啤酒花（Humulus lupulusL.）学名蛇麻，又称香蛇麻、蛇麻草、忽布，是荨麻目大麻科草属多年生草本植物，简称酒花[1-2]。酒花是啤酒酿造过程中必不可少的原料，不仅能赋予啤酒独特的风味，还具有防腐抑菌功能，被誉为“啤酒的灵魂”，同时具有抗肿瘤、降血糖、健胃、消食、利尿等功效[3-4]，其主要化学成分为树脂类、挥发油、多酚类、黄酮类等[5]，并且其中同绿茶和葡萄多酚一样具有前途功能性成分的多酚物质含量占啤酒花总质量的4%～14%[6-8]，如异戊烯基查尔酮，具有广谱抗菌、抗氧化等作用[9]。近年来，啤酒花抗氧化性的研究越来越多，在一些抗癌机理研究中啤酒花展现出了较强的抗氧化活性，也有报道显示，酒花中的多酚能消除羟基自由基、超氧阴离子等，且清除能力强于Trolox。另外其化学组成中的含硫化合物和酚酸也有助于提高酒花的天然抗氧化能力。
随着社会经济的发展以及人们对饮食健康的重视，保健类饮品越来越成为消费者的首选。因葡萄酒中含有大量的酚类物质，故适量饮用能预防脉粥样硬化、心脑血管等疾病的发生并起到保健的作用[10-12]。葡萄酒长期以来都是用添加SO2来延长保质期，但过量的SO2不仅影响葡萄酒的品质，而且会对人体健康造成危害，特别是对含有SO2的葡萄酒过敏的群体，如哮喘病患者[13]。有研究显示，规定添加量条件下，SO2并不能在红葡萄酒中表现出较好的抗氧化性，因此，寻找一种能替代或是能较少添加SO2的抗氧化物质极为重要。目前，国内外对葡萄酒中的新型抗氧化剂研究甚多，但是将酒花的抗氧化活性在葡萄酒中的应用未见报道。
由于斯伯特酒花在众多酒花种类中的抗氧化性最高，抗氧化活性范围为70%～80%[14]，因此，本实验将其应用于葡萄酒中，研究斯伯特酒花添加量对葡萄酒抗氧化活性和葡萄酒品质的影响，筛选出最佳的酒花添加量，为提升葡萄酒的品质和衍生酒花资源的生产链提供基础数据与理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
赤霞珠葡萄：成都金满堂农业开发有限公司；斯伯特酒花：河南省帕洛丁贸易有限公司；果胶酶（50 000 U/g）：宁夏和氏壁生物技术有限公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司。
柠檬酸、磷酸氢二钠、无水乙醇、无水碳酸钠、干没食子酸、甲醇、过硫酸钾（均为分析纯）：成都润泽本土化工有限公司；2,2-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐[2,2'-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate），ABTS）]：上海安耐吉化学；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH）：日本TCL公司；水溶性维生素E（Trolox）：合肥博美生物科技有限责任公司第一分公司；福林肖卡试剂：厦门海标科技有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-BlueStarA紫外-可见分光光度计：北京莱博泰科仪器有限公司；DK-98-Ⅱ恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；ScoutSE电子天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司；101-0型电热鼓风干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 酒花浸出物的制备
取200mL蒸馏水加热至100℃且保持2 min，加入0.20 g斯伯特酒花，熬制4 min，待其冷却后过滤，滤液备用。
1.3.2 酒花葡萄酒酿造工艺及操作要点
