大米是我国主要粮食作物之一，也是米酒酿造的主要原料，其营养成分直接影响米酒品质。本课题组前期对相同品种、不同储存年份和不同品种、相同储存年份大米进行对比研究，发现储存年份对大米碳氮成分影响小于品种[1]。已有研究表明，大米加工处理条件、储存温度和时间均会显著影响其碳氮物质组成[2-3]。随储存时间延长，大米会出现脂肪损耗[4]、蛋白质降解[5]及淀粉分子结构改变[6]等变化，造成原料品质劣变。米酒酿造中经常使用陈米，其碳氮成分与米酒品质息息相关。因此关注储存时间对大米碳氮成分的影响对于调控米酒品质具有重要研究意义。
大米营养成分与米酒风味品质息息相关，发酵过程中来自大米中的淀粉和蛋白质等营养成分在微生物及其酶的作用下水解为葡萄糖、氨基酸、肽类和有机酸等[7]，这些物质一方面成为米酒滋味物质，赋予米酒酸甜口感[8]，另一方面被微生物代谢为乙醇、高级醇和酯类等[9-10]，进一步影响米酒风味。高级醇是米酒中重要的呈香物质，适量的高级醇可赋予酒体醇香，增加酒体协调性[11]，而过量的高级醇易导致酒体刺激性增强，饮后易出现头晕、上头、宿醉等不适症状[12]。高级醇和乙醇均可在乙酰辅酶A的参与下生成乙酸酯类化合物，增加米酒的芳香和果香[13]，提高米酒质量。研究表明，不同品种大米的营养组成存在差异[14]，这会进一步改变发酵代谢产物的生成水平[15]，从而导致最终酿造米酒中高级醇的种类和含量存在差异[16]。近年来，酒中高级醇含量的调控研究是食品安全与发酵工程领域的研究热点，但多集中于微生物菌种筛选和原料品种的比较分析[17]，由储存条件带来的大米营养成分变化对米酒品质的影响研究仍较为有限。
高级醇和乙酸酯类化合物是米酒中重要的香气成分，发酵菌株和大米原料是影响高级醇和乙酸酯类化合物含量的主要因素[11,18]。本课题组前期从贵州传统小曲中分离出低产高级醇的酿酒酵母FBKL2.8022，采用该菌株发酵贵州和辽宁2个地区10个品种大米制备米酒，结果表明，贵州白水大米与辽宁有机糯米发酵米酒高级醇含量处于中低水平，较适合用于酿造“不上头”的健康型米酒[17,19]。因此，本研究进一步以不同储存时间的贵州白水大米与辽宁有机糯米为原料，采用低产高级醇酿酒酵母FBKL2.8022酿造米酒，分析大米碳氮成分及米酒高级醇和乙酸酯类化合物含量，解析米酒发酵中碳氮消耗与醇酯形成的相关性，考察不同储存时间对原料碳氮成分的影响及对所酿米酒中高级醇和乙酸酯类化合物形成的影响，为定向调控发酵米酒的高级醇和乙酸酯类化合物形成提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌种、材料与试剂
酿酒酵母FBKL2.8022（保藏编号：CCTCC M2019406）为本课题组前期在贵州传统小曲中筛选的低产高级醇菌株[19]。
白水大米（BS）和有机糯米（YJ）均采用聚乙烯袋真空包装，室温（约25～30 ℃）储存，具体信息见表1。
表1 不同储存时间大米样品信息
Table1 Information on rice samples with different storage times
编号品种产地来源储存时间/月BS21白水大米（籼米）贵州铜仁种植基地0BS20白水大米（籼米）贵州铜仁种植基地14BS19白水大米（籼米）贵州铜仁种植基地19YJ21有机糯米（糯米）辽宁大连盖亚农场0YJ20有机糯米（糯米）辽宁大连盖亚农场14YJ19有机糯米（糯米）辽宁大连盖亚农场19YJ17有机糯米（糯米）辽宁大连盖亚农场44
17种氨基酸、牛血清白蛋白（标准品） 北京索莱宝科技有限公司；直链淀粉、支链淀粉标准品 上海易恩化学技术有限公司；乙醇（纯度≥99.8%）、正丙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯标准品（色谱纯） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、磷酸二氢钾、碘、碘化钾、葡萄糖、磺基水杨酸 天津市永大化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
