山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是葡萄科（Vitaceae）葡萄属（Vitis L.）多年生木质藤本植物[1]，野生山葡萄原产于中国东北、华北、朝鲜及俄罗斯远东地区，抗寒、抗病性强[2-5]，在原产地已经大面积栽培。新品种北国红经多年杂交选育而成，具有低酸的特点，且可溶性固形物可达到18%，富含酚类物质，可酿造单品种全汁干红葡萄酒[6]。
单宁（鞣质）广泛存在于植物界，在日化、食品、医药、畜牧等领域有广泛应用[7]，具有抗氧化活性[8-12]、抑制肿瘤和癌症[13-15]、抗炎[16-17]、抑菌[18-20]、提高食品品质[21]等功效。有学者定义植物单宁为相对分子质量在500～3 000 Da范围内的具有鞣性的多元酚[22]，是一种无色色素[23]，分为水解单宁和缩合单宁，葡萄中的单宁是缩合单宁，主要分布在葡萄皮和籽中[24]。单宁作为葡萄酒的骨架结构，是酿酒葡萄选育的重要指标之一，其含量的高低对葡萄酒的品质、口感、颜色、耐贮性有很重要的影响，单宁含量高的葡萄酒更稳定、更耐贮藏、结构层次感强、色泽和口感更加浓郁。单宁是葡萄酒中的呈涩物质[25-26]，具有收敛性[27-29]，在苹果酸-乳酸发酵过程[30]和陈酿过程中其自身的聚合反应和单宁与蛋白质的相互作用会使葡萄酒的涩味减弱，口感变得圆润[31-32]。
而且单宁与酒中某些大分子物质相互作用，产生沉淀形成酒泥，单宁含量降低，酒体变得稳定、澄清，单宁的抗氧化性对酒体稳定也起到一定的作用，让酒在适当的条件下能够更长时间的保存。单宁还与花色苷结合而具有辅色作用，陈酿过程中提高酒体稳定性和层次感[26]，增加香气物质[33]，从而使单宁含量高的干红酒保持山葡萄特有的深紫红色。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）新品种‘北国红’（Beiguohong）分别于2017年9月22日（正常采收）和2017年10月15日（延迟采收）采收，所有实验材料均采自中国农业科学院特产研究所试验基地（吉林省集安市麻线乡）。
丹宁酸（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；Folin-Denis试剂（色谱纯）：美国Sigma公司；碳酸钠（分析纯）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司。
1.2 仪器与设备
XS105DU微量分析天平：梅特勒-托利多国际贸易有限公司；SYG-数显恒温水浴锅：常州朗越仪器制造有限公司；TU-1901型紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。
1.3 实验方法
1.3.1 山葡萄干红酒加工工艺流程
分别以3种不同发酵工艺酿制干红葡萄酒，比较发酵期间以及成品酒的单宁含量。3种工艺都采用浸渍发酵，浸渍8 d进行皮渣分离，发酵阶段温度控制在20～25 ℃，陈酿阶段温度控制在15～20 ℃。
（1）工艺1（F1）
原料挑选脱粒、破碎，制得葡萄醪→加入偏重亚硫酸钾和
（2）工艺2（F2）
原料挑选脱粒、破碎，制得葡萄醪→加入偏重亚硫酸钾和活性干酵母→进行主发酵→皮渣分离→上清液固形物调至24.5%继续发酵→分离酒泥得原酒→陈酿→过滤除菌→装瓶→成品酒
（3）工艺3（F3）
原料挑选脱粒、破碎，制得发酵醪→加入偏重亚硫酸钾和活性干酵母→固形物调至24.5%进行主发酵→皮渣分离→上清液继续发酵→分离酒泥得原酒→陈酿→过滤除菌→装瓶→成品酒
1.3.2 测定方法
酒精度：采用酒精度计法测定[34]；总酸：以酒石酸计采用滴定法测定[34]；单宁含量：用Folin-Denis法测定[35]。
干酒柔顺指数计算公式如下：
柔顺指数=酒精度-（总酸+单宁）
1.3.3 数据分析
数据结果为3次重复的平均值±标准差，数据的处理应用Microsoft Excel 2004，数据分析采用SAS 9.4软件中的Duncan's进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 发酵过程单宁含量的变化
