果酒是以用水果为原料经过破碎、压榨取汁、发酵和调配等工艺酿造而成的低度饮料酒[1-2]。目前，果酒的品种逐渐增多（如菠萝酒、猕猴桃酒、西瓜酒、草莓酒、火龙果等[3-7]），对各种果酒的探究引起了不少研究者的兴趣。
梨在中国分布较广，被营养学家誉为“功能食品”，其品种有很多，最具有代表性的是香梨。香梨味道浓郁、皮薄、肉细、汁多甜酥、清爽可口，系梨之上品；此外，香梨还具有调节人体新陈代谢、促进血液循环、保护心脏、减轻疲劳、增强心肌活力、降低血压等多种功效[8]。河南省是梨果生产大省，主要的品种有酥梨、香梨、水晶梨、雪花梨、丰水梨等，品种多产量大，尤其是在丰收年，梨的价格低、销售困难等因素。如果把梨加工成梨酒不仅能解决这一矛盾，而且能提高梨资源的利用率，拓宽果酒酿造的方向，具有较好的市场前景。
本试验对河南平顶山香梨果酒生产工艺进行了研究，通过单因素和响应面试验优化确定最佳发酵工艺条件，采用顶空-固相微萃取（head-space solid phasemicroextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析[9-10]，对其香气成分进行定量分析，为其精深加工和梨酒的品质鉴定提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香梨：河南平顶山；果酒专用酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖（食品级）：漯河市农贸市场；异抗坏血酸钠：郑州拓洋实业有限公司；偏重亚硫酸钾：意大利拉曼公司；柠檬酸：潍坊美轩实业有限公司；EX-V果胶酶（10万U/g）：曼森商贸有限公司；NaOH（分析纯）：上海禹泰化工有限公司。
1.2 仪器与设备
SCION SQ 456气相色谱-质谱联用仪：美国布鲁克·道尔顿公司；手动固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）装置（15mLSPME，100μm聚二甲基硅烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取头，手柄）；HR1871Philips Avance系列榨汁机：飞利浦电子香港有限公司；SHHW21.600A（I）电热恒温水温箱：广州市典锐化玻实验仪器有限公司；XSE105DU电子称：深圳市盛美仪仪器有限公司；LHP-250型恒温恒湿培养箱：上海三发科学仪器有限公司；WYT型手持式糖量计折射仪：北京紫金光仪器有限公司；PHS-2C型酸度计：上海智光仪器仪表有限公司；721型分光光度计：上海天普仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 香梨果酒工艺流程及操作要点
选择新鲜成熟的香梨，清水洗净后去皮、去核、切块、榨汁，过滤可得澄清梨果原汁。在梨果原汁加入（按梨汁质量）焦亚硫酸钾0.03%、异抗坏血酸钠0.07%和柠檬酸0.03%溶液进行护色[11]。护色后的梨汁加入3‰果胶酶混匀，酶解温度40℃，时间为5 h。用8层纱布过滤，得到梨汁备用。添加蔗糖调整梨汁糖度为19%，添加柠檬酸调整梨汁初始pH值。称取20 g酵母，加入5%糖水无菌水稀释至100 mL，37～38℃搅拌活化15～20 min得0.2 g/mL酵母活化液。将梨汁倒入容器内，装液量80%，加入一定量的活化酵母，搅拌均匀后，在一定温度条件下进行酒精发酵，每天搅拌1～2次，发酵7 d，用120目滤布过滤得梨酒。最后将梨酒进行澄清后进行巴氏杀菌（65℃、30 min）。
1.3.2 香梨果酒发酵条件的单因素试验设计
初始pH值：分别调整梨汁初始pH值为3.0、3.2、3.4、3.6、4.0，在酵母添加量为0.3%的条件下，26℃恒温培养箱中静置培养，发酵7 d后，以酒精度和感官评定来确定最适初始pH值。
酵母接种量：调整梨汁初始pH值为3.5，分别将酵母添加量调整为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，置于26℃恒温培养箱中静置培养，发酵7 d后，以酒精度和感官评定来确定最适酵母接种量。
发酵温度：调整梨汁初始pH值为3.5，将酵母添加量调整为0.3%，分别在发酵温度为16℃、19℃、22℃、25℃、28℃的恒温培养箱中静置培养，发酵7 d后，以酒精度、和感官评定来确定最佳发酵时间。
1.3.3 响应面优化试验
在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken中心组合设计原理，以初始pH值、酵母接种量、发酵温度为考察因素，以梨酒酒精度（Y）为响应值，利用Design Expert 8.0.6软件进行3因素3水平的响应面分析[12]，建立数学模型，以获得梨酒最佳制作工艺条件，试验因素水平编码如表1所示。
表1 香梨酒发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation process optimization of fragrant pear wine
