红曲黄酒是福建特产，含有多种生物活性物质[1-3]，如γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、谷胱甘肽、多酚类物质与低聚糖等，具有降胆固醇、降血糖、降血压和防癌等功能以及通血脉、厚肠胃、润皮肤、散湿气、养脾气、扶肝、除风、下气等医疗保健功效[4]，深受消费者喜爱。传统工艺酿造的红曲黄酒具有温热属性，可以活血祛寒、通经活络，能有效抵御寒冷，预防感冒，作为低度佐餐饮料酒，在冬季饮服深受消费者的欢迎，但若在夏季饮用，对热性敏感体质人群，存在着易“上火”的体质表征等缺陷，也使红曲黄酒的消费受到地域性和时间性的制约，不利于黄酒市场占有率的扩大，成为红曲黄酒市场拓展的主要瓶颈之一[5]。为此，课题组研究了影响红曲黄酒寒热性的相关因子[6]，通过绿茶共发酵技术，研制出了温和清爽型的红曲茶黄酒，可显著降低传统红曲黄酒的热度，使黄酒热性指数下降超过40%[7]。绿茶中含有丰富的茶多酚、茶多糖、生物碱、维生素等功能活性物质，发酵过程中水溶性及醇溶性营养物质溶于酒中，使红曲黄酒的物质组成及其营养功效发生改变，使总酚含量提高30%以上[8]。已有研究表明，酚类物质的组分及含量对黄酒的抗氧化能力具有显著的影响[9-11]。但引入绿茶共发酵对红曲黄酒酚类物质组成与成分及其抗氧化能力的影响尚不明确。
血清内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是体内抗氧化的第一道防线，可将超氧阴离子自由基快速歧化为过氧化氢和分子氧[12]。谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）具有清除氧自由基、保护细胞免受氧化损伤的作用，可将过氧化氢转化为水和分子氧[13]。一般说来，体内SOD和GSH-Px酶活力越高，表明机体清除氧自由基的能力越强。氧自由基在体内的水平可以通过多种方式进行检测，其中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量被认为是极为重要的指标[14]，血清中MDA水平代表了机体的膜脂质过氧化水平。因此，可选择血清SOD 和GSH-Px酶活力和MDA含量作为评价小鼠抗氧化能力的核心指标。本研究采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法检测红曲黄酒酚类物质含量，酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒法检测小鼠血清的抗氧化酶活力及丙二醛（MDA）含量，以传统工艺红曲黄酒为对照，考察添加绿茶共发酵对红曲黄酒酚类物质及小鼠体内抗氧化酶活力的影响，以期为红曲茶黄酒新产品的深入开发提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
传统工艺红曲黄酒（酒精度16%vol）：本实验室自制；大米（永安圆糯米）、红曲米（宁德市古田平湖红曲米）：市售；发酵用水：宁德市蕉城区洋中天湖凤尾山泉水；绿茶：宁德市蕉城区“天山绿”绿茶，色泽翠绿，有清鲜茶香，冲泡后汤色碧绿、清澈明亮，滋味浓厚回甘；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）JH301：由本实验室自主选育并保存。
1.1.2 动物和饲料
清洁级美国癌症研究所（institute ofcancer research，ICR）健康小鼠（雌雄各半，体质量（20±2）g），饲料：上海斯莱克实验动物有限公司。
1.1.3 化学试剂
表没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯、没食子酸儿茶素、咖啡因、儿茶素、绿原酸、没食子酸、丁香酸、杨梅素、香豆酸、阿魏酸、香草酸、芦丁、紫丁香酸（纯度≥98%）：美国Sigma 公司；SOD、MDA、GSH-Px专用酶联免疫试剂盒：南京建成生物工程研究所；其他试剂均使用国产分析纯。
1.2 仪器与设备
PB-10型pH计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；1260型高相液相色谱仪：美国Agilent 公司；UV-1750紫外分光光度计：岛津（苏州）仪器有限公司；DW-FL362型离心机：上海安亭科学仪器有限公司；KDM型调温电热套：山东华鲁电热仪器有限公司；酒精计：浙江余姚比重计厂；SPX智能型生化培养箱：宁波江南仪器厂；TE601-I电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；YXQ-LS-505II立式压力蒸汽灭菌锅：上海
博讯实业有限公司医疗设备厂；陶土酒坛：宁德黄家酒业有限公司。
1.3 方法
1.3.1 红曲茶黄酒的制备
糯米经浸泡、蒸煮，以米饭∶水按照料液比1∶1（g∶mL）落缸，按总质量的5%接种古田红曲米，按总质量的1.0%接种酿酒酵母JH301，按总质量的1.0‰加入绿茶，搅拌均匀后控温（20±1）℃发酵40 d，压榨、过滤，调整酒精度为（16±0.5）%vol，85 ℃热灭菌15 min后陈酿（温度20 ℃）6个月，备用。在落缸时不添加绿茶共发酵的处理即为传统工艺红曲黄酒。
