香菇（Lentinus edodes）富含蛋白质、膳食纤维、钙、铁等多种营养素[1]。香菇柄是香菇商品化整理的副产物，约为菇体总质量的25%[2]，基本营养成分和菇伞部分相近[3]，但其膳食纤维含量显著高于菇伞，其总膳食纤维高达49.04%[4-5]，直接做菜品适口性较差，坚韧难嚼，这一特性限制了香菇柄食品的大力开发[6-7]。
科技人员针对香菇柄食品研发进行了许多尝试，开发出诸如香菇柄素蹄[8]、香菇松[9]、香菇酱等产品[10]。但这些产品基本都是用双剪香菇柄为原料加工的，且消耗的香菇柄数量有限，而大量的单剪香菇柄，尤其是品相稍差的单剪香菇柄，因为价值较低得不到有效重视，许多香菇柄因没有及时干制或贮藏不当而腐烂被废弃，而双剪香菇柄根更是几乎全部废弃，造成资源的严重浪费。
以香菇为原料发酵制酒的研究偶见报道[11-12]，而以香菇柄根为原料发酵制酒的研究还鲜有报导。该实验基于实用性考虑，以廉价的香菇柄根为原料，通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面试验，优化香菇柄根酒精发酵工艺，以期为香菇柄根酒类产品研发和香菇柄的完全利用提供一定的数据参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香菇柄根：市售带柄根香菇，双剪取末段带根的香菇柄，烘干备用；酿酒曲（食品级）：安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、磷酸二氢钾、柠檬酸、氢氧化钠（均为食品级）：市售。
1.2 仪器与设备
GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱、BSC恒温恒湿箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HK-08A流水式中药粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司；FE20-K实验室pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；BPMJ-250F霉菌培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；H2050R台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；酒精计：河北省冀州市耀华玻璃仪表厂。
1.3 方法
1.3.1 香菇柄根预处理
干香菇柄根原料置于干燥箱内85℃烘烤45 min，冷却粉碎为60目的细粉，装袋备用。
1.3.2 香菇柄根酒精发酵工艺流程
酵母增殖、发酵的基本营养物质为氮源、碳源、核苷酸、维生素、微量元素等，磷（P）是构成酵母菌体中核酸的重要成分，钾（K）可以促进酵母细胞的增大[13-14]，而适当的pH值是酵母酶系统正常发挥作用的必要条件[10]。香菇柄根粉中含有丰富的蛋白质、游离氨基酸等氮源和核苷酸、维生素、微量元素等，但能被酵母利用的糖类缺乏。因此该试验的营养配方设计为在香菇柄根粉的基础上外加葡萄糖和磷酸二氢钾[15]，并适当调节pH值。
基础发酵液由香菇柄根粉、磷酸二氢钾和纯净水组成，按照实验设计定量称取香菇柄根粉、磷酸二氢钾和纯净水，搅拌混合均匀配成基础发酵液，再按试验设计向基础发酵液中添加一定的葡萄糖，完全溶解后用1 mol/L的氢氧化钠溶液和50%的柠檬酸溶液调节pH值至实验设定值，100℃、30 min灭菌，冷却至32℃左右接种酒曲，在试验设定温度条件下恒温培养，培养期间早晚各匀浆一次。发酵至实验设定时间即取出，4 800 r/min离心15 min固液分离，上清液即为香菇柄酒精发酵液。
1.3.3 酒精度测定
取100 mL香菇柄酒精发酵液置于1 000 mL蒸馏瓶中，加入100 mL蒸馏水，蒸馏出100 mL溶液，用酒精比重计测定蒸馏液的酒精度，同时用温度计测定溶液温度，根据《酒精计温度浓度换算表》换算成20℃时的酒精体积分数（%）即为酒精度。
1.3.4 Plackett-Burman试验设计
Plackett-Burman试验能仅用两个水平，通过较少试验次数从多因素中选出影响显著的因素[16-18]。采用Plackett-Burman试验对影响酒精发酵的8个因素（原料粉碎度、香菇柄根粉用量、磷酸二氢钾用量、葡萄糖添加量、初始pH值、酿酒曲接种量、发酵温度、发酵时间）进行显著性筛选。试验设计因素与水平见表1。
表1 Plackett-Burman试验因素与水平
Table1 Factors and levels of Plackett-Burman tests
?