操作要点：
选取成熟度高、无霉烂变质及无病虫害的新鲜葡萄，清水冲洗、去皮以及取出葡萄籽，除梗，将其破碎。根据果浆的质量添加果胶酶，50℃条件下水浴酶解2 h。将酒花浸出物按不同比例加入，使其浸渍并参与之后的葡萄酒发酵过程。过滤澄清，添加糖调整酒样总糖度至22°Bx。接入质量分数10%的酵母，在20～25℃条件下进行发酵，当葡萄酒酒体表面无明显气泡产生，酵母生长量、残糖含量与酒精度等趋于稳定说明主发酵结束。主发酵结束后，将葡萄酒静置澄清、过滤，移入新的发酵容器于5℃进行低温陈酿，陈酿结束后移入容器贮存。
1.3.3 酒花添加量的优化
因考虑不同酒花浸出物添加量对葡萄酒抗氧化活性的影响，在进行葡萄酒酿造时，设置四个酒花添加量比例（酒花浸出物∶葡萄酒）为1∶10、1∶8、1∶6、1∶4，分别编号为处理1、处理2、处理3、处理4。以未添加酒花浸出物的酒样为空白对照CK，发酵结束后，在自然氧化期间第0、30、60、90、120、150天时取样，检测总酚含量、褐变程度及抗氧化活性及感官指标，通过分析优化出酒花浸出物的最佳添加量。
1.3.4 总酚含量测定
采用福林-酚（Folin-Ciocalteu）法[15]。取1mL被稀释10倍后的葡萄酒酒样置于100 mL容量瓶中，依次加入5.0 mL福林肖卡试剂和15mL20%碳酸钠溶液，用去离子水定容至100mL，将混合液在室温避光条件下反应2h后于波长760nm处测定吸光度值。再代入回归方程计算总酚含量，结果用没食子酸等价表示，单位为mg/L没食子酸。
1.3.5 褐变程度测定
褐变程度测定采用吸光值法[16]。采用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH=3.2）调零，使用紫外-可见分光光度计分别检测各酒样在波长520nm、420nm处的吸光度值。以A520nm值代表酒样氧化后的红色色调，A420nm值代表褐变程度。
1.3.6 ABTS自由基清除能力[17-18]
于波长734 nm处测定酒样的吸光度值，以Trolox建立标准曲线，得到回归方程后计算ABTS自由基清除能力，结果以Trolox当量抗氧化能力（Trolox equilent antioxidant capacity，TEAC）值表示，单位为μmol/L。
1.3.7 DPPH自由基清除能力[19]
取0.1mL稀释后的酒样加入3.9mLDPPH甲醇溶液中，避光反应20 min，同时以无水乙醇为空白，于波长517 nm处测定吸光度值，结果以Trolox当量抗氧化能力（TEAC）值表示，单位为μmol/L。
1.3.8 感官评价
请10名对葡萄酒具有鉴赏能力的消费者，参照《“亚洲葡萄酒质量大赛（静止葡萄酒）”品尝记录表》及葡萄酒品尝相关标准[20-21]，对斯伯特酒花葡萄酒的香气、口感、外观以及整体进行评分和描述性分析。
1.3.9 数据统计分析
采用Excel 2010处理并用SPSS21.0对总酚含量和抗氧化活性指标进行相关性分析。
2 结果与分析
2.1 总酚含量变化
按照没食子酸标准曲线y=0.000 9x-0.058 6计算各酒样总酚含量，结果见图1。由图1可知，各酒样总酚含量在150 d后都有所下降，从自然氧化第0天的296.22～312.88 mg/L下降至第150天的259.91～277.14 mg/L，处理4的酒样变化最小，仅为22.39 mg/L。加入了斯伯特酒花的样品在试验阶段，总酚含量均高于空白对照，处理4的总酚含量分别是空白对照、1∶10、1∶8、1∶6葡萄酒的1.07、1.05、1.04和1.02倍，且长时间储存后变化最小，进一步说明斯伯特酒花的加入能延缓葡萄酒总酚含量的降低。
图1 酒样总酚含量的变化
Fig.1 Changes of total phenol content in wine samples
2.2 褐变程度变化
