米糠是稻谷精加工过程中的副产物，主要由种皮、果皮、糊粉层、外胚乳和胚的混合物组成，约占稻谷质量的5%～6%[1-2]。我国米糠资源丰富，年产近1 200万t，但综合利用率低，仅为15%左右，主要用于饲料加工和生产米糠油[3-5]。米糠全身是宝，含有丰富的脂肪、蛋白质、膳食纤维等，对其活性成分进行研究，发现米糠含有米糠蛋白、米糠油、米糠多糖等多种活性成分[6-9]。米糠蛋白主要包括清蛋白、球蛋白、谷蛋白等营养价值可与鸡蛋、牛乳相媲美的蛋白；且这些蛋白具有低过敏性，因此米糠蛋白适用于开发婴幼儿及特殊人群的功能性食品[10-12]。米糠多糖是米糠的主要活性成分之一，主要由葡聚糖、阿拉伯木聚糖、鼠李糖等组成，具有抗肿瘤、降血糖、降胆固醇等功能[13]；将米糠多糖与氯化铁反应能够制备米糠多糖铁，从而促进铁的吸收、减少对胃肠黏膜的损害[14]。米糠油包括维生素E、角鲨烯、植物甾醇等活性物质，能够改善氧化损伤、预防疾病发生等[15]。
目前，关于米糠的研究主要集中在功能性成分的提取工艺及其优化，我国米糠应用仍处于研究阶段，深入开发研究米糠具有广阔前景[16-17]。2017年《国务院办公厅关于加快推进农业供给侧结构性改革大力发展粮食产业经济的意见》（国办发〔2017〕78号）中明确提出要大力开展米糠、碎米、麦麸等副产物综合利用，因此开发米糠可食化配料及其相关产品显得尤为重要[18]。随着生物技术的快速发展，通过发酵技术开发米糠资源已成为有效途径[19]。
本试验以膨化米糠为原料，以酒精度、可溶固形物和感官评分为评价依据，探索料水比、酵母菌接种量、发酵温度、发酵时间对米糠发酵酿酒工艺的影响，在单因素试验基础上通过正交试验，得到最佳发酵工艺参数，为米糠的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
米糠：湖北金龙泉股份有限公司；酿酒高活性干酵母（黄酒专用）：湖北安琪酵母股份有限公司；壳聚糖：国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
PH20恒温培养箱：天津市泰斯仪器有限公司；LB10T手持式折光仪、3255酒精度测量仪：天津市吉星仪表厂；JY1002型电子天平：上海浦春计量仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 米糠酒酿造工艺流程
1.3.2 操作要点
浸渍、蒸煮、淋水：将膨化后的米糠[20-21]用清水浸渍24 h，常压蒸煮25 min，蒸煮完毕后进行淋水降温，使温度降至30 ℃左右。
接种：待米糠冷却后，接种活化后的活性干酵母，将瓶口用8层纱布扎紧，置于恒温培养箱中发酵。
过滤、澄清、灭菌：用4层纱布过滤，再加0.1 g/L壳聚糖进行澄清处理，过滤后再于70 ℃恒温10 min。
1.3.3 米糠酒发酵工艺优化单因素试验
（1）料水比对米糠酒发酵的影响
取蒸煮好的米糠，分别按1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0（g∶mL）的料水比加水，接种0.3%的酵母菌，在32 ℃条件下发酵10 d。发酵结束后，测定酒精度和可溶固形物含量。
（2）酵母菌接种量对米糠酒发酵的影响
取蒸煮好的米糠，按1∶2.0（g∶mL）的比例加水，分别接种0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的酵母菌，在32 ℃条件下发酵10 d。发酵结束后，测定酒精度和可溶固形物含量。（3）发酵温度对米糠酒发酵的影响
取蒸煮好的米糠，按1∶2.0（g∶mL）的比例加水，接种0.4%的酵母菌，分别在28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃条件下发酵10 d。发酵结束后，测定酒精度和可溶固形物含量。
（4）发酵时间对米糠酒发酵的影响
取蒸煮好的米糠，按1∶2.0（g∶mL）的比例加水，接种0.4%的酵母菌，在32 ℃条件下发酵6 d、8 d、10 d、12 d、14 d。发酵结束后，测定酒精度和可溶固形物含量。
1.3.4 米糠酒发酵工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，对料水比（A）、酵母菌接种量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）4个因素在3个不同水平上进行优化试验，以酒精度和感官评分为考察指标，对米糠酒发酵工艺条件进行L（934）正交试验设计，正交试验因素与水平见表1。
表1 米糠酒发酵工艺条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for rice bran wine fermentation conditions optimization
