草莓（Fragaria ananassa）营养丰富，果实鲜红色，质软而多汁，香味浓厚，略酸微甜，富含多糖、氨基酸、维生素、矿物质及多酚类生物活性物质，具有抗癌、抗氧化、预防心血管疾病等多种功效[1]，深受大众喜爱。草莓的收获期十分集中，保质期短，采摘之后极易碰伤变质，贮藏运输中腐烂比例较高[2]。将草莓加工成兼具风味和营养的果酒，是提高草莓利用价值的一种重要途径。
影响果酒发酵特性的因素有很多，其中酵母菌接种量是一个比较重要的因素。在果酒的酿造中，酵母菌主导酒精发酵的过程，一般认为，接种量越大，起酵时间越短，降糖速率越高，耗糖量也越大。但是，较高的接种量却导致酒精度降低，酒体中的杂醇油含量升高，酯类含量减少[3-5]。然而，酵母接种量较低时，整个酒精发酵过程缓慢，最终酿制的果酒中酒精度较低，挥发酸的量较高，由此可见，过低的酵母接种量也不利于果酒的酿造[4，6]。对于不同的果酒，最适宜的酵母接种量也不一样，西瓜酒的最佳干酵母用量为0.4 g/L[6]，芡实酒适宜的干酵母用量为0.5 g/L[7]，桑葚酒干酵母用量为0.6 g/L时发酵效果最好[8]，葡萄酒的最适接种量一般在1×106～1×107 CFU/mL[9]。目前，对草莓酒的研究大都集中在发酵工艺[10]、酿酒微生物及草莓酒发酵特性方面[11]，对其接种量的研究较少。
本研究以裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）为发酵菌株，分别采用不同接种量（3%、5%、7%、9%（V/V））进行草莓酒发酵，并通过测定降糖速率、产酒精能力、产酸量及香气成分含量，考察不同接种量对草莓酒发酵特性的影响，以期确定较适宜的接种量，为草莓酒的研制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
丰香草莓：大连市水果市场；裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）：本实验室选育及保藏[12]。
果胶酶（酶活20万U/g）：河南洛阳夏盛果汁果胶酶有限公司；二氯甲烷（分析纯）：北京北化精细化学品有限责任公司；主要香气成分（正丙醇、异丁醇、乙酸异戊酯、正丁醇、乙酸正戊酯、己酸甲酯、异戊醇、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇）标准品：天津基准化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
S-3C雷磁pH值计：上海精密科学仪器有限公司；WYT-5手持糖量折光仪：上海大庆光学仪器厂；GC8900型气相色谱仪：山东经纬分析仪器有限责任公司。
1.3 试验方法
1.3.1 草莓酒加工工艺流程及操作说明
草莓→拣选→破碎→果浆→调配→酶解→接种发酵→成品
果浆制备：选择成熟度较高、无霉烂和损伤的草莓鲜果，除萼片，采用榨汁机适度破碎，得草莓果浆。
调配：在果浆中加蔗糖调整糖分为22°Bx，并在其中加入60 mg/L SO2（偏重亚硫酸钾）和0.05%果胶酶。
酶解：加入0.05%果胶酶，在40℃酶解90 min。
酵母活化液制备：取10°Bx麦汁斜面保藏的酵母菌种2环，接入5 mL浓度为10%蔗糖水溶液中，于30℃静置培养24 h。将上述培养液接入至100 mL稀释2倍的草莓汁，在30℃摇床（100 r/min）条件下培养24 h，使酵母液浓度达到1×109 CFU/mL[11]。
接种：按照一定接种量接入活化酵母液。
草莓酒发酵：将处理完的果浆分装至无菌三角瓶（300 mL/500 mL），在无菌条件下接入酵母活化液，充分混匀，用8层纱布封口，于25℃静置发酵，每隔12 h摇瓶1次，第4天用发酵栓替换纱布，再静置发酵9 d，当发酵液无气泡产生时终止发酵[12]，即得草莓酒。
1.3.2 接种量对草莓酒发酵性能的影响
以裂殖酵母为发酵菌株，分别采用不同接种量（3%、5%、7%、9%（V/V））进行草莓酒发酵，并通过测定降糖速率、产酒精能力、产酸量及香气成分含量，考察不同接种量对草莓酒发酵特性的影响。
1.3.3 分析检测
还原糖含量测定采用斐林试剂滴定法[13]；可溶性固形物含量采用手持糖量折光仪直接测定法；pH值采用pH计直接测定法；滴定酸含量测定采用电位滴定法[13]；酒精和香气成分含量测定采用气相色谱法。
样品预处理：取8层纱布过滤的酒样20mL，和等体积去离子水一同常压蒸馏，收集馏出组分35 mL，分别用15 mL、10 mL、10 mL二氯甲烷萃取3次，合并有机相，供气相色谱测定香气成分含量。