1.3.2 动物模型试验
将小鼠随机分为5组，即正常组、传统红曲黄酒组、低剂量红曲茶黄酒组（0.05 mL/10 g）、中剂量红曲茶黄酒组（0.10 mL/10 g）、高剂量红曲茶黄酒组（0.20 mL/10 g）。每组分3个平行组，每个平行组20只小鼠，即每组共60只小鼠。各组小鼠正常饲养1周作为适应期，之后按表1方案灌胃给药并继续饲养，每日上午1次，每次灌胃剂量为0.05 mL/10 g、0.10 mL/10 g、0.20 mL/10 g，灌胃造模90 d后检测小鼠血清生化指标，考察添加绿茶发酵对红曲黄酒抗氧化能力的影响。
表1 不同实验组小鼠给药方案
Table 1 Dosage regimen of each experimental groups
分组 给药方案正常组传统黄酒组低剂量红曲茶黄酒组中剂量红曲茶黄酒组高剂量红曲茶黄酒组灌服蒸馏水（0.10 mL/10 g）灌服传统红曲黄酒（0.10 mL/10 g）灌服低剂量红曲茶黄酒（0.05 mL/10 g）灌服中剂量红曲茶黄酒（0.10 mL/10 g）灌服高剂量红曲茶黄酒（0.20 mL/10 g）
中国居民膳食指南中推荐每人每日酒精摄入量≤25 g，传统红曲黄酒及红曲茶黄酒样品酒精度16%vol，折算成其每日摄入量不超过156.25 mL，以人平均体质量60 kg计，传统红曲黄酒及红曲茶黄酒的人体日推荐量约为≤2.6 mL/kg。以10 倍人体推荐量为基础来设定实验组剂量，因此高、中、低剂量组分别设为20.0 mL（/kg·d）、10 mL（/kg·d）及5 mL（/kg·d）。
1.3.3 检测方法
酚类物质的含量：采用高效液相色谱法测定[8]；总酚含量的测定：采用GB/T 21733—2008《茶饮料》[15]；咖啡因含量的测定：采用GB 5009.139—2014《饮料中咖啡因的测定》[16]。
小鼠SOD、GSH-Px酶活力和MDA含量测定：从小鼠眼球采取血液，于4 ℃条件下1 500 r/min离心10 min，用移液枪取300 μL血清，装于1.5 mL离心管中，使用SOD、MDA、GSH-Px专用酶联免疫试剂盒检测小鼠SOD、GSH-Px酶活力和MDA含量。以每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）；以每0.1 mL血清（浆）在37 ℃条件下反应5 min，扣除非酶促反应作用，使反应体系中GSH浓度降低1 mol/L为一个GSH-Px酶活力单位（U）。
1.3.4 数据处理
采用DPS6.01软件处理，结果以“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 红曲茶黄酒的酚类物质组分与含量
表2 绿茶对红曲黄酒酚类物质成分与含量的影响
Table 2 Effect of green tea on the phenols composition and content of Hong Qu Huangjiu
注：“-”表示含量＜1 mg/L。小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）；大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01）。
酚类物质 传统红曲黄酒/（mg·L-1）红曲茶黄酒/（mg·L-1）表没食子儿茶素EGC没食子儿茶素没食子酸酯EGCG儿茶素没食子酸酯ECG没食子酸儿茶素GC咖啡因儿茶素绿原酸没食子酸丁香酸杨梅素香豆酸阿魏酸香草酸芦丁紫丁香酸总酚含量- - - - -71.62±15.56Bb 45.22±0.66Bb 95.33±5.44Bb 35.49±2.54Aa 15.84±2.35Aa 67.26±1.08 47.50±5.38 14.33±3.44 10.33±0.36 36.60±0.05 91.23±5.88Aa 58.57±0.85Aa 124.66±5.44Aa 37.72±1.54Aa 16.27±2.34Aa- - - - -- - - - -353.24±10.51Bb 486.38±15.36Aa
由表2可知，传统红曲黄酒的酚类物质主要为儿茶素、绿原酸、没食子酸、丁香酸及杨梅素等。红曲茶黄酒添加绿茶共发酵，绿茶中的水溶性及醇溶性营养物质溶于酒中，可丰富传统红曲黄酒酚类物质组分，增加绿茶特征酚类物质表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、儿茶素没食子酸酯（catechin gallate，ECG）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）和咖啡因，还可使传统红曲黄酒的主要酚类物质如儿茶素、绿原酸和没食子酸的含量分别提高27.38%、29.52%和30.77%，使总酚含量提高37.69%。结果表明，添加绿茶共发酵不仅可极显著提高红曲黄酒酚类物质含量（P＜0.01），还可丰富红曲黄酒的酚类物质组成，赋予红曲黄酒绿茶的特征酚类物质。
2.2 红曲茶黄酒对小鼠血清的SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影响