水平 A 料水比（g:mL）B 酵母菌接种量/%C 发酵温度/℃D 发酵时间/d 1 2 3 1:1.5 1:2.0 1:2.5 0.3 0.4 0.5 32 33 34 8 10 12
1.3.5 指标检测方法
酒精度测定：蒸馏比重法[22]；可溶固形物测定：手持折光仪。米糠酒的风味、色泽等采用感官评定法分析。每次10位成员（5男5女）分别进行品评记分，按照设计的米糠酒感官评分标准（见表2）打分（满分100分），取10位成员评分的平均值为最终得分。
表2 米糠酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of rice bran wine
项目 评价标准 分值/分色泽（15分）香味（25分）口感（40分）风格（20分）清澈透亮，有光泽微浑浊色泽差、浑浊有米糠及酒特有的香味，醇香浓郁米糠特有的香味不突出，微有异香香味不协调，有异味或臭味口感醇和细腻，风味协调口感苦涩，较细腻有酸败味，苦涩，口味不协调具有米糠酒特有的风格，色香味协调酒体尚协调，但风格不明显米糠成分不协调，特征不突出，有明显白酒味11～15 6～10 1～5 17～25 9～16 1～8 28～40 16～27 1～15 14～20 8～13 1～7
2 结果与分析
2.1 米糠酒发酵工艺条件优化单因素试验结果与分析
2.1.1 料水比对米糠酒发酵的影响
料水比对米糠酒发酵的影响见图1。按照不同的料水比配制成米糠液后，对米糠液的可溶固形物含量进行测定，含量分别为12.4°Bé、11.9°Bé、11.1°Bé、10.7°Bé、9.8°Bé，随着料水比逐渐减小，可溶固形物含量逐渐降低。由图1可知，料水比在1∶1.0～1∶3.0（g∶mL）范围内，由于加水量逐渐增加，米糠酒的可溶性固形物含量逐渐降低。料水比在1∶1.0～1∶2.0（g∶mL）范围内，由于适量的水利于酵母发酵作用，米糠酒的酒精度增加；此后，继续增加加水量，发酵液逐渐稀释，酒精度降低，同时过量的水使酒液色泽寡淡、香味不足。因此，米糠酒的最佳料水比为1∶2.0（g∶mL），此时米糠酒色泽金黄透亮，兼具米糠和酒的香味。
图1 料水比对米糠酒发酵的影响
Fig. 1 Effect of solid-liquid ratio on rice bran wine fermentation
2.1.2 酵母菌接种量对米糠酒发酵的影响
酵母菌接种量对米糠酒发酵的影响见图2。由图2可知，酵母菌接种量在0.1%～0.4%范围内，随着酵母菌接种量的增加，米糠酒的酒精度逐渐增加，可溶性固形物含量逐渐降低；酵母菌接种量＜0.4%之前，酵母不足导致发酵效率低，产酒量不足；当酵母菌接种量＞0.4%时，酵母间相互竞争激烈，发酵液中营养物质不足，发酵代谢产物多，酒精度、可溶固形物无显著变化，米糠酒口感酸涩。因此，酵母菌接种量选择0.4%较为适宜，该条件下米糠酒发酵完全，金黄透明、酒香浓郁。
图2 酵母菌接种量对米糠酒发酵的影响
Fig. 2 Effect of inoculum on rice bran wine fermentation
2.1.3 发酵温度对米糠酒发酵的影响
发酵温度对米糠酒发酵的影响见图3。由图3可知，随着发酵温度的升高，米糠酒酒精度呈先升高后下降的趋势，可溶固形物呈先降低后升高趋势，32 ℃时酒精度最高，可溶固形物含量最低。发酵温度较低时，菌种生长缓慢，发酵速度慢，发酵周期长，同时酵母菌自身生长耗糖量增加，使米糠酒酒精度偏低；发酵温度过高时，菌种衰老加快，酒精转化效率低，发酵不彻底，影响酒的品质[23]。因此，应选32 ℃为最佳发酵温度。
图3 发酵温度对米糠酒发酵的影响
Fig. 3 Effect of fermentation temperature on rice bran wine fermentation
2.1.4 发酵时间对米糠酒发酵的影响
发酵时间对米糠酒发酵的影响见图4。由图4可知，随着发酵时间的延长，酒精度呈先增加后平稳的趋势，可溶固形物呈先降低后平稳的趋势。感官评定发现，发酵时间长短会影响米糠酒的风味。发酵12 d时米糠酒酒精度达到9.3%vol，具有米糠香气，口感醇厚，酒体协调；发酵14 d时米糠酒酒精度变化不显著，口感较醇厚，略有涩味。发酵时间较短，米糠酒发酵不充分，酒精度较低，影响风味；发酵时间过长，代谢产物积累，抑制菌种生长，同时对米糠酒风味产生影响。因此，选择12 d为最佳发酵时间。
图4 发酵时间对米糠酒发酵的影响
Fig. 4 Effect of fermentation time on rice bran wine fermentation
2.2 米糠酒发酵工艺优化正交试验
为确定最佳发酵条件，在单因素试验的基础上，研究料水比、酵母菌接种量、发酵温度、发酵时间对米糠酒发酵的影响，以酒精度和感官评分为评价指标，进行L9（34）正交试验。正交试验结果见表3，方差分析结果见表4、表5。
