首乌藤（Polygoni multiforiCaulis）又名夜交藤，为蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥藤茎或带叶藤茎[1]。它是一种药食两用植物，具有养血安神、祛风通络之功效，临床上主要用于治疗失眠多梦、血虚身痛、肌肤麻木、风疹瘙痒等病症[2]。已有研究表明，首乌藤中的蒽醌类、黄酮类具有改善睡眠功效[3-5]。黄酮类化合物对人体无毒无害，具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗病毒等作用，在食品添加剂、医药、化妆品等领域得到广泛的应用[6-8]。因此，研究首乌藤总黄酮的提取及生物活性，对提高首乌藤资源的综合利用具有十分重要的意义。
目前，对首乌藤总黄酮的提取已有相关研究报道。潘佳伟等[9]用表面活性剂辅助提取首乌藤总黄酮，其得率为6.0%；肖扬等[10]用乙醇为溶剂提取首乌藤总黄酮，其提取率为21.35%；史俊燕[11]用乙醇为溶剂提取总黄酮，其提取率为3.19%。目前，对首乌藤总黄酮的提取主要采用有机溶剂，容易对环境造成污染，而针对首乌藤总黄酮的水提工艺及抗氧化性研究鲜见报道。
本研究以首乌藤为试验材料，实验室自制超纯水为提取溶剂，在单因素试验基础上，通过正交试验优化超声波辅助提取首乌藤总黄酮的工艺条件；同时，以维生素C（vitamin C，VC）为阳性对照，对首乌藤总黄酮从清除1,1-苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·OH的能力来评价其抗氧化性，以期为首乌藤黄酮类物质的深入研究及其在功能性食品等方面的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
首乌藤（Polygoni multifori）：采自双柏县妥甸，经鉴定为蓼科植物何首乌干燥藤茎；芦丁标准品（纯度≥98%）：中国药品生物制品检定所；DPPH、维生素C：昆山诺普森实验室用品科技有限公司；超纯水：实验室自制；其他所用化学试剂均为分析纯：天津化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
Alpha-1502型紫外可见分光光度计：上海谱元仪器有限公司；UPT-1-100L型优普系列超纯水器：四川优普超纯科技有限公司；KQ520OB型超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；2代运邦多功能粉碎机：永康市速锋工贸有限公司；SE40ZF电子天平：奥豪斯仪器有限公司；HH-S2S型恒温水浴锅：金坛市大地自动化仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 总黄酮提取工艺流程
1.3.2 总黄酮含量测定
（1）芦丁标准曲线绘制
以芦丁为标准品，采用A（lNO）33-NaNO2比色法测定总黄酮含量[12]。以芦丁标准溶液含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，得芦丁标准曲线线性回归方程：y=10.382x-0.000 3，相关系数R2=0.999 36。
（2）首乌藤总黄酮含量的计算
式中：C为供试品溶液中总黄酮质量浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；N为稀释倍数，M为首乌藤干粉的质量，g。
1.3.3 总黄酮提取工艺优化单因素试验
分别考察以下单因素的影响：（1）超声功率分别为150W、200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W的条件下进行提取，料液比1∶50（g∶mL）、超声时间80 min、超声温度60 ℃；（2）确定超声功率300 W，分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90 ℃的条件下进行提取，料液比1∶50（g∶mL）、超声时间80 min；（3）确定超声温度60℃，分别在超声时间20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min的条件下进行提取，超声功率300 W、料液比1∶50（g∶mL）；（4）确定超声时间100min，分别在料液比1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60（g∶mL）的条件下进行提取，超声功率300 W、超声温度60℃。
1.3.4 总黄酮提取工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以首乌藤总黄酮含量为评价指标，以超声功率（A）、超声温度（B）、超声时间（C）、料液比（D）为试验考察因素，设计L（934）正交试验探索最优总黄酮提取工艺条件，因素及水平见表1。
表1 总黄酮提取工艺优化正交试验因素与水平
Table1 Factors and levels of orthogonal tests for total flavonoids extraction technology optimization
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1.3.5 首乌藤总黄酮抗氧化活性测定
将首乌藤总黄酮配制成0.0034mg/mL、0.0068mg/mL、0.013 6 mg/mL、0.027 2 mg/mL、0.054 4 mg/mL 5 种质量浓度，分别测定其对DPPH·、·OH的清除率，同时，以维生素C为对照，评价其抗氧化性。
（1）DPPH·清除率测定
参照文献[13-15]的测定方法。
（2）·OH清除率测定
参照文献[16-17]的测定方法。
2 结果与分析
2.1 总黄酮提取工艺优化单因素试验结果
2.1.1 超声波功率对首乌藤总黄酮提取效果的影响
图1 超声波功率对总黄酮提取效果的影响
Fig.1 Effect of ultrasonic power on the extraction of total flavonoids