气相色谱条件：采用FFAP石英毛细管色谱柱（30 m×0.32mm，0.5μm）；程序升温：在40℃维持5min，再以15℃/min升至180℃；火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID），进样口温度均为250℃；载气为氮气（N2），流量30mL/min，氢气（H2）流量30 mL/min，空气流量300 mL/min；分流比为1∶50；柱前压为0.1 MPa；进样量为1 μL[10]。
定性定量方法：色谱峰保留时间是定性分析的依据，而色谱峰面积则是定量分析的依据。
1.3.4 数据分析
所有实验均重复3次，数值表示为3次独立实验的平均值±标准偏差。使用Excel 2010进行数据处理。使用IBM SPSS Statistics19.0进行显著性差异分析，然后以P＜0.05的水平确定Duncan。
2 结果与分析
2.1 接种量对草莓酒发酵还原糖和可溶性固形物含量的影响
图1 不同接种量对草莓酒还原糖（A）及可溶性固形物（B）含量的影响
Fig.1 Effects of different inoculum on reducing sugar(A)and soluble solids(B)content in strawberry wine
由图1A可知，在不同接种量（3%～9%）的草莓酒发酵过程中，还原糖普遍处于下降状态，发酵前8 d还原糖含量急剧下降，随接种量增大，下降率依次为58%、68%、70%和70%；8～12 d还原糖含量下降较少，变化较平缓，下降率为29%、19%、13%和8%，表明主发酵基本完成。接种量在3%～9%范围内，还原糖消耗差异显著（P＜0.05）；接种量越大，还原糖消耗越多越快，这是由于酵母接种量大则用于细胞大量生长、繁殖以及代谢所消耗的营养物质就更多[5，14]。由图1B可知，可溶性固形物与还原糖含量具有相似的变化趋势，发酵前8 d可溶性固形物含量急剧下降为11.3 g/L、10.7 g/L、10.2 g/L和10.1 g/L；8～12 d可溶性固形物含量下降较少，变化较平缓，随接种量增大依次下降为10.0 g/L、9.1 g/L、9.3 g/L和9.5 g/L。从还原糖和可溶性固形物含量变化来看，7%和9%的接种量可以提高发酵前期还原糖消耗率，减少可溶性固形物含量。
2.2 接种量对草莓酒发酵pH值和滴定酸度的影响
图2 不同接种量对草莓酒pH值（A）及滴定酸度（B）的影响
Fig.2 Effects of different inoculum on pH(A)and titratable acidity(B)of strawberry wine
柠檬酸是草莓果实中的主要有机酸，约占总酸的80%[15]，适当的酸含量才能使酒醇厚、协调、适口。为了提高草莓酒的清爽适口感，可以在原料草莓制浆阶段补加酒石酸等有机酸[16-17]。由图2可知，发酵前2 d的pH下降，随后一直升高；发酵前6天滴定酸度升高，随后降低，在发酵后期又有所回升。在发酵2～6d以及8～12d期间，pH值和滴定酸度均升高，如发酵2～6d时，7%接种量的pH值由3.18升高至3.22，滴定酸度由7.76 g/L升高至8.62 g/L；发酵8～12 d，pH值由3.29升高至3.31，滴定酸度由8.28 g/L升高至8.31 g/L，这可能是代谢生成的有机酸解离度较低所致。发酵终点的滴定酸度和pH有显著差异（P＜0.05），随着接种量由5%增加至9%，滴定酸度降低，pH值升高。由于酵母菌生长要消耗发酵体系中的氧气，接种量越大，菌体生长量越大，体系耗氧越多，剩余溶氧越少，酵母菌好氧代谢受到限制，也抑制了好氧醋酸菌的生长，导致产酸量较低，pH值较高。3%、5%接种量的产酸量低，这可能是由于前者酵母菌数量少，糖代谢程度较低、速率较慢，生成醋酸的底物也较少导致的。从pH和滴定酸度变化来看，不同接种量有显著差异（P＜0.05）；7%和9%的接种量能明显降低草莓酒的滴定酸度，并提高pH值。
2.3 接种量对草莓酒发酵酒精含量的影响
图3 不同接种量对草莓酒酒精含量的影响
Fig.3 Effects of different inoculum on alcohol contents of strawberry wine
由图3可知，接种量对草莓酒发酵过程的酒精生成及终浓度有显著影响（P＜0.05）。7%接种量在第6天就进入产酒精稳定期，而3%和5%接种量在发酵第10天产酒精才接近稳定，这说明在一定范围内接种量越大，产酒精越快越多，越早进入稳定期。这是由于接种量较大，酵母细胞数量较多，发酵速度较快，能更快更多地利用糖类物质转化生成酒精。在整个发酵过程中，9%接种量远低于其他3个较低接种量的酒精产量，可能是接种量过大，酵母繁殖过快过多，耗糖量增大，而使用于生成酒精的糖分减少，最终减少酒精的产量。7%接种量酒精生成速率较快。