表3 米糠酒发酵工艺条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for rice bran fermentation conditions optimization
序号 A B C D 酒精度/%vol 感官评分/分123456789k1 111222333 123123123 123231312 123312231 6.0 7.8 8.6 9.7 8.7 8.6 9.2 8.9 7.0 65 76 79 90 76 75 86 81 72 k2 k3R 7.5 9.0 8.4 1.5 8.3 8.5 8.1 0.4 7.8 8.2 8.8 1 7.2 8.5 9.1 1.9因素主次最优组合k1 k2 k3R D＞A＞C＞B A2B2C3D3 73 81 80 7 D＞A＞C＞B A2B1C3D3 80 78 75 5 74 79 80 6 71 79 83 8因素主次最优组合
表4 以酒精度为评价指标的正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using alcohol content as evaluation index
注：“**”表示差异极显著（P＜0.01），“*”表示差异显著（P＜0.05）。下同。
因素 偏差平方和 自由度 均方 F 值 F0.05值ABCD误差10.687 0.727 4.667 16.007 3.180 2 2 2 2 1 8 5.343 0.363 2.333 8.003 0.177 30.245 2.057 13.208 45.302 3.555 3.555 3.555 3.555 F0.01值 显著性6.013 6.013 6.013 6.013******
表5 以感官评分为评价指标的正交试验结果方差分析
Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results using sensory score as evaluation index
因素 偏差平方和 自由度 均方 F 值 F0.05值ABCD误差268.667 112.667 232.667 704.667 154 2 2 2 2 1 8 134.333 56.333 116.333 352.333 8.556 15.701 6.584 13.597 41.182 3.555 3.555 3.555 3.555 F0.01值 显著性6.013 6.013 6.013 6.013********
通过表3中酒精度和感官评分的极差分析结果可知，影响酒精度和感官评分的各因素主次顺序为发酵时间＞料水比＞发酵温度＞酵母菌接种量。从k值得出使米糠酒精度最佳的工艺条件为A2B2C3D3，在此条件下发酵得到的米糠酒酒精度为10.3%vol，可溶固形物含量为1.8°Bé，感官评分为92分；从k值得出使米糠酒感官评分最佳的工艺条件为A2B1C3D3，在此条件下发酵得到的米糠酒酒精度为9.8%vol，可溶固形物为2.0°Bé，感官评分为91分。综合分析得出最佳的工艺条件为A2B2C3D3，即料水比1∶2.0（g∶mL），酵母菌接种量0.4%，发酵温度34 ℃，发酵时间12 d，在此优化条件下，发酵得到的米糠酒酒精度为10.3%vol，可溶固形物含量为1.8°Bé，酒体清澈透亮有光泽，具有米糠和酒的香味，口感醇香浓郁，感官评分最佳。由表4、表5方差分析结果可知，因素A、C、D对米糠酒酒精度均有极显著影响（P＜0.01），因素A、B、C、D对米糠酒感官评分均有极显著影响（P＜0.01），影响发酵因素的主次顺序为D＞A＞C＞B，即发酵时间＞料水比＞发酵温度＞酵母菌接种量，与直观分析结果一致。
3 结论
本研究以米糠为原料发酵酿制米糠酒，结果表明，影响米糠酒发酵的各因素的主次顺序为：发酵时间＞料水比＞发酵温度＞酵母菌接种量。通过单因素试验及正交试验确定米糠酒发酵最佳工艺条件：料水比1∶2.0（g∶mL），酵母菌接种量0.4%，发酵温度34 ℃，发酵时间12 d。在此优化条件下，米糠酒酒精度为10.3%vol，可溶固形物含量为1.8°Bé，米糠酒酒体清澈透亮有光泽，具有米糠和酒的香味，口感醇香浓郁。这为米糠的深入研究及新产品开发利用提供理论依据。
[1] MOONGNGARM A, DAOMUKDA N, KHUMPIKA S. Chemical compositions,phytochemicals,and antioxidant capacity of rice bran,rice bran layer,and rice germ[J].Apcbee Procedia,2012,2(5):73-79.