续表
?
1.3.5 最陡爬坡试验[19-20]
基于Plackett-Burman试验筛选出的3个显著因素进行最陡爬坡试验设计。根据效应值的正负确定因素爬坡方向，基于效应值大小和实际情况设计因素步长。其他因素水平按照Plackett-Burman试验结果各因素的正负效应进行确定，效应值为正数取水平高值而负数取低值。以酒精度为考核指标确定因素的最适范围。
1.3.6 香菇柄根酒精发酵工艺响应面优化试验
基于Plackett-Burman和最陡爬坡试验结果，以酒精度（Y）为响应值，利用Box-Behnken进行工艺优化试验设计。根据响应面法建立的数学模型，分析、预测出香菇柄根酒精发酵最佳工艺条件，再结合仪器的精确度和操作便利性进一步优化工艺。对优化确定的工艺进行验证试验，对酒精发酵液和蒸馏液进行初步的品评。
1.3.7 数据处理
Plackett-Burman试验采用Minitab16设计分析；响应面优化试验采用Design-Expert 8.0.6设计软件分析；试验均做3次重复取平均值，除验证试验外均保留一位小数，显著性采用SPSS 22.0分析。
2 结果与分析
2.1 Plackett-Burman试验结果
在预试验的基础上，选取与香菇柄根酒精发酵工艺相关的8个因素，采用Minitab 16中的Plackett-Burman设计，取N=12，C、F、J为虚拟变量，试验设计与结果见表2，Design-Expert 8.0.6设计软件进行数据分析，结果见表3。
表2 Plackett-Burman试验设计与结果
Table2 Design and results of Plackett-Burman tests
?
表3 Plackett-Burman试验设计各因素效应分析
Table3 Effect analysis of each factors of Plackett-Burman experimental design
?
由表3可知，由P值大小可知，各因素对酒精度的影响大小顺序为香菇柄根粉用量＞发酵温度＞初始pH值＞磷酸二氢钾用量＞酿酒曲接种量＞原料粉碎度＞发酵时间＞葡萄糖添加量，其中香菇柄根粉用量、发酵温度和初始pH值3个因素对酒精度的影响重要性排列居前3位，因此需要进一步对这3个因素进行最陡爬坡试验。
2.2 最陡爬坡试验结果
应用Plackett-Burman试验筛选出的3个显著因素（香菇柄根粉用量、发酵温度和初始pH值）进行最陡爬坡试验。其他因素水平按照效应值正数取高值负数取低值的原则，固定为原料粉碎度60目，磷酸二氢钾用量0.15%，葡萄糖添加量22%，酿酒曲接种量0.3%，发酵时间72 h。试验设计和结果见表4。
表4 最陡爬坡试验设计及结果
Table4 Design and results of the steepest ascent tests
?
由表4可知，香菇柄根粉用量、发酵温度和初始pH值在第3组试验附近取值时，酒精度最高。因此，选取这一组试验作为中心组合试验设计的中心点，进行响应面试验。
2.3 香菇柄根酒精发酵工艺响应面优化试验结果
2.3.1 Box-Behnken试验设计结果与分析
在最陡爬坡试验结果的基础上，在固定原料粉碎度60目，磷酸二氢钾用量0.15%，葡萄糖添加量22%，酿酒曲接种量0.3%，发酵时间72h的条件下，以香菇柄根粉用量（A）、发酵温度（B）、初始pH值（C）为响应因子，以发酵液酒精度（Y）为响应值，根据Box-Behnken设计3因素3水平优化试验，试验设计与结果见表5，响应面二次模型方差分析见表6。
表5 Box-Behnken试验设计与结果
Table5 Design and results of Box-Behnken tests
?