总酚类物质中的花色苷决定着葡萄酒颜色和色度，不同储存时间的酒样在波长420 nm和520 nm处的吸光度值见图2。
图2 酒样红色色调及褐变程度随时间的变化
Fig.2 Changes of wine red and browning degree with time
由图2a可知，各酒样红色色调（A520nm）整体呈现出下降趋势，其原因在于游离花色苷向聚合花色苷的转变加上在缓慢的自然氧化过程中没有大量醌类物质生成。葡萄酒褐变的原理多认为是酒中的酚类物质被氧气成醌和H2O2，再进行缩聚反应生成褐色素。在试验过程中，氧气的进入使得葡萄酒氧化；由图2b可知，酒样的褐变（A420nm）趋势为先下降后增加最后又降低，加入斯伯特酒花的酒样整体褐变程度均小于空白对照组，斯伯特酒花的存在使得酒样中还原性酚类物质增加，使醌和其他聚合物又被还原为酚从而减缓了酒样的氧化褐变，通过比较不同处理酒样的褐变程度，效果最好的为处理4。
2.3 ABTS自由基清除能力变化
ABTS自由基清除能力实验是测定化合物抗氧化能力的重要方法[22]，ABTS原溶液与过硫酸钾在室温黑暗环境中反应12～16 h产生ABTS+自由基，供氢抗氧化剂的存在会使ABTS自由基减少[23]。
酒样ABTS自由基清除能力的变化结果见图3。由图3可知，在试验中，各酒样的ABTS自由基清除能力随着储存时间推移而降低，说明氧化褐变的葡萄酒抗氧化活性呈下降趋势，TEAC值由第0天的1 662.3～1 771.4 μmol/L下降至第150天的987.1～1 036.2 μmol/L，变化量从大到小的顺序为CK＞处理1＞处理2＞处理3＞处理4。由此可见，加入了斯伯特酒花浸出物酒样的ABTS自由基清除能力较空白组更好，自由基的产生与清除的平衡受制于抗氧化物质[24]，故斯伯特酒花浸出物的加入可能增加了葡萄酒中的抗氧化物质从而提高其自由基清除能力，增强酒样的抗氧化活性。
图3 酒样ABTS自由基清除能力的变化
Fig.3 Changes of ABTS free radical scavenging ability of wine samples
2.4 DPPH自由基清除能力变化
酒样DPPH自由基清除能力的变化见图4。由图4可知，随着储存时间的延长，各酒样清除DPPH自由基的能力先上升后下降，而在试验整个阶段整体上呈下降趋势，表明氧化褐变的葡萄酒的抗氧化活性总体是呈下降趋势的，出现此现象的原因有可能是葡萄酒中的抗氧化物质含量的降低以及氧气的影响。在试验中，各酒样都呈现出较强的抑制DPPH自由基的能力，与空白组相比，加入了斯伯特酒花浸出物的葡萄酒在整个检测阶段呈现出更好的抑制DPPH自由基的能力。根据本试验的结果，认为斯伯特酒花浸出物能提高葡萄酒抑制DPPH自由基的能力，其原因可能在于斯伯特酒花丰富的酚类物质与葡萄酒相融合，提高了抗氧化能力，具有较好效果的是处理4的斯伯特酒花葡萄酒。
图4 酒样DPPH自由基清除能力的变化
Fig.4 Changes of DPPH free radical scavenging ability of wine samples
2.5 总酚含量与抗氧化活性指标相关性分析
为了避免偶然因素对葡萄酒抗氧化活性造成的影响，采用ABTS法和DPPH法两种方法对斯伯特酒花葡萄酒的抗氧化活性进行测定。通过软件SPSS21.0对不同酒样的总酚含量与抗氧化活性进行相关性分析，结果见表1。
表1 不同酒样总酚与抗氧化活性的相关性分析
Table 1 Correlation analysis between total phenols and antioxidant activity in different wine samples
注：“**”表示差异极显著（P＜0.01），“*”表示差异显著（P＜0.05）。
酒样CK处理1处理2处理3处理4抗氧化活性ABTS法 DPPH法0.885*0.880*0.895**0.889*0.924**0.862*0.882*0.875*0.918**0.875*