因素 编码初始pH值酵母添加量/%发酵温度/℃-1水平0 1 X1X2X3 3.4 0.2 24 3.5 0.3 25 3.6 0.4 26
1.3.4 测定方法[13-14]
酒精度测定：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定；糖度测定：采用手持测糖仪测定；pH测定：采用酸度计测定；微生物检测按《食品卫生微生物学检验标准》（GB/T 4789—2008）的相应方法执行。
产品的综合评价：随机选定具有一定代表性的学生20名，逐一品尝各配方组合，并分别进行评分，再统计每个组合的果酒品质综合评定。感官评价标准见表2。
表2 香梨果酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fragrant pear wine
感官指标 一级 二级 三级味道（25分）香气（25分）色泽（20分）透明度（20分）愉快、纯正、细腻、酒体丰满醇和（20～30分）醇香浓郁，并且香梨味协调柔和，酒香舒适，无不良气味（20～25分）淡金黄色，均匀一致，具有与本品应有的色泽，悦目协调（20～25分）澄清、透明、光泽感强，无浑浊，无沉淀（15～20分）略带醇味，酒体基本纯正（10～19分）酒中无异味，香梨味果香较少（15～19分）黄色过深或过浅，色泽均匀（15～19分）基本澄清透明，有一定光泽感（10～14分）酒味淡，有酸味，有杂味（0～18分）无酒香，无香梨味果香，酒体不干净（10～14）黄褐色，色泽不均匀，与本品色泽不相符（10～14分）较浑浊，失光或者沉淀（8～9分）
香梨果酒香气成分的GC-MS分析：按照参考文献[14]的方法进行测定。
2 结果与分析
2.1 香梨果酒生产工艺的单因素试验
2.1.1 初始pH值的确定
发酵液的酸碱程度对酵母的生长和代谢产物的形成具有一定得影响。不同的酵母都有其最适合的生长范围。过高或过低都会抑制酵母体内酶的活性，使得酵母细胞的代谢受到阻碍，从而影响酒精的产量[15]。
图1 初始pH值对香梨果酒酒精度和感官评分的影响
Fig.1 Effect of initial pH on alcohol content and sensory score of fragrant pear wine
由图1可知，随着初始pH值的升高，酒精度及感官评分均呈先增加后降低的趋势，当初始pH值为3.4时，酒精度及感官评分均达到最高，主要原因是初始pH值过低时，酵母产生酒精的量较少，发酵原液的糖类没有转换成酒精，当pH＞3.6时，发酵酒的口感粗糙，味道略微带酸，因此选择梨汁初始pH值为3.4较好。
2.1.2 酵母接种量的确定
接种量与发酵周期有直接关系。酵母接种量对香梨果酒酒精度和感官评分影响见图2。
图2 酵母添加量对香梨果酒酒精度和感官评分的影响
Fig.2 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory score of fragrant pear wine
由图2可知，随着酵母接种量的增加，酒精度及感官评分均呈先增加后降低的趋势。当接种量为0.3%时，香梨果酒的酒精度及感官评分均达到最高。这主要是酒精的产出量随酵母接种量的增加而增大，当酵母添加量过低时，则发酵慢，料液中的糖不能完全被酵母利用，产生酒精度低[16]；接种量过大时，酵母相互之间抑制生长，导致酒精量减少，也易产生酵母异味[17]。因此选择酵母接种量为0.3%较好。
2.1.3 发酵温度的确定
发酵温度对梨酒酵母菌的生长有很大的影响，酵母接种量对香梨果酒酒精度和感官评分影响见图3。由图3可知，随着温度的升高，酒精度及感官评分均呈先增加后降低的趋势。温度升高时，发酵速度加快；如温度过高，酵母菌生长速度较快，容易衰老，不能在发酵后期将发酵液中的糖有效转化成酒精[18]，会影响产酒精量，而且酒体粗糙，酒质容易氧化，感官评分也随着温度的升高而有所下降。当发酵温度为25℃时，酒精度和感官评分都达到最高。KILLIAN E等[19]的研究结果也认为，较低的发酵温度有利于改善果酒的质量，这主要是因为发酵温度升高会使果香挥发、氧化损失加大，还会引起高级醇、挥发酸、醛类等副产物的增加，使酒的风味劣变综合考虑，因此选择发酵温度为25℃较好。
图3 发酵温度对香梨果酒酒精度和感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory score of fragrant pear wine
2.2 香梨果酒发酵条件响应面优化试验
利用Design-expert8.0.6软件对表3进行数据分析，得到感官评分Y与自变量X 1、X 2、X 3的二次回归方程为Y=94.20+2.48X 1-0.89X 2+2.31X 3-0.075X1X2+0.22X 1X3-0.65X2X 3-8.25X 12-2.38X 22-5.62X 32