发酵期间山葡萄北国红干红酒单宁含量的变化见图1。由图1可知，正常采收北国红原汁的单宁含量为0.49 g/L，延迟采收北国红原汁单宁含量为0.57 g/L；主发酵阶段（0～8 d）单宁含量变化波动较大，后发酵阶段（9～27 d）趋于稳定，单宁含量在整个发酵阶段总体呈上升趋势。采用工艺1发酵的发酵醪后发酵阶段单宁含量显著降低（P＜0.05），两个采收期分别采用3种工艺酿制的干酒发酵至发酵结束（27天）时单宁含量较发酵醪原汁均显著升高（P＜0.05）。整个发酵阶段延迟采收北国红发酵醪单宁含量显著高于正常采收北国红（P＜0.05）。结果表明，北国红不同时期采收的原料采用该3种发酵工艺均能有效浸出葡萄皮中的单宁，且延迟采收北国红发酵期间单宁含量整体显著高于正常采收北国红。
图1 北国红发酵期间单宁含量变化
Fig. 1 Changes of the tannin content during fermentation
2.2 陈酿期间单宁含量的变化
陈酿期间山葡萄北国红干红酒单宁含量的变化见图2。由图2可知，正常采收的北国红采用工艺1发酵结束干酒单宁含量为1.45 g/L，陈酿3个月与5个月后单宁含量分别为0.94 g/L、0.92 g/L；采用工艺2发酵结束干酒单宁含量为1.79 g/L，陈酿3个月与5个月后单宁含量分别为1.13 g/L、1.17 g/L；采用工艺3发酵结束干酒单宁含量为1.80 g/L，陈酿3个月与5个月后单宁含量分别为1.04 g/L、1.10 g/L。延迟采收的北国红采用工艺1发酵结束干酒单宁含量为1.87 g/L，陈酿3个月与5个月后单宁含量分别1.49 g/L、1.46 g/L；采用工艺2发酵结束干酒单宁含量为2.03 g/L，陈酿3个月与5个月后单宁含量分别为1.56 g/L、1.52 g/L；采用工艺3发酵结束干酒单宁含量为1.95 g/L，陈酿3个月与5个月后单宁含量分别为1.45 g/L、1.45 g/L。
图2 北国红干红酒陈酿阶段单宁含量变化
Fig. 2 Changes of tannin content in Beiguohong Vitis amuren sis dry red wine during the aging stage
采用3种工艺酿制的北国红干酒在发酵结束、陈酿3个月和陈酿5个月时的单宁含量差异显著（P＜0.05）：延迟采收北国红酿制的干红酒单宁含量显著高于正常采收北国红（P＜0.05）；采用工艺2酿制的北国红干酒单宁含量显著高于工艺1和工艺3（P＜0.05）；随着陈酿的进行，北国红干酒的单宁含量显著低于发酵刚结束时单宁含量（P＜0.05）。
2.3 北国红成品酒单宁含量的比较
北国红成品酒单宁含量的比较见表1。由表1可知，正常采收和延迟采收的北国红利用3种酿造工艺酿制的干酒单宁含量分别为0.92 g/L、1.17 g/L、1.10 g/L、1.46 g/L、1.52 g/L、1.45 g/L，其中延迟采收的北国红采用工艺2酿制的干酒单宁含量为1.52 g/L，显著高于其他处理（P＜0.05）。
表1 不同采收时期、发酵工艺北国红干红酒单宁含量比较
Table 1 Comparison of tannin content in Beiguohong dry red wine brewed by different harvesting stages and brewing processes
品种 采收时间 工艺 原汁/（g·L-1） 成品酒/（g·L-1）正常0.49±0.02b国红延迟F1 F2 F3 F1 F2 0.57±0.013a 0.92±0.03e 1.17±0.04c 1.10±0.01d 1.46±0.01b 1.52±0.03a北F31.45±0.01b
2.4 干红酒柔顺指数
柔顺指数是红葡萄酒品质的评价指标之一，经大量实践证明，葡萄酒的柔顺指数超过5属于品质较好、口感柔顺。北国红成品酒柔顺指数如图3所示。由图3可知，延迟采收的北国红采用工艺2酿制的干红酒柔顺指数为5.3，显著高于其他处理（P＜0.05）。