表6 回归模型的方差分析
Table6 Variance analysis of regression model
注：“*”表示差异显著（P＜0.05）；“**”表示差异极显著（P＜0.01）。
?
利用Design Expert分析软件进行回归分析，得到酒精度对香菇柄根粉用量、发酵温度、初始pH值的二次回归模型方程：
由表6可知，模型P=0.000 2＜0.01，表明该模型极显著；一次项A、C，交互项AB、BC，二次项A2、B2对酒精度的影响极显著（P＜0.01）；二次项C2对酒精度的影响显著（P＜0.05）；失拟项P=0.129 3＞0.05，影响不显著，说明回归方程具有显著性，模型能较好分析和预测响应值；决定系数R2=0.970 2，说明模型的拟合性较好，调整决定系数
0.931 9，说明利用该模型能解释93.19%响应值的变化，表明该模型可信度高。
2.3.2 响应面分析
响应面图能直观地反应各因素与响应值之间的关系以及两因素之间的交互作用对响应值的影响[21]。根据回归方程做出各因素交互作用对酒精度影响的响应面及等高线，结果见图1。
图1 各因素交互作用对酒精度影响的响应面与等高线
Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on alcohol content
由图1可知，香菇柄根粉和发酵温度对酒精度响应面坡度较陡，说明两因素交互作用显著[22]；香菇柄根粉用量在1.5%～3.0%范围内时，随着用量的增加，响应值酒精度快速增长，但当用量过高时，可能过多的香菇柄根粉使发酵液粘度增大，进而影响酵母菌对其他营养物质的吸收利用，导致酒精度降低；随着发酵温度的升高，酒精度呈先增加后降低的趋势。香菇柄根粉和初始pH对酒精度响应面坡度较为平缓，说明两因素交互作用不显著（P＞0.05）[22]；随着香菇柄根粉用量和初始pH的增加，响应值酒精度呈先增加后降低的趋势。发酵温度和初始pH对酒精度响应面坡度较陡，说明两因素交互作用显著，分析原因可能是发酵液pH和温度能协同作用于香菇柄根粉从而影响香菇柄根粉中营养物质的溶出而最终影响酒精的生成；随着发酵温度和初始pH的增加，响应值酒精度呈先增加后降低的趋势。
2.3.3 香菇柄根酒精发酵最佳工艺条件的确定与验证试验
根据响应面法建立的数学模型，分析预测出香菇柄根酒精发酵工艺的最佳工艺条件：香菇柄根粉用量3.69%、发酵温度31.07℃和初始pH7.25，酒精度预测值为11.22%vol。结合仪器的精确度和方便操作性，将最佳工艺条件确定为：香菇柄根粉用量3.7%、发酵温度31℃和初始pH7.3。在此工艺条件下做3次验证试验，发酵液平均酒精度为11.32%vol，与预测值相差0.88%，验证值接近模型预测值，说明新建模型能较好地预测香菇柄根酒精发酵工艺的酒精度，表明响应面法优化香菇柄根酒精发酵工艺是可行的。
3 结论
以废弃香菇柄根为主料，通过Plackett-Burman试验分析得出各因素对酒精度的影响大小为：香菇柄根粉用量＞发酵温度＞初始pH值＞磷酸二氢钾用量＞酿酒曲接种量＞原料粉碎度＞发酵时间＞葡萄糖添加量。在此基础上通过最陡爬坡试验、响应面工艺优化试验最终优化确定出香菇柄根酒精发酵最佳工艺条件为：香菇柄根粉用量3.7%、发酵温度31℃和初始pH值为7.3，原料粉碎度60目，磷酸二氢钾用量0.15%，葡萄糖添加量22%，酿酒曲接种量0.3%，发酵时间72 h。该工艺验证试验结果为发酵液酒精度达11.32%vol，比模型预测值11.22%vol高0.88%，说明响应面法可以用于香菇柄根酒精发酵工艺的优化。在此优化条件下得到的香菇柄根粉酒精发酵液和蒸馏液均具有香菇的特殊芳香、口感圆润余味悠长，为香菇柄根废料发酵制备酒精类产品提供一定的理论支持。
[1]王大为，戴龙，徐旭，等.碾轧对香菇柄综合品质影响及工艺优化[J].食品科学，2013，34（22）：33-39.