对以上响应面回归模型进行方差分析，结果见表4，建立的数学模型，回归模型F=77.55，P＜0.000 1表明香梨果酒的酒精度评分与3个因素之间的回归方程极显著。因变量与所考察自变量之间的线性关系显著（R2=0.990 1），调整确定系数R2Adj=0.977 3，说明可解释97.73%相应值得变化，模型失拟项0.167 9＞0.05，不显著，拟合程度好，表示单因素试验结果可以和数学模型模拟良好。表4中的一次项X 1、X 3及二次项X 12、X 22、X32的值均＜0.01，达到极为显著水平，说明它们对响应值影响极大，且考察的因素对响应值的影响不是简单的线性关系。由F值大小可知，影响因素的主次顺序是：X 3＞X 1＞X 2。
表3 香梨果酒发酵工艺优化响应面试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of response surface tests for fermentation process optimization of fragrant pear wine
试验号 X 1 X 2 X3 Y感官评分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 0 1 0 0 --1 1 0 -0 0 1 1 0 0 -11 12 13 14 15 16 17 1 0 0 0 1 -1 0 0 0 -1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 --1-1 1 0 0 -1 0 0 1 1 1 1 0 -1 0 -1 0 80.8 84.5 87.6 85.3 94.6 93.7 81.7 94.2 79.4 95.1 83.5 90.8 87.1 76.6 93.4 82.9 80.2
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“***”表示差异极显著（P＜0.001）；“**”表示差异很显著（P＜0.01）；“*”表示差异显著（P＜0.05）。
变异源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型X1X2X3**********X 1X2 X 1X3 X 2X3 X12 X22 X32 77.55 58.61 7.54 51.17 0.03 0.24 2.02 342.77 28.41 159.34＜0.000 1 0.000 1 0.028 7 0.000 2 0.874 3 0.637 7 0.198 1＜0.000 1 0.001 1＜0.000 1********残差失拟项纯误差总变异583.51 49.01 6.30 42.78 0.02 0.20 1.69 286.58 23.75 133.22 5.85 3.99 1.86 589.36 R2 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 3 4 1 6 64.83 49.01 6.30 42.78 0.02 0.20 1.69 286.58 23.75 133.22 0.84 1.33 0.46 2.86 0.167 9 0.990 1 R2Adj 0.977 3
3个因素交互作用对香梨果酒感官评分影响的响应曲面及等高线见图4。由图4可知，在试验所选择的水平范围内，因素之间交互作用对香梨果酒的感官评分的影响相似，都随着各交互因素添加量的增加达到最大值后又降低，X 1X 2、X 1X 3、X 2X3之间有一定交互作用，但是其交互用对感官评分影响相对较小。
图4 初始pH值、发酵温度及酵母添加量间交互作用对香梨果酒感官评分影响的响应面及等高线
Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH,fermentation temperature and yeast inoculum on sensory score of fragrant pear wine
2.3 回归模型的验证试验
为了验证响应面预测得出的最佳工艺参数，按照初始pH值、酵母添加量、发酵温度分别为3.5，0.3%，25.2℃，进行3次平行验证试验，最终感官评分的平均值为94.4分，与预测值94.7较接近，在此条件下测定的酒精度为10.5%vol。说明该模型能很好地预测香梨果酒发酵条件与感官评分的关系。
2.4 香梨果酒发酵工艺风味物质分析结果
按照本酿造工艺所得到的香梨果酒香气成分通过GC-MS分析，详细的鉴定结果见表5。
表5 香梨果酒香气成分的GC-MS鉴定结果
Table 5 Identification results of aroma components in fragrant pear wine by GC-MS