由图1可知，随着超声功率在150～450W范围内的增大，首乌藤总黄酮含量先增大后减小；当超声波功率为300 W时，总黄酮含量达最大1.23mg/g；当超声功率＞300W之后，总黄酮含量有所下降。出现这种现象的原因可能是提高超声波功率，能增加首乌藤细胞的破碎程度，使首乌藤总黄酮的溶出率升高。但是极端的增大超声波功率会增加能耗，同时由于超声波的强化和机械作用，可能会破坏生物活性物质的分子链，造成已经溶出的活性物质分子的不正常降解[18-19]，降低生物活性。因此，确定适宜的超声波功率为300 W。
2.1.2 超声温度对首乌藤总黄酮提取效果的影响
图2 超声提取温度对总黄酮提取效果的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic extraction temperature on the extraction of total flavonoids
由图2可知，随着超声温度在40～90℃范围内的升高，首乌藤总黄酮含量先增大后减小；在超声温度为60℃时，总黄酮含量达最大1.24 mg/g；在超声温度高于60℃之后，总黄酮含量有所下降。出现这种现象的原因可能是随着超声温度的升高，分子运动速度加快，含量增大，但温度过高，会破坏部分黄酮类化合物结构并增加其他非黄酮类物质溶出[20]，影响黄酮类物质的生物活性和总黄酮含量。因此，确定适宜的超声温度为60℃。
2.1.3 超声时间对首乌藤总黄酮提取效果的影响
图3 超声提取时间对总黄酮提取效果的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction of total flavonoids
由图3可知，超声时间＜100 min之前，总黄酮含量随超声作用时间的延长而呈增大趋势；当超声时间为100 min时，总黄酮含量达最大值1.25 mg/g；之后随超声时间的延长而总黄酮含量略有下降趋势。这可能是在一定时间范围内，超声波有利于首乌藤中水分的渗入和细胞壁的破碎，增加了首乌藤中黄酮类物质的溶出，但随着提取时间的增加，会使黄酮类物质分子结构破坏[21]，从而影响总黄酮含量。因此，确定适宜的超声时间为100 min。
2.1.4 料液比对首乌藤总黄酮提取效果的影响
图4 料液比对总黄酮提取效果的影响
Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the extraction of total flavonoids
由图4可知，首乌藤总黄酮随着提取溶剂用量的增大，总黄酮含量有增大的趋势，当料液比达1∶45（g∶mL）时，总黄酮含量达最大1.24 mg/g。之后若继续增加溶剂用量，总黄酮含量基本不再增大，反而略有缓慢下降趋势。这可能是因为料液比达到1∶45（g∶mL）时，黄酮类物质已基本溶出，继续增加溶剂用量反而有利于首乌藤中其他杂质的溶出，使得总黄酮含量下降。因此，确定适宜的料液比为1∶45（g∶mL）。
2.2 总黄酮提取工艺优化正交试验结果
表2 提取工艺优化正交试验结果与分析
Table2 Results and analysis of orthogonal tests results for extraction technology optimization
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表3 正交试验结果方差分析
Table3 Variance analysis of orthogonal experimental results
注：F0.05（2，2）=19；F0.01（2，2）=99。“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
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由表2可知，影响主次顺序依次为B＞C＞A＞D，即超声温度＞超声时间＞超声功率＞料液比。首乌藤总黄酮最佳提取工艺组合为A3B2C3D3，即超声功率350 W，超声温度60 ℃，超声时间120 min，料液比1∶50（g∶mL）。由于最佳组合不在9组试验内，因此，在该条件下进行验证性试验，重复5次，测得首乌藤总黄酮平均含量为1.32 mg/g，大于正交试验结果中的最大含量1.25mg/g，表明该方法重复性良好，适合于首乌藤总黄酮的提取。由表3可知，4个因素对首乌藤总黄酮含量均有显著影响（P＜0.05）。
2.3 首乌藤总黄酮抗氧化性分析
2.3.1 清除DPPH·的能力评价
由图5可知，首乌藤总黄酮在质量浓度0.003 4～0.0544mg/mL范围内，随着首乌藤总黄酮质量浓度的增加，清除DPPH·的能力增强。当总黄酮质量浓度为0.0544mg/mL时，对DPPH·的清除率可达到74.36%，高于阳性对照维生素C对DPPH·的清除率65.22%，说明首乌藤总黄酮具有较强的清除DPPH·的能力。
图5 不同质量浓度首乌藤总黄酮对DPPH·的清除效果
Fig.5 Scavenging ability of different concentration of total flavonoids fromPolygoni multiforion DPPH·
2.3.2 清除·OH的能力评价
从图6分析可知，首乌藤总黄酮在质量浓度0.003 4～0.0544mg/mL范围内，随着首乌藤总黄酮质量浓度的增加，清除·OH的能力也增强。当总黄酮质量浓度为0.0544mg/mL时，首乌藤总黄酮对·OH的清除率可达到62.29%，低于阳性对照维生素C对·OH的清除率80.42%，但首乌藤总黄酮仍然表现出较强的清除·OH的能力。
图6 不同质量浓度首乌藤总黄酮对·OH的清除效果
Fig.6 Scavenging ability of different concentration of total flavonoids fromPolygoni multiforion·OH
3 结论
通过单因素试验及正交试验，优化得到的首乌藤总黄酮最佳超声提取工艺为超声功率350W，超声温度60℃，超声时间120min，料液比1∶50（g∶mL）。在此最优条件下进行验证性试验，重复5次，得首乌藤总黄酮平均含量为1.32mg/g。
抗氧化性试验结果表明，在首乌藤总黄酮的质量浓度0.003 4～0.054 4 mg/mL范围内，随着首乌藤总黄酮质量浓度的增加其清除DPPH·和·OH的能力逐步增强。表现出较强的清除DPPH·和·OH的能力，说明首乌藤总黄酮具有较强的抗氧化活性。
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