由表1可知，总酚含量与抗氧化活性指标均呈显著正相关（P＜0.05），总酚含量与ABTS自由基清除能力的相关系数为0.880～0.924，总酚含量与DPPH自由基清除能力的相关系数为0.862～0.918（P＜0.05），说明酒花葡萄酒的总酚含量是自由基清除能力变化的主要影响因素，与CK对比，添加了斯伯特酒花的酒样（处理组1～4）的总酚与抗氧化活性的相关性均高于CK，而在一般情况下，相关性增强，其酚类化合物对抗氧化能力亦随之提高[25]，故在葡萄酒酿造过程加入斯伯特酒花能够增强酒样的抗氧化活性，可能是因为酒花中高含量的酚类物质在发酵过程能够增加酒样的总酚含量，效果最好的为处理4。
2.6 感官评价
经过150 d的自然氧化后，各酒样的感官品质评价结果见表2。由表2可知，经过150 d的自然氧化后，各酒样的品质整体偏低。以葡萄酒的感官评分作为评价指标，随着斯伯特酒花浸出物添加量的增加，酒样口感受到影响，感官质量有所提高，斯伯特酒花独特的香味融入到葡萄酒中，使得葡萄酒呈现出独特的酒花香味。斯伯特酒花中大量的抗氧化物质让葡萄酒的氧化延缓，故加入了斯伯特酒花浸出物的酒样整体得分高于空白对照组，且斯伯特酒花浸出物添加越多，感官提高效果越佳，最优的为处理组4。
表2 酒样的感官品质
Table 2 Sensory quality of wine samples
注：评分标准为优，85～100；良，80～85；中，70～80；差，50～70；劣，＜50。
项目 色泽 澄清度香气滋味典型性综合评价综合得分/分CK 203170处理1203271处理2223171处理3223273处理4 7 6 6 6 6 6 6 5 6 6 2332 6 7 7 7 8宝石红色，酒味显著，口感较差。宝石红色，酒花香味不明显，轻微苦味。宝石红色，轻微酒花香，后味微苦。宝石红色，酒花香较浓，口感一般。宝石红色，酒花香突出，口感较好75
3 结论
本试验通过酒花浸出物的不同添加量对葡萄酒自然氧化阶段葡萄酒各项指标影响的研究，探索葡萄酒中最佳的酒花添加量，为酒花在葡萄酒的应用提供数据参考。研究结果表明：
（1）在自然氧化150 d后，酒花添加量最多（酒花浸出物∶葡萄酒=1∶4）的葡萄酒总酚含量平均达到304.20 mg/L没食子酸，分别是空白对照、酒花浸出物∶葡萄酒1∶10、1∶8、1∶6酒样的1.07、1.05、1.04和1.02倍，说明酒花浸出物添加比例为1∶4的酒样总酚含量最高，且长时间储存后其总酚含量降低程度亦最小，进一步体现了斯伯特酒花的加入能延缓总酚含量的降低。
（2）在试验期间，酒样红色色调呈现持续下降趋势，酒样的褐变程度为先下降后增加最后又降低，从整体上看，加入斯伯特酒花的酒样整体褐变程度均小于空白对照组。
（3）各酒样的ABTS自由基清除能力和抑制DPPH自由基能力均随着时间推移而降低，加入斯伯特酒花浸出物的酒样自由基清除能力较空白组更好，且酒花添加比例为1∶4的酒样抗氧能力提高效果最佳。
（4）酒样总酚含量与抗氧化活性指标均呈显著正相关（P＜0.05），总酚含量与ABTS自由基清除能力的相关系数为0.880～0.924，与DPPH自由基清除能力的相关系数为0.862～0.918（P＜0.05），说明酒花葡萄酒的总酚含量是自由基清除能力变化的主要影响成分，且处理组1～4的相关性均高于CK，进而说明酒花的添加能增强葡萄酒的抗氧化活性。
（5）感官评价表明，经过150 d的自然氧化后，各酒样的品质整体偏低，斯伯特酒花浸出物添加量的增加对各酒样感官评分有促进作用，酒花浸出物与酒添加量比例为1∶4时感官评分最高，为75分，未添加酒花的葡萄酒最低。故斯伯特酒花浸出物添加越多，感官提高效果越佳。
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