度值A0，按下列公式计算样品对DPPH自由基的清除率：
1.3.4 干酪水溶性多肽抑菌活性测定
参照曾维才等[14]的方法略作修改。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为抑菌对象，采用打孔法进行抑菌活性测定。将一定浓度的菌悬液按照1∶10（V/V）倒入培养基混合均匀后倒平板，并打孔形成直径8 mm孔洞，将一定浓度干酪水溶性多肽0.1mL注入孔内，生理盐水作空白对照，37℃培养24 h后，观察抑菌效果，每组重复3次，取平均值。
1.3.5 干酪水溶性多肽ACE抑制活性测定
参考杨铭等[15]的方法测定。样品组（A）加入200μLHHL和100μLACE抑制剂；对照组（B）加入200μLHHL；空白组（C）加入250 μL、1 mol/L HCl和200 μL HHL，37 ℃水浴中加热3 min，同一温度条件下均加入20 μLACE反应30 min；再在A组加入250 μL HCl终止反应；B组加入250 μL HCl和100℃硼酸钠缓冲液；C组加入100 μL硼酸钠缓冲液。每组试剂在5 mL离心管中混匀，反应结束后加入1.7 mL乙酸乙酯，振荡、混匀后，4℃、4000r/min离心15min，吸取1.0mL乙酸乙酯于试管中，120℃烘干30min，加入3mL去离子水，在波长228 nm处测定吸光度值A。按下列公式计算样品对ACE的抑制率：
1.3.6 数据统计与分析
采用SPSS19.0对试验数据进行处理，如果方差分析差异显著，用Duncan法进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 成熟条件对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽抗氧化性的影响
DPPH自由基是一种稳定的有机自由基，能接受抗氧化剂提供的电子或质子形成稳定化合物[16]，因此，本试验以清除DPPH自由基的能力来衡量干酪水溶性多肽的抗氧化活性。不同温度及成熟时间对牦牛乳硬质干酪DPPH自由基清除率的影响结果见表1。
由表1可知，成熟温度≤10℃之前、成熟时间在4～5个月时，干酪水溶性多肽对DPPH自由基清除率呈现增加趋势，成熟时间在5～6个月时，其水溶性多肽对DPPH自由基清除率呈现降低趋势，且成熟5、6个月干酪的水溶性多肽的抗氧化性之间存在显著性差异（P＜0.05）。成熟温度为15℃时，干酪水溶性多肽抗氧化作用呈现降低趋势，且成熟5、6个月干酪的水溶性多肽抗氧化作用没有显著性差异（P＞0.05）。GUPTA A等[17]对不同成熟阶段Cheddar干酪抗氧化性研究发现，成熟4个月之前，干酪抗氧化作用增强，4个月后，干酪抗氧化性降低，在7～9个月期间，保持不变。4℃储藏20d和25℃储藏5 d的Himalayan干酪的水溶性多肽的抗氧化性增强，而-18℃储藏20 d的干酪抗氧化性不受影响[18]。方差分析显示，成熟温度、时间及两者交互作用对干酪水溶性多肽抗氧化作用影响极显著（P＜0.01）。
表1 成熟温度和时间对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽DPPH自由基清除率的影响
Table 1 Effect of ripening temperature and time on DPPH radical scavenging rate of water-soluble peptides in hard cheese made by yak milk
注：小写字母不同表示相同成熟温度条件下差异显著（P＜0.05）；大写字母不同表示相同成熟时间条件下差异显著（P＜0.05）。下同。
成熟时间/月DPPH自由基清除率/%5℃ 10℃ 15℃456 6.53±0.93bC 20.38±2.00aB 3.91±2.68bB 22.41±0.58bB 28.70±0.67aA 7.51±0.53cB 30.20±0.32aA 21.86±1.22bB 20.62±2.30bA
2.2 成熟条件对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽抑制大肠杆菌的影响
不同成熟温度及时间对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽抑制大肠杆菌的作用结果见图1。从图1可知，在4～6个月成熟过程中，5℃、10℃、15℃成熟干酪的水溶性多肽对大肠杆菌的抑制程度分别呈现增强趋势，且5℃、10℃、15℃成熟6个月干酪的水溶性多肽分别比相同温度成熟4个月干酪对大肠杆菌的抑制作用显著提高15.43%、12.44%和8.32%（P＜0.05）。
