黑加仑学名黑穗醋栗（Ribes nigrum L.），又称紫梅或黑豆果，成熟果实为小浆果，味酸甜、多汁。常见于我国黑龙江、吉林、内蒙古、青海、新疆等地区[1]。黑加仑果实中含有丰富的花色苷、多糖、有机酸、多酚类物质、氨基酸及钙、磷、铁、铜、锌、锰、镁等多种矿物质元素，其中花色苷可以保护视力。由于黑加仑可预防高血压、心脏病，具有提高免疫力、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等功效，因此具有较高的市场价值和开发潜力[2]。
酵素是使用水果、蔬菜、菌类以及食用性药材为原料，经过有益菌发酵后而得到的，含有丰富的酶类、维生素、矿物质及次生代谢产物等的功能性微生物发酵保健性食品[3-4]。酵素具有抗疲劳、抗衰老、清除自由基等功能[5]。通过有益微生物发酵产生的酵素中，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量增多，具有较好的抗氧化能力。SOD能够清除羟基自由基（OH·）、超氧阴离子自由基（O2-·）和过氧化氢等活性氧（reactive oxygen species，ROS），是细胞防御系统中的主要抗氧化酶[6]。黑加仑酵素是以黑加仑果为原料，白砂糖为辅料，经过多种有益菌发酵制得的富含多种生物活性物质和有多种微生物次生代谢产物的发酵水果饮品[7]。目前，国内市场上的酵素多数采用传统自然发酵工艺，尽管发酵周期较长，在2个月～1年不等。但是在工艺条件控制良好的情况下，自然发酵酵素的风味较好，一般不会有食用的安全风险，现已被广大消费者所接受。酵素的自然发酵过程是一个动态的复杂的混合菌发酵过程，由于多种微生物的作用，发酵过程中会产生多种有机酸，有机酸不仅赋予酵素特有的风味和口感，还能较强地维护人体肠道功能和抗氧化性能[8]。研究表明，人类的多种疾病（如炎症、糖尿病、肿瘤等）与机体中过量的自由基有关，天然酵素具有较好的抗氧化性能，净化血液，修复细胞组织，可清除人体内多余的自由基，减轻其对人类机体的伤害[9-10]。
国内已有果蔬酵素制备的相关报道，主要研究了蓝莓酵素、葡萄酵素、西兰花酵素和苹果酵素等食用植物酵素[3，9-11]。但是，目前尚未见到黑加仑酵素的相关研究报道。所以本实验以黑加仑自然发酵酵素为研究对象，测定其相关指标，并采用高效液相色谱（highperformanceliquid chromatography，HPLC）法测定酵素中有机酸的种类和含量，同时，以1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羟基自由基、2,2"-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2"-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS+）自由基清除能力和还原力为抗氧化性指标，考察其体外抗氧化性能，以期为黑加仑酵素综合性开发提供相关依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑加仑、白砂糖：市售；福林酚：国药集团化学试剂有限公司；SOD酶活力检测试剂盒、总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）：南京建成生物工程研究所；三羟甲基氨基甲烷：上海源叶生物科技有限公司；有机酸标准品：美国Sigma公司；磷酸、磷酸二氢钾（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂开发中心；甲醇（色谱纯）：阿拉丁试剂（上海）有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚、无水碳酸钠、三氯化铁、铁氰化钾、过氧化氢、硫酸亚铁、冰乙酸、维生素C等（均为分析纯）：天津大茂化学试剂厂；DPPH（分析纯）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。
1.2 仪器与设备
WS108手持式折光仪：河北润联科技开发有限公司；HR7633打浆机：飞利浦家庭电器（珠海）有限公司；HWS24型电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；EX324电子分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；DL-CJ-1N超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；TD5Z低速平衡离心机：金坛市城西春兰试验仪器厂；UV-1100紫外可见分光光度计：上海凌析达仪器有限公司；DRP-9082电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；Agilent1200高效液相色谱：美国安捷伦公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黑加仑自然发酵酵素的制备