图3 不同工艺条件下的干红酒柔顺指数
Fig. 3 Suppleness index of dry red wine with different processing technologies
3 结论
正常采收和延迟采收的北国红利用3种酿造工艺均能有效浸出单宁，延迟采收北国红酿制的干红酒单宁含量显著高于正常采收（P＜0.05），采用工艺2酿制的北国红干酒单宁含量显著高于工艺1和工艺3（P＜0.05），且随着陈酿的进行，北国红干酒的单宁含量显著低于发酵刚结束（P＜0.05）。正常采收和延迟采收的北国红利用3种酿造工艺酿制的干酒单宁含量分别为0.92 g/L、1.17 g/L、1.10 g/L、1.46 g/L、1.52 g/L、1.45 g/L，其中延迟采收的北国红采用工艺2酿制的干酒单宁含量为1.52 g/L，柔顺指数为5.3，显著高于其他处理（P＜0.05）。
[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志，第48 卷（第2 册）葡萄科[M].北京：科学出版社，1998：165-166.
[2]宋润刚，郑永春，路文鹏，等.山葡萄种间杂交F1～F4 代对霜霉病抗性的遗传分析[J].果树学报，2008（1）：33-39.
[3]宋润刚，路文鹏，张庆田，等.山葡萄酿酒新品种雪兰红的选育[J].中国果树，2012（5）：1-5.
[4]张庆田，杨颖琼，杨欢，等.山葡萄酿酒新品种‘北国蓝’的选育[J].中国果树，2016（1）：65-68.
[5]宋润刚，路文鹏，郭太君，等.酿造干红葡萄酒新品种‘左优红’[J].园艺学报，2005（4）：757.
[6]舒楠，路文鹏，张庆田，等.山葡萄新品种北国红的选育及性状调查[J].中外葡萄与葡萄酒，2017（4）：51-53.
[7]张文斌，曹逸群，张萌萌，等.单宁的理化性质及其应用研究[J].西部皮革，2014，36（14）：24-29.
[8] MOUSAVINEIAD G, EMAM-DJOMEH Z, REZAEI K. Identification and quantification of phenolic compounds and their effects on antioxidant activity in pomegranate juices of eight Iranian cultivars[J]. Food Chem,2009,115(4):1274-1278.
[9]邓文，张世昌，蔡荣斌，等.栗树单宁对断奶仔猪生产性能、肠道形态和通透性及抗氧化性能的影响[J].中国饲料，2018（1）：44-48.
[10]杨琼琼，李东，屈恋，等.涩柿树皮单宁的纯化及抗氧化活性[J].食品科学，2016，37（7）：50-55.
[11]谭伟，唐晓萍，董志刚，等.不同果皮颜色酿酒葡萄品种果实不同部位酚类物质含量比较及抗氧化能力分析[J].中国农学通报，2015，31（28）：252-258.
[12] FEDELI D, BERRETTINI M, GABRYELAK T, et al. The effect of some tannins on trout erythrocytes exposed to oxidative stress[J].Mutat Res,2004,563(2):89-96.
[13]王添敏，俞文婕，付莹，等.胡桃楸总鞣质的小鼠体内抗肿瘤作用研究[J].中国医药导报，2017，14（3）：16-19.
[14]CHEN K S,HSIAO Y C,KUO D Y,et al.Tannic acid-induced apoptosis and-enhanced sensitivity to arsenic trioxide in human leukemia HL-60cels[J].Leukemia Res,2009,33(2):297-307.