图1 成熟温度和时间对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽抑制大肠杆菌的影响
Fig.1 Effect of ripening temperature and time on antimicrobial activity of soluble peptides of hard cheese made by yak milk against Escherichia coli
成熟温度从5℃提高至15℃时，干酪水溶性多肽对大肠杆菌的抑菌作用也呈显著增加趋势（P＜0.05）。15℃成熟4个月干酪的水溶性多肽比5℃相同成熟时间干酪的水溶性多肽对大肠杆菌的抑制程度显著提高13.48%（P＜0.05），15℃成熟6个月干酪的水溶性多肽对大肠杆菌的抑制程度比5℃相同成熟时间干酪的水溶性多肽显著提高6.49%（P＜0.05）。方差分析显示，成熟温度、时间对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽抑制大肠杆菌的效果影响显著（P＜0.05）。FIALHO T L等[19]发现源自卡纳斯特拉的手工干酪的水溶多肽也能抑制大肠杆菌。
2.3 成熟条件对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽抑制金黄色葡萄球菌的影响
从图2可知，5℃、10℃、15℃成熟的牦牛乳硬质干酪的水溶性多肽均对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，在4～6个月成熟过程中，对金黄色葡萄球菌的抑制程度分别呈现增强趋势。5℃成熟5个月与成熟4个月、6个月干酪的水溶性多肽对金黄色葡萄球菌的抑制作用之间没有显著差异（P＞0.05），5℃成熟6个月比相同温度成熟4个月干酪的水溶性多肽对金黄色葡萄球菌的抑制作用显著高13.55%（P＜0.05）。10℃、15℃成熟6个月比相同温度成熟4个月干酪的水溶性多肽对金黄色葡萄球菌的抑制作用分别显著提高16.36%和12.02%（P＜0.05）。
图2 成熟温度和时间对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽抑制金黄色葡萄球菌的影响
Fig.2 Effect of ripening temperature and time on antimicrobial activity of soluble peptides of hard cheese made by yak milk againstStaphylococcus aureus
成熟温度从5℃提高至15℃时，干酪水溶性多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌作用也呈增加趋势。15℃成熟4个月比5℃成熟相同时间干酪的水溶性多肽对金黄色葡萄球菌的抑制程度显著提高8.25%（P＜0.05），15℃成熟6个月干酪比5℃成熟相同时间的干酪的水溶性多肽对金黄色葡萄球菌的抑制程度显著提高6.80%（P＜0.05）。方差分析显示，成熟温度、时间对牦牛乳硬质干酪抑制金黄色葡萄球菌的效果显著（P＜0.05）。
结合图1和图2，在成熟时间较短时，提高成熟温度，干酪水溶性多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果增加明显，而成熟时间较长时，提高成熟温度后，干酪水溶性多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果增加减缓。比较图1、图2发现，干酪水溶性多肽对大肠杆菌的抑制效果强于金黄色葡萄球菌。
2.4 成熟条件对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽抑制ACE活性的影响
由于ACE活性的增强能够导致机体血压升高，因此本试验通过间接测定抑制ACE活性的效果来评价干酪水溶性多肽的降血压作用。不同成熟温度及时间对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽抑制ACE活性的结果见图3。
图3 成熟温度和时间对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽抑制血管紧张素转换酶活性的影响