表3 不同实验组小鼠血清的SOD、GSH-Px活力及MDA含量
Table 3 Activities of SOD and GSH-Px and MDA contents in serum of mice with different treatments
注：小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）；“－”表示无检测数据。
处理 SOD活力/（U·mL-1）GSH-Px活力/（U·mL-1）MDA含量/（nmol·mL-1）正常组传统黄酒组低剂量红曲茶黄酒组中剂量红曲茶黄酒组高剂量红曲茶黄酒组217.90±15.65c 228.97±7.62b 229.88±5.53b 235.96±6.38a－857.42±63.71c 944.52±94.49b 958.32±63.25b 1 062.58±35.24a－9.32±0.14a 9.05±0.41b 8.97±0.38b 8.78±0.41c－
由表3可知，每天灌服0.20 mL/10 g红曲茶黄酒的高剂量红曲茶黄酒组小鼠出现了严重的死亡现象，故不统计其对小鼠抗氧酶活力的影响。结果表明，与灌服蒸馏水组小鼠相比，灌服传统红曲黄酒可分别使小鼠血清的SOD酶和GSH-Px酶活力显著提高5.08%和10.16%（P＜0.05），小鼠血清的MDA含量降低2.90%，说明传统红曲黄酒可提高小鼠的抗氧化水平；灌服低剂量红曲茶黄酒可分别使小鼠血清的SOD酶和GSH-Px酶活力显著提高5.49%和11.77%（P＜0.05），小鼠血清的MDA含量显著降低3.76%（P＜0.05），与灌服传统红曲黄酒组差异未达显著水平（P＞0.05）；灌服中剂量红曲茶黄酒可分别使小鼠血清的SOD酶和GSH-Px酶活力分别显著提高8.29%和23.93%（P＜0.05），小鼠血清的MDA显著含量降低5.79%（P＜0.05），与灌服蒸馏水组、灌服传统红曲黄酒组和灌服低剂量红曲茶黄酒组的差异均达显著水平（P＜0.05）。与传统红曲黄酒相比，红曲茶黄酒可显著提高小鼠的抗氧化能力，使小鼠血清的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）酶活力分别提高3.05%和12.50%（P＜0.05），MDA含量显著降低2.98%（P＜0.05）。灌胃剂量越大，红曲茶黄酒的抗氧化能力就越强；但当灌胃剂量达0.20 mL/10 g时，小鼠出现了死亡现象。结果表明，添加绿茶共发酵可显著提高红曲黄酒的抗氧化能力。
2.3 讨论
现代医学研究已经证明，很多疾病如组织器宫老化等都与过剩的自由基有关。氧在生物体内通过单电子还原产生化学性质活泼的物质称活性氧，它们包括超氧负离子自由基、过氧化氢和羟基自由基等。活性氧可以与DNA、蛋白质和多元不饱和脂肪酸作用，造成DNA链断裂和氧化性损伤、蛋白-蛋白交联、蛋白-DNA交联和脂质过氧化。体内也有各种消除活性氧和自由基的防御系统，以免组织遭到伤害，但当人体内出现各种各样负荷状态时，就会使活性氧和自由基的形成和消除之间平衡丧失，从而诱发各种组织损伤和疾病，引起如癌症、衰老、心血管疾病等慢性疾病[17]。茶多酚是一种纯天然抗氧剂，它是在茶叶水浸物中与亚铁离子产生综合反应的酚类化合物的总称。绿茶中的茶多酚主要为儿茶素类化合物，主要包括表没食子儿茶素（EGC）、DL-儿茶素（DL-catechin，DL-C）、表儿茶素（epicatechin，EC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子酸酷（EGCG）等，均具有极强的抗氧化能力[18-20]。茶多酚能对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用，能提高小鼠抗氧化酶（包括SOD、GSH-Px等）活性，有效阻止DNA由杂环胺引起的氧化损伤，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害[21]；茶多酚还可抑制自发性和Fe2+诱导性脂质过氧化，降低脂质过氧化程度和MDA含量[22-23]。因此，添加绿茶共发酵可显著提高红曲黄酒的抗氧化能力。与灌服传统红曲黄酒的小鼠相比，灌服红曲茶黄酒的小鼠的SOD、GSH-Px活力显著提高、MDA含量显著下降。
3 结论
本研究结果表明，添加绿茶共发酵不仅可丰富传统红曲黄酒的酚类物质组分及含量，与传统红曲黄酒相比，小鼠血清的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力分别显著提高3.05%和12.50%（P＜0.05），MDA含量显著降低2.98%（P＜0.05）。饮用黄酒需达一定浓度的才可以增强机体的抗氧化能力、降低氧化损伤[24]，若剂量过低发挥的功效并不显著，但剂量过高会导致小鼠死亡（灌胃剂量达0.20 mL/10 g时），适宜范围仍需进一步研究证实。此外，红曲茶黄酒的抗氧化能力与其所含抗氧化酚类物质的含量有关，其确切关系还需进一步深入研究。
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