用无菌水在无菌条件下多次轻轻冲洗黑加仑果，除去其表面沙子和灰尘后在无菌操作台中沥水、自然晾干。白砂糖用紫外灯杀菌60 min，将黑加仑与白砂糖按质量比1∶1（W/W）加入已灭过菌的磨砂口玻璃瓶中，密封瓶口。为了避免可能的菌体污染，在制备黑加仑酵素过程中，所有操作均在无菌条件进行[12]。瓶塞处安装好发酵栓后，将玻璃瓶放在避光处，室温条件下发酵225 d。发酵结束后取样进行相关指标测定。
1.3.2 主要产品指标测定
感官检验：取50 mL样品于干燥洁净的样品杯中，置于非直射日光下，目测观察外观及色泽；嗅其气味；温开水漱口后，用舌尖品尝其滋味[13]。
总酸：根据GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定方法》[14]进行测定。
菌落总数：根据GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数》[15]进行测定。
大肠菌群：根据GB 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》[16]进行测定。
沙门氏菌：根据GB 4789.4—2016《食品微生物学检验沙门氏菌检验》[17]进行测定。
金黄色葡萄球菌：根据GB 4789.10—2016《食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》[18]进行测定。
1.3.3 有机酸含量测定
Agilent1200高效液相色谱检测条件[10]：色谱柱为Supersil AQ-C18（5 μm，4.6×250 mm）；流动相：0.02 mol/L KH2PO4溶液（用磷酸调pH 2.80）；液相条件：等梯度洗脱10 min；流速1 mL/min；柱温30℃；进样量10 μL；检测波长210 nm。样品用超纯水稀释10倍，用0.22 μm滤膜过滤后直接进样，每个样品重复3次。
准确称取酒石酸10 mg，用超纯水溶解定容于10 mL容量瓶中，摇匀，即为1 mg/mL酒石酸标准液，相同的方法配制草酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、抗坏血酸、乳酸和柠檬酸标准溶液，其质量浓度分别为0.1mg/mL、1mg/mL、1mg/mL、0.1 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL，以有机酸质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，用8种有机酸标准曲线，对酵素样品中的有机酸进行定量分析。
1.3.4 体外抗氧化性能的测定
DPPH清除能力的测定：将3μL、6μL、9μL、12μL、15μL发酵样品分别加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液中，再加入450 μL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.4），25 ℃恒温水浴30 min。以去离子水为参比溶液，以4 mg/mL的VC为对照[19]。在波长517 nm处测定吸光度值，计算半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。
式中：A 0为空白对照液吸光度值；A 1为样品测定管吸光度值；A 2为样品本底管吸光度值。
羟基自由基清除能力的测定：分别取10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL发酵液，加入2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液、FeSO4溶液，摇匀静置10 min后，加入2 mL 6 mmol/L的水杨酸溶液，摇匀，37℃恒温水浴1 h，在波长510 nm处测定吸光度值A 1，以去离子水为参比溶液，测定吸光度值A 0，以同体积的蒸馏水代替水杨酸溶液，测定吸光度值A2[20]。以4 mg/mL的VC为对照，按下式计算羟基自由基清除能力，计算IC50：
ABTS+自由基清除能力的测定：分别取1μL、2μL、3μL、4 μL、5 μL发酵液，根据ABTS法总抗氧化能力试剂盒说明书进行ABTS+自由基清除能力的测定。以4 mg/mL的VC为对照，计算IC50。