Fig.3 Effect of ripening temperature and time on angiotensin converting enzyme inhibitory activity of soluble peptides in hard cheese made by yak milk
从图3可知，5℃、10℃、15℃成熟的牦牛乳硬质干酪，在4～6个月成熟过程中，其水溶性多肽对ACE的抑制率均呈现先减小后增大趋势，且5℃、10℃、15℃成熟6个月干酪的水溶性多肽对ACE的抑制率比相同温度成熟4、5个月干酪都高。SAITO T等[20]发现成熟24个月的Gouda干酪中ACE抑制活性（78.2%）强于成熟8个月的Gouda干酪（75.5%）。15℃成熟5个月干酪的水溶性多肽对ACE的抑制率比相同温度成熟4个月干酪显著降低3.30%（P＜0.05），而5℃成熟5个月干酪的水溶性多肽对ACE的抑制率比相同温度条件下4个月干酪显著降低8.55%（P＜0.05）。
当成熟温度从5℃提高至15℃时，干酪水溶性多肽对ACE抑制率呈现增加趋势。15℃成熟4个月干酪的水溶性多肽的ACE抑制率显著比5℃成熟相同时间干酪提高3.35%（P＜0.05），而15℃成熟6个月干酪的水溶性多肽的ACE抑制率显著比5℃成熟相同时间干酪提高7.07%（P＜0.05）。这主要是由于高温成熟的牦牛乳硬质干酪的蛋白质降解程度高于低温成熟干酪[11]。ONG L等[21]报道了添加益生菌附属发酵剂、8℃成熟12周的Cheddar干酪中ACE抑制作用显著强于4℃成熟干酪。SAHINGIL D等[22]研究发现，用瑞土乳杆菌（Lactobacillus helveticus）作为附属发酵剂，12℃成熟的盐腌干酪具有较高的ACE-I抑制肽含量。方差分析显示，成熟温度、时间对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽抑制ACE的作用显著（P＜0.05）。
3 讨论
生物活性肽的肽段在完整蛋白质中没有活性，一旦被酶降解后，将产生活性。对干酪而言，由于成熟过程中蛋白质降解程度的不断加深，产生的生物活性肽被进一步降解，从而导致其功能特性丧失[23]。本试验发现成熟温度和时间的变化引起牦牛乳硬质干酪水溶性多肽清除DPPH自由基、抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及ACE活性的能力发生变化。成熟温度较高时，牦牛乳硬质干酪水溶性多肽抗氧化活性达到较强的成熟时间缩短，而成熟温度降低时，干酪水溶性多肽抗氧化作用达到较强的时间延长。成熟温度从5℃提高至15℃时，干酪水溶性多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及ACE的抑制作用呈现增强趋势，且与蛋白质降解程度显现一定的相关性。
干酪成熟过程中蛋白质降解处于复杂的动态变化。随着干酪中微生物的自溶[24]，部分生物活性肽又被降解。成熟6个月的Parmesan干酪中源自as1-酪蛋白降解的降血压肽在成熟15个月干酪中未被发现[25]。干酪生物活性肽的产生与积累依赖于其成熟过程中蛋白质降解所产生的肽的形成与降解间的平衡。提高牦牛乳硬质干酪的成熟温度导致干酪12%可溶性氮含量、亲水性肽含量增多以及疏水性肽含量减少[11]，结合本试验的研究结果，在干酪成熟过程中，提高成熟温度能够导致生物活性肽功能性强或者含量高的生物活性肽提前释放。但是，具体生物活性肽的结构特征和性质还有待于下一步研究。
4 结论
经不同温度和时间成熟的牦牛乳硬质干酪的水溶性多肽具有抗氧化、抑菌和降血压特性，且成熟温度和时间对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽的生物活性有较大影响。成熟温度、时间对牦牛乳硬质干酪水溶性多肽的抗氧化作用具有极显著影响（P＜0.01），对抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和ACE的影响显著（P＜0.05）。5℃、10℃成熟5个月、15℃成熟4个月牦牛乳硬质干酪的水溶性多肽对DPPH自由基清除率分别达到最高。5℃、10℃、15℃成熟的牦牛乳硬质干酪水溶性多肽在4～6个月成熟过程中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制程度分别呈增强趋势。成熟温度从5℃提高至15℃时，牦牛乳硬质干酪水溶性多肽的抑菌程度和ACE抑制率呈增强趋势。
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