2.4 接种量对草莓酒发酵香气成分含量的影响
根据文献[18-20]报道和所试草莓酒的主要香气成分的初步分析，本研究选定乙酸乙酯、丁酸乙酯、正丙醇、乙酸异戊酯、正丁醇、乳酸乙酯、异丁醇、异戊醇和β-苯乙醇为草莓酒的主要香气成分进行测定，结果见表1。
由表1可知，不同接种量发酵草莓酒的香气成分含量中异戊醇、异丁醇和β-苯乙醇含量较高。在发酵前期（4 d），不同接种量发酵的各香气成分含量之间差异较小（P＞0.05）；随着发酵时间的延长，香气成分含量增加，在发酵8 d时各香气成分含量约增加到发酵4d时各香气成分含量的5倍；在发酵后期（12d），香气成分含量呈现出较大差异（P＜0.05）。在发酵后期，随着接种量的增大，丁酸乙酯和乙酸异戊酯含量升高；正丙醇、正丁醇和异丁醇含量降低；乙酸乙酯、乳酸乙酯和异戊醇含量先升高后降低，其中，在5%的接种量时乳酸乙酯含量最高，在7%的接种量时乙酸乙酯和异戊醇含量最高；而β-苯乙醇含量与接种量无明显的相关性（R2=0.633）。在发酵后期，3%、5%、7%和9%接种量的草莓酒中4种酯类含量的总和依次分别为0.44 mg/L、0.66 mg/L、0.68 mg/L和0.60 mg/L，5种高级醇含量的总和依次分别为30.09 mg/L、39.65 mg/L、37.89 mg/L和38.70 mg/L。3%接种量的糖代谢速率最低，用于生成高级醇和酯类的前体物质最少，酯类含量和高级醇含量明显低于其他三种接种量。9%接种量，乙醇产量最低，由乙醇和酰基辅酶（coenzyme A，CoA）合成的乙酸乙酯和乳酸乙酯含量也较低。5%和7%的接种量发酵的草莓酒均具有较高的香气质量，经人工品尝，7%的接种量发酵的草莓酒更显柔和、协调。
表1 不同接种量草莓酒香气成分含量的影响
Table 1 Effect of different inoculum on aroma components contents of strawberry wine
注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
发酵时间/d接种量/%含量/（mg·L-1）乙酸乙酯 丁酸乙酯 乙酸异戊酯 乳酸乙酯 正丙醇 正丁醇 异丁醇 异戊醇 β-苯乙醇4 8 12 357935793579 0.072a 0.082a 0.090a 0.092a 0.793a 0.090b 0.101bc 0.112bcd 0.126a 0.145b 0.187c 0.137d 0.004a 0.001a 0.001a 0.001a 0.201a 0.216a 0.203a 0.209a 0.088a 0.121b 0.122c 0.128d 0.072a 0.063a 0.061a 0.055a 0.107a 0.117ab 0.141c 0.205d 0.098a 0.151b 0.175c 0.178d 0.050a 0.081b 0.086bc 0.059ad 0.054a 0.128b 0.086ac 0.112bd 0.128a 0.242b 0.192c 0.155d 0.145a 0.143a 0.134a 0.123a 0.177a 0.168a 0.175a 0.158a 0.308a 0.301ab 0.281ac 0.199d 0.356a 0.344ab 0.195c 0.158cd 0.166a 0.156a 0.141a 0.138a 0.164a 0.151b 0.150bc 0.134d 0.791a 0.937b 0.949bc 0.987bcd 1.976a 3.404b 2.411c 2.679cd 4.765a 4.626b 3.285c 2.622d 4.676a 4.978b 5.006bc 4.873ad 15.812a 17.047b 19.842c 20.603d 16.991a 22.456b 23.555c 22.868d 1.072a 1.431b 1.840c 1.675d 1.534a 3.759b 2.836c 4.551d 7.862a 12.085b 10.620c 12.898d
3 结论
不同接种量的草莓酒发酵特性明显不同。在3%至7%范围内，接种量越大，降糖速率越快，产酸量越低，产酒精速度越快；当接种量达到9%时，产酒精速度反而降低；5%和7%接种量的草莓酒在允许的范围内具有较高的酯和高级醇含量。接种量为7%的草莓酒发酵降糖速率较快，产酸量适中，产酒精速度最快，同时兼具较高的香气质量和柔和协调的口感。综合分析，认为7%接种量适宜草莓酒发酵。
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