还原力测定：将5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL发酵液分别加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.6），然后加入2.5 mL 1%铁氰化钾，50℃反应30 min，加入10%三氯乙酸2.5 mL，3 000 r/min离心10 min，立即取2.5 mL上清液，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL 0.1%三氯化铁。以去离子水为参比溶液，以4 mg/mL的VC为对照，在波长700 nm处测定吸光度值[21]，计算IC50。吸光度值越高，还原力越强。
1.3.5 黑加仑酵素总抗氧化能力的测定
将黑加仑酵素液3 500 r/min离心10 min后，取上清液，根据总抗氧化能力试剂盒说明书进行总抗氧化能力的测定。
1.3.6 黑加仑酵素SOD酶活力的测定
将黑加仑酵素液3 800 r/min离心10 min后，取上清液，根据SOD酶试剂盒说明书进行SOD酶活力的测定。
1.3.7 花色苷含量的测定
分别移取1 mL样液2份，分别用pH 1.0和pH 4.5的缓冲液定容至10 mL。置于暗处平衡2 h，以空白样（取1 mL蒸馏水，分别用pH 1.0和pH 4.5的缓冲液定容至10 mL）作对照，用分光光度计分别在波长510 nm和700 nm处测定吸光度值[22]。每个样品处理重复3次，取平均值。
花色苷含量计算公式如下：
式中：A为吸光度值；MW为矢车菊花素-3-葡萄糖苷的摩尔质量，449.2 g/mol；DF为稀释因子；V为最终体积，mL；ε为矢车菊花素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900；L为光程，1 cm；m为产品重量，mg。
A=（A 510nmpH 1.0-A 700nm pH 1.0）-（A510nm pH 4.5-A 700nm pH4.5）；用A 700nm消除样液浑浊的影响。
1.3.8 总多酚含量的测定
配制一系列浓度的没食子酸，加入显色剂后在波长765nm处测定吸光度值，绘制标准曲线，y=0.1792x+0.0887，R2=0.9986。称取1mL样品，加入蒸馏水至10mL，3000r/min离心10 min后，取其上清液，稀释50倍。再取稀释后的样液1 mL加入1 mL FC（福林酚）显色剂及3 mL 20%Na2CO3，混匀，于50℃水浴反应30min。在波长765nm处测定吸光度值[23]，计算总多酚含量。
2 结果与分析
2.1 黑加仑自然发酵酵素的产品指标
表1 黑加仑酵素的品质指标
Table 1 Quality indexes of blackcurrant Jiaosu
感官指标 理化指标 微生物指标色泽：玫红色，均一有光泽口味：细腻，较甜微酸香气：有黑加仑独特的香气和甜味组织状态：液态均匀粘稠，有微量沉淀杂质：无外来杂质总酸含量（以乳酸计）为2.65 g/100 mL总抗氧化能力值为614.20 U/mL SOD酶活力为1 998.30 U/mL总花色苷含量为6.63 mg/100 mL总多酚含量为8.45 mg/mL菌落总数≤100 CFU/mL大肠菌群数≤10 CFU/mL致病菌：未检出
由表1可知，发酵结束后的黑加仑酵素经过过滤得到的液态产品均匀粘稠，色泽呈有光泽的玫红色，口味较甜，略有点酸，具有独特的黑加仑香气和果香。酵素的总酸（以乳酸计）含量为2.65 g/100 mL，总抗氧化能力值为614.20 U/mL，SOD酶活力为1 998.30 U/g，总花色苷含量为6.63 mg/100 mL，总多酚含量为8.45 mg/mL；菌落总数≤100 CFU/mL，大肠菌群数≤10 CFU/mL，致病菌：未检出。所以，本实验研究的自然发酵黑加仑酵素是一种符合T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素》标准的健康饮品，不存在食用的安全风险[13]。
2.2 黑加仑酵素有机酸种类及含量分析
8种有机酸标准品及黑加仑酵素有机酸高效液相色谱图见图1，8种有机酸种类和含量见表2。由图1可知，8种有机酸标准品分离效果很好，以各有机酸标准品的质量浓度对峰面积进行线性回归，采用外标法测定黑加仑酵素有机酸种类和含量。黑加仑酵素自然发酵过程是一个复杂的多种菌类混合发酵体系，所以酵素中有机酸会随着发酵菌的代谢和生长而发生变化。由表2可知，黑加仑酵素有机酸以柠檬酸（1 567.27 mg/L）、苹果酸（220.01 mg/L）、草酸（110.01mg/L）和奎宁酸（93.73mg/L）为主，同时因发酵代谢积累了莽草酸（14.58 mg/L）。有机酸是酵素发酵过程中改变其风味的重要因素，研究表明，果蔬发酵代谢中积累了少量丙酮酸、富马酸和莽草酸，其中莽草酸是多种有机酸代谢过程的重要产物[24]。