序号 种类 保留时间/min 香气成分 分子式 CAS 相对含量/% 正匹配度 反匹配度1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42酯类24种醇类10种醛类8种3.691 4.610 8.823 10.366 12.034 13.134 15.542 15.784 16.630 18.252 18.713 19.667 20.296 21.723 21.885 22.121 23.514 24.272 25.891 27.775 28.551 28.934 29.380 30.627 8.521 11.495 15.154 17.595 18.617 19.989 21.116 21.632 22.366 22.982 14.368 15.848 17.097 17.679 18.074 19.763 20.589 28.680乙酸乙酯乳酸乙酯乙酸异戊酯丙烯酸正丁酯己酸乙酯乙酸己酯乙酸甲酯4-己烯酸甲酯辛酸乙酯壬酸乙酯丙烯酸辛酯癸酸乙酯硅烷二醇二甲酯丁酸乙酯Ethyl乙酸苯乙酯月桂酸乙酯芥酸甲酯棕榈酸乙酯十七烷酸甲酯异硬脂酸甲酯甲基反亚油酸酯亚油酸乙酯亚麻酸甲酯油酸甲酯异丁醇异戊醇正己醇2-乙基己醇正辛醇1-壬醇2,3丁二醇（Z）-4-癸烯-1-醇10-十一炔醇苯乙醇(E)-2-庚烯醛壬醛糠醛癸醛苯甲醛(E)-反式-2-癸烯醛十二醛5-羟甲基糠醛C4H8O2 C5H10O3 C7H14O2 C7H12O2 C8H16O2 C8H16O2 C3H6O2 C9H16O2 C10H20O2 C11H22O2 C11H20O2 C12H24O2 C2H8O2Si C6H12O2 C10H12O2 C14H28O2 C23H44O2 C18H36O2 C18H36O2 C19H38O2 C19H34O2 C20H36O2 C19H32O2 C19H36O2 C4H10O C5H12O C6H14O C8H18O C8H18O C9H20O C4H10O2 C10H20O C11H20O C8H10O C7H12O C9H18O C5H4O2 C10H20O C7H6O C10H18O C12H24O C6H6O3 141-78-6 97-64-3 123-92-2 141-32-2 123-66-0 142-92-7 79-20-9 21063-71-8 106-32-1 123-29-5 2499-59-4 110-38-3 1066-42-8 105-54-4 103-45-7 106-33-2 1120-34-9 628-97-7 1731-92-6 5129-61-3 2566-97-4 544-35-4 301-00-8 112-62-9 78-83-1 123-51-3 111-27-3 104-76-7 111-87-5 143-08-8 513-85-9 57074-37-0 2774-84-7 60-12-8 18829-55-5 124-19-6 98-01-1 112-31-2 100-52-7 3913-81-3 112-54-9 67-47-0 1.201 11.938 1.167 0.043 4.414 2.092 0.010 0.017 11.754 0.017 0.032 3.070 0.008 9.039 0.129 0.009 0.053 3.017 0.029 0.219 0.070 0.004 0.024 0.039 1.780 12.689 4.299 1.026 1.237 1.051 6.005 0.067 0.058 3.357 0.007 0.045 0.018 0.021 2.008 0.008 0.003 0.077 883 854 973 917 943 934 831 743 939 915 747 940 734 711 944 903 806 731 915 843 893 727 898 838 909 945 938 851 917 956 843 786 785 957 817 915 751 876 822 771 828 853 883 854 973 937 946 934 891 795 945 925 805 950 953 836 944 911 831 782 943 893 925 727 906 858 953 945 938 892 922 962 882 861 821 973 828 916 924 881 948 834 843 860
续表
序号 种类 保留时间/min 香气成分 分子式 CAS 相对含量/% 正匹配度 反匹配度43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 60 61 62 63 64 65 66 67 68 C2H4O2酸类8种酮类5种萜烯类2种烷烃类3种酚类1种其他类6种16.849 22.173 24.418 24.708 25.473 26.477 26.767 27.377 15.370 18.173 21.319 21.986 22.278 18.396 17.484 10.205 14.678 24.212 25.76 2.120 13.816 16.007 21.251 25.548 27.273乙酸正己酸辛酸棕榈酸壬酸十一烷酸油酸十六烯酸(Z)-3,6-二甲基四氢吡喃-2-酮二氢-2-甲基-3(2H)-噻吩酮2-羟基-2-环戊烯-1-酮突厥烯酮香叶基丙酮萜品油烯α-法尼烯环五聚二甲基硅氧烷十二甲基环六硅氧烷正辛烷4-乙烯基-2-甲氧基苯酚R-（-）-环己基乙胺乙酸酐2-乙基-6-甲基 -1,5-噻吩未知(E)-3-羟基四氢呋喃未知C6H12O2 C8H16O2 C16H32O2 C9H18O2 C11H22O2 C18H34O2 C16H30O2 C7H12O2 C5H8OS C5H6O2 C13H18O C13H22O C10H16 C15H24 C10H30O5Si5 C12H36O6Si6 C8H18 C9H10O2 C8H17N C4H6O3 C10H18－C4H8O2－64-19-7 142-62-1 124-07-2 57-10-3 112-05-0 112-37-8 112-80-1 2416-20-8 3720-22-7 13679-85-1 10493-98-8 23696-85-7 3796-70-1 586-62-9 502-61-4 541-02-6 540-97-6 111-65-9 7786-61-0 5913-13-3 108-24-7 10054-09-8 7206-15-7 453-20-3 1937-62-8 1.570 1.065 0.224 0.002 0.015 0.253 1.740 0.035 0.001 0.022 0.018 0.004 0.008 2.007 1.011 0.021 0.030 0.003 0.010 0.184 0.054 0.005 0.026 0.038 0.050 941 943 933 737 790 778 935 804 824 846 827 855 732 851 868 947 833 711 903 911 820 758 841 791 862 941 966 933 804 802 778 935 842 883 846 942 884 836 861 876 947 848 780 929 911 958 778 849 801 896
通过GC-MS分析得出，共鉴定出68种香梨果酒的香气成分，占总香气成分的99.547%。从表1可以看出，香梨果酒香气物质主要包括酯类24种、醇类10种、醛类8种、酸类8种、酮类5种、萜烯类2种、烷烃类2种，酚类1种和6种其他类化合物。其中酯类物质占香气成分的48.395%；醇类物质占香气成分的31.569%；醛类占香气成分的2.187%；酸类占香气成分的4.904%；萜烯类占香气成分的3.124%。
鉴定出的酯类化合物共有24种，是含量最多的香气成分，对香梨果酒的独特风味有重要的影响。一般认为酯类化合物形成途径是酵母的生物合成。其中检测出的乳酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯和乙酸异戊酯含量都较高，其分别代表较强的酒香气味；桔子或葡萄香味[20]；类似水果香味的香味；苹果、樱桃的水果香气；香蕉、草莓果香[21]；香蕉香、甜香、苹果香、水果糖香[22]，酯类化合物主要赋予果酒怡人的果香气，可以使酒体变得果香浓郁、酒香醇和香气协调。鉴定出的醇类化合物共有10种，醇类物质含量仅次于酯类挥发性风味化合物，在不同风味成分转化中有重要作用，对香梨果酒的风味形成有重要的贡献[23]。果酒中的醇类化合物有异戊醇、正己醇、2,3-丁二醇、苯乙醇等化合物，它们分别代表水果香、花香[20]；青草味[20]；酒香[21]花香、水果香、甜香[20]。这些醇类物质是由原料中的蛋白质和糖类通过酵母的发酵作用，降解成的各种醇类化合物。研究表明[24]，少量的高级醇是果酒重要的风味物质，适量的高级醇赋予酒体优雅的香气的感官特性，同时这些物质又是其他香气物质的良好溶剂，它们的嗅觉一般都很低，所以香气值很高，对总体香气的形成有不可忽视的作用。
鉴定出酸类化合物8种，主要是对香梨果酒的口感和后味，但其阈值较高，对果酒的香气贡献起到助香、减少刺激和缓冲平衡的辅助作用[25]。分别鉴定出醛类、酮类8种和5种，这些成分对果酒品质有重要贡献[26-27]，另外在香梨果酒中鉴定出萜烯类物质如萜品油烯和α-法尼烯，其中α-法尼烯是一类具有较强香气和生理活性的天然化合物[28]。研究表明该类物质也能对梨酒果酒的清香起到一定作用。
3 结论
本研究通过单因素及响应面试验得到香梨果酒的最佳发酵条件为初始pH值3.5、酵母添加量0.3%、发酵温度25.2℃，在此条件下，香梨果酒的感官评分为94.4分，酒精度为10.5%vol。香梨果酒呈现淡金黄，澄清透明，均匀一致；酒体舒适并有香梨味柔和；醇香浓郁、性质稳定。从香梨果酒中共鉴定出香气物质68种，占总香气成分的99.547%，其中相对含量较高的香气物质为乳酸乙酯11.938%、乙酸异戊酯1.167%、己酸乙酯4.414%、乙酸己酯2.092%、辛酸乙酯11.754%、丁酸乙酯9.039%、异戊醇12.689%、正己醇4.299%、2,3-丁二醇6.005%、苯乙醇3.357%、苯甲醛2.008%。综合评价出平顶山香梨酒中的特征香气物质，为河南平顶山香梨酒提供理论依据。
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