[2]高虹，史德芳，何建军，等.超微粉碎对香菇柄功能成分和特性的影响[J].食品科学，2010，31（5）：40-43.
[3]杨萌，徐艳阳，杨光，等.超声波辅助酶法提取香菇柄中总黄酮的工艺优化[J].食品安全质量检测学报，2017，8（1）：202-209.
[4]刘丽娜，魏书信，李顺峰，等.乳酸菌发酵香菇柄主要营养成分的变化[J].食品安全质量检测学报，2018，9（15）：4006-4012.
[5]刘存芳，田光辉，赖普辉，等.香菇柄中营养成分的开发与利用综述[J].科技信息，2008（1）：14-15.
[6]张铂瑾，徐燕新，郭颖娜，等.香菇素肉干制作工艺的研究[J].保鲜与加工，2013，13（6）：29-31.
[7]吴丽樱，苏东洋，张拥军，等.非化学改性香菇柄膳食纤维的理化特性研究[J].食用菌，2014，（4）：67-69.
[8]陈美玲，徐峰.香菇柄素蹄休闲食品的研制[J].食用菌，2018，40（2）：76-79.
[9]危贵茂，万小平.香菇肉松的加工工艺[J].肉类工业，2001（5）：10-11.
[10]宋波.一种香菇酱CN108497459A[P].2018-09-07
[11]王大为，张艳荣，李玉.发酵型香菇酒生产工艺的研究[J].食品科学，2004，25（12）：82-87.
[12]李兰，郭丹钊，熊庆伟.香菇酒发酵工艺条件优化[J].酿酒，2006，23（1）：68-70.
[13]盘柳萍，谢晓航.发酵促进剂在酒精发酵过程中对酿酒酵母的影响[J].轻工科技，2013，174（5）：27-28，62.
[14]汪东旭.浅论酒精发酵中酵母菌所需的营养[J].中国石油和化工标准与质量，2013（19）：31，46.
[15]张青，丁立孝，王莹，等.发酵型羊肚菌保健酒的工艺研究[J].中国酿造，2010，29（5）：167-170.
[16]El-SHEEKH M M,KHAIRY H M,GHEDA S F,et al.Application of Plackett-Burman design for the high production of some valuable metabolites in marine alga Nannochloropsis oculata[J].Egypt J Aquat Res,2016,42(1):57-64.
[17]JABEEN H,IQBAL S,ANWAR S,et al.Optimization of profenofos degradation by a novel bacterial consortium PBAC using response surface methodology[J].Int Biodeter Biodegr,2015,100:89-97.
[18]LAKSHMIKANDAN M, SIVARAMAN K, ELAIYA R S, et al. Biodegradationof acrylamide by acrylamidase from Stenotrophomonas acidaminiphilaMSU12 and analysis of degradation products by MALDI-TOF andHPLC[J]. Int Biodeter Biodegr, 2014, 94: 214-221.
[19]王贤，张苗，木泰华.甘薯渣同步糖化发酵生产酒精的工艺优化[J].农业工程学报，2012，28（14）：256-261.
[20]彭真汾，谢倩，池毓斌，等.响应面试验优化超声法提取橄榄果实游离氨基酸工艺[J].食品科学，2017，38（20）：146-153.
[21]ELKSIBI I,HADDAR W,TICHA M B,et al.Development and optimization of a non conventional extraction process of natural dyefrom olive solid waste using response surface methodology(RSM)[J].Food Chem,2014,161(1):345-352.
[22]汪正兴，韩强，郜海燕，等.响应面试验优化亚临界水提取核桃粕蛋白工艺及其氨基酸分析[J].食品科学，2017，38（20）：191-196.