图1 标准有机酸（A）和黑加仑酵素有机酸（B）的HPLC色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of organic acid standards(A)and organic acid from blackcurrant Jiaosu(B)
表2 黑加仑酵素有机酸种类和含量
Table 2 Species and contents of organic acid from blackcurrant Jiaosu
注：“-”表示未检出。
有机酸种类出峰顺序保留时间/min标准曲线回归方程相关系数R2质量浓度/（mg·L-1）草酸酒石酸奎宁酸苹果酸莽草酸抗坏血酸乳酸柠檬酸12345678 2.861 3.131 3.315 4.074 4.496 4.746 5.107 7.437 y=8070.2x-19.177 y=1130.9x+0.2556 y=298.88x+11.368 y=220.82x-2.490 3 y=23629x-11.719 y=5781.1x-12.723 y=522.97x-7.530 9 y=670.66x-22.727 0.9951 0.9983 0.9993 0.9998 0.9999 0.9997 0.9948 1 110.01±1.398-93.73±6.214 220.01±8.749 14.58±1.686- -1567.27±20.075
2.3 黑加仑酵素的DPPH自由基清除能力
黑加仑酵素DPPH自由基清除能力如图2所示。由图2可知，黑加仑酵素DPPH自由基清除能力表现出较强的浓度依赖性，随着样品用量的增加，DPPH清除能力近似梯度增加。黑加仑酵素的DPPH自由基清除能力从42.95%增至88.50%，对照品VC在3～9 μL范围内，DPPH自由基清除能力随着样品添加量的增加而快速增加，当用量＞9 μL之后接近平衡。经过计算，黑加仑酵素的IC50为5.18 mg VC当量/mL。
图2 黑加仑酵素对DPPH自由基的清除能力
Fig.2 DPPH free radical scavenging ability of blackcurrant Jiaosu
2.4 黑加仑酵素对羟基自由基（·OH）清除能力
图3 黑加仑酵素对羟基自由基（·OH）清除能力
Fig.3 Hydroxyl free radical(·OH)scavenging ability of blackcurrant Jiaosu
由图3可知，黑加仑酵素对羟基自由基清除能力优于VC对照，在实验浓度范围内，黑加仑酵素对羟基自由基清除能力从61.47%增至92.08%，而当VC用量＞20 μL后，对照品VC的羟基自由基清除能力趋于稳定，达到54.90%。经计算，黑加仑酵素的IC50为1.43mgVC当量/mL。
2.5 黑加仑酵素对ABTS+自由基清除能力
图4 黑加仑酵素对ABTS+自由基清除能力
Fig.4 ABTS+free radical scavenging ability of blackcurrant Jiaosu
由图4可知，黑加仑酵素对ABTS+自由基清除能力也表现出良好的浓度依赖性，其自由基清除能力略低于4 mg/mL的对照品VC，在试验浓度范围内，黑加仑酵素对ABTS+自由基清除能力从0.56 mmol/L增加至0.92 mmol/L，经过计算，黑加仑酵素的IC50为20.28 mg VC当量/mL。
2.6 黑加仑酵素还原能力
图5 黑加仑酵素还原能力
Fig.5 Reducing power of blackcurrant Jiaosu
由图5可知，黑加仑酵素还原能力总体略低于对照品VC。在试验浓度范围内，黑加仑酵素的还原力从0.285增加至0.927，当样品用量＞15μL之后，黑加仑酵素还原力接近平衡。经过计算，黑加仑酵素的IC50为39.06mg VC当量/mL。
3 结论
黑加仑经自然发酵而得到的酵素产品品质指标良好，具有较为丰富的有机酸和较好的抗氧化性能。由高效液相色谱法测定有机酸表明，黑加仑酵素中有机酸以柠檬酸（1 567.27 mg/L）、苹果酸（220.01 mg/L）、草酸（110.01 mg/L）和奎宁酸（93.73 mg/L）为主，同时因发酵代谢积累了莽草酸（14.58 mg/L）。抗氧化活性研究表明，黑加仑酵素对DPPH自由基、羟基自由基、还原力和ABTS+自由基的清除能力均表现出浓度依赖性，在试验浓度范围内，黑加仑酵素对DPPH自由基清除能力的IC50为5.18 mg VC当量/mL，对羟基自由基清除能力的IC50为1.43 mg VC当量/mL，还原力的IC50为39.06 mg VC当量/mL，对ABTS+自由基清除能力的IC50为20.28 mg VC当量/mL。因此，以黑加仑为原料，经自然发酵而产生的黑加仑酵素，具有优良的口感，丰富的有机酸和抗氧化性能，是一种具有市场潜力的功能饮品，本研究可为进一步开发黑加仑酵素功能性产品提供试验依据。
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