[15] NAM S, SMITH D M, DOU Q P. Tannic acid potently inhibits tumor cell proteasome activity,increases p27 and Bax expression,and induces G1 arest and apoptosis[J].Cancer Epidem Biomar,2001,10(10):1083-1088.
[16] DEMARQUE D P, DEMARQUE, CALLEJON D R, et al. The role of tannins as antiulcer agents: a fluorescence-imaging based study[J].Rev Bras Farmac,2018,28(4):425-432.
[17]陈鹏，涂杰，周本宏.石榴皮鞣质改善慢性肾小球肾炎大鼠的尿液代谢组学的通路分析[J].中国药师，2017，20（6）：969-973.
[18]ELIZONDO A M,MERCADO E C,RABINOVITZ B C,et al.Effect of tannins on the in vitro growth of Clostridium perfringens[J].Vet Microbiol,2010,145(3):308-314.
[19]松长青，周本宏，易慧兰，等.石榴皮鞣质的抗菌活性及其对金黄色葡萄球菌的抗菌机制[J].中国医院药学杂志，2016，36（4）：259-265.
[20]刘颖沙，李建科，张琳，等.柑橘汁中嗜酸耐热菌的分离、鉴定以及单宁酸对其抑菌作用研究[J].食品与生物技术学报，2017，36（7）：767-772.
[21]ABO-DONIA F M,YANG L Y,HRISTOV A N,et al.Effects of tannins on the fatty acid profiles of rumen fluids and milk from lactating goats fed a total mixed ration containing rapeseed oil[J]. Livest Sci, 2017,204:16-24.
[22]SCOLLARY G R,CONSULTANT P.GWRDC Tannin Review[M].Australian:Grape and wine research&development corporation,2010:9-22.
[23] BATE-SMITH E C, RIBEREAU-GAYON P. Leuco-anthocyanins in seeds[J].Qual Plantarum Mater Veg,1959,5(3):189-198.
[24]李华.葡萄酒化学[M].北京：科学出版社，2005：110-115.
[25] BATE-SITH E C.Haemanalysis of tannins: The concept of relative astringency[J].Phytochemistry,1973,12(4):907-912.
[26]刘朝霞，刘青，李荀，等.葡萄酒中单宁含量调查与口感关系的分析[J].食品安全质量检测学报，2014，5（7）：2226-2230.
[27]李辉，李超，张梦园，等.葡萄酒中单宁涩感评价及结构分析研究进展[J].中国酿造，2017，36（6）：14-18.
[28]马婧，袁春龙，杨丽，等.红葡萄酒呈涩物质的化学分析[J].食品科学，2016，37（4）：132-138.
[29]RICHARD G.Red wine astringency: a review[J].Aust J Grape Wine Res,1998,4(2):74-95.
[30]彭传涛，贾春雨，文彦，等.苹果酸-乳酸发对干红葡萄酒感官质量的影响[J].中国食品学报，2014，14（2）：261-268.
[31] OBREQUE-SLIER E, LÓPEZ-SOLÍS R, PEÑA-NEIRA Á, et al. Tannin-protein interaction is more closely associated with astringency than tannin-protein precipitation: experience with two oenological tannins and a gelatin[J].Int J Food Sci Tech,2010,45(12):2629-2636.
[32] SERAFINO S, VITTORIO A, LUIGI T, et al. Maceration with stems contact fermentation:effect on proanthocyanidins compounds and color in Primitivo red wines[J].Food Chem,2015,177:382-389.
[33]刘一健，孙剑锋，王颉.葡萄酒酚类物质的研究进展[J].中国酿造，2009，28（8）：5-9.
[34]全国食品工业标准化技术委员会.GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法[S].北京：中国标准出版社，2006.
[35]李静，聂继云，李海飞，等.Folin-酚法测定水果及其制品中总多酚含量的条件[J].果树学报，2008（1）：126-131.