[2]朱文华，姚惠源，谈新刚.米糠的不稳定机理与稳定化的研究[J].粮食与饲料工业，2001（10）：174-175.
[3]刘婷婷.米糠高值化综合利用关键技术研究[D].长春：吉林农业大学，2012.
[4] LEI L, WEN W, ZHANG R, et al. Complex enzyme hydrolysis releases antioxidative phenolics from rice bran[J].Food Chem,2017,214:1-8.
[5]王劲松，徐艳，朱德艳，等.米糠大豆酸奶发酵条件的优化[J].食品工业科技，2018，39（7）：49-53.
[6]藏小丹，王宇新，陈超，等.米糠酶解物的功效及其活性成分研究进展[J].粮食与油脂，2016，29（10）：5-7.
[7] HAMADA J S. Characterization and functional properties of rice bran proteins modified by commercialexoproteases and endoproteases[J]. J Food Sci,2000,65(2):305-310.
[8]马传国，梁少华，王伟，等.一级米糠油生产工艺的研究[J].中国粮油学报，2005（5）：102-104，123.
[9]朱丽丹，王莉，徐逸木，等.米糠多糖及硫酸酯化米糠多糖的体外免疫应答和抗肿瘤活性研究[J].中国粮油学报，2015，30（3）：35-40.
[10]张兆琴，万小保.米糠蛋白提取研究进展[J].农产品加工，2017（12）：54-55，60.
[11]林耀盛，陈智毅，张友胜，等.微波辅助酶法制备米糠蛋白工艺对黄曲霉毒素B1 脱除及酶解效果的影响[J].热带作物学报，2017，38（4）：763-768.
[12]王乔，侯同刚，咸漠，等.两步酶解提取米糠蛋白的工艺研究及优化[J].氨基酸和生物资源，2016，38（4）：77-83.
[13]张铭，傅承新.米糠多糖提取工艺的优化[J].中国粮油学报，2001（5）：11-13.
[14]陈晶晶，潘显虎，吴淑恒，等.米糠多糖铁脂质体包合物的制备[J].食品研究与开发，2018，39（16）：64-68.
[15]叶虔臻，王微，李春松，等.米糠油应用研究进展[J/OL].食品工业科技：1-11[2018-11-26]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1759.ts.20180820.1558.015.html.
[16]徐浩，张海玲，顾广东，等.米糠加工及综合利用研究进展[J].粮油食品科技，2017，25（5）：37-41.
[17]张艳，陈文丹，张传智，等.米糠发酵食品的研究进展[J].食品安全导刊，2017（18）：67.
[18]邹昱成，鞠兴荣，何荣，等.食品配料米糠的研究进展[J].中国粮油学报，2018，33（7）：123-129.
[19]张艳，陈文丹，张传智，等.米糠发酵食品的研究进展[J].食品安全导刊，2017（18）：67.
[20]王劲松，陈清婵.不同膨化条件对米糠主要营养成分影响的研究[J].食品工业科技，2012，33（20）：340-341，360.
[21]王姣斐.压差式膨化技术及其在农产品加工中的应用研究进展[J].安徽农业科学，2015，43（25）：298-300，359.
[22]袁辉.衢州柑橘果酒生产工艺的研究[J].中国酿造，2010，29（1）：158-161.
[23]李若琳，张琪，朱丹，等.沙棘冰酒发酵条件的优化[J]. 中国酿造，2017，36（8）：173-176.