7890A气相色谱（gas chromatography，GC）仪、DB-FFAP毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；Varioskan Flash超微量全波长读数酶标仪、Multifuge X3R冷冻离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司；Allegra X-30R冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；SZ-93全自动双重水蒸馏器 上海银泽仪器设备有限公司；S-443D氨基酸分析仪、LCAK07/Li色谱柱（150 mm×4.6 mm） 赛卡姆（北京）科学仪器有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LT1002E电子天平 常熟市天量仪器有限责任公司；PHS-3C pH计 上海理达仪器厂；DK-98-IIA电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 大米中蛋白质、淀粉和水解氨基酸含量测定
参考何宇淋[1]的方法，使用双缩脲法对大米中的蛋白质含量进行检测。参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》和GB 5009.6—2025《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》分别测定大米中水分和脂肪含量，使用酶标仪比色法结合双波长法[20]测定大米中淀粉含量。
采用氨基酸分析仪测定水解氨基酸含量[1]。称取0.080 g过100目筛的大米粉，用6 mol/L盐酸补足至5 mL，混匀，完全密封，110 ℃水解24 h，冷却后调节溶液pH值至2左右，用蒸馏水补足至100 mL，过0.45 μm水系针孔滤膜。分析条件[17]：LCAK07/Li色谱柱（150 mm×4.6 mm），茚三酮流速0.25 mL/min，进样量50 μL，反应器温度130 ℃，脯氨酸检测波长440 nm，其他氨基酸检测波长570 nm，流动相流速0.45 mL/min。
1.3.2 米酒发酵工艺流程
米酒发酵工艺流程如图1所示。以500 mL三角瓶作为发酵容器，发酵体积为250 mL，以大米编号作为发酵编号，以酿酒酵母FBKL2.8022作为发酵菌株，接种量为1×106个/mL，30 ℃发酵168 h。以酶解后未接菌时作为发酵0 h，对不同发酵时间的发酵醪液进行取样，离心去除酵母细胞后保存于4 ℃，用于葡萄糖、氨基酸、乙醇、高级醇和乙酸酯类化合物含量分析。
图1 米酒发酵工艺流程示意图
Fig.1 Schematic diagram of the rice wine fermentation process
1.3.3 发酵醪液理化指标测定
葡萄糖含量：称取0.65 g DNS、4.5 g丙三醇，加入32.5 mL 2 mol/L NaOH溶液，充分溶解后定容至100 mL，避光低温保存[21]。采用DNS比色法测定发酵液中葡萄糖含量[22]。
游离氨基酸含量：对发酵醪液进行过滤、离心（8 000 r/min、5 min）后，吸取上清液1 mL，加入9 mL 2 g/100 mL磺基水杨酸溶液，混合均匀后静置15 min，离心（3 000 r/min、20 min）后吸取上清液，过0.45 μm水系滤膜，使用氨基酸分析仪检测，检测条件同1.3.1节水解氨基酸测定。
乙醇体积分数：取100 mL发酵醪液滤液，加入等量蒸馏水，混合均匀后蒸馏，当馏出液达到100 mL后按GB 5009.225—2023《食品安全国家标准 酒和食用酒精中乙醇浓度的测定》测定米酒的乙醇体积分数。
1.3.4 馏出液高级醇和乙酸酯类化合物含量测定
采用GC法测定馏出液样品中高级醇和乙酸酯类化合物含量。馏出液经0.22 μm有机针孔滤膜处理，备用。用色谱级乙醇作溶剂配制4种高级醇（正丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇）和5种乙酸酯（乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯）的单一标准和混合标准溶液。
GC条件[1]：DB-FFAP色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；氢火焰离子化检测器，检测温度260 ℃；升温程序：初始温度45 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升至120 ℃，保持3 min，再以30 ℃/min升至220 ℃，保持5 min；进样量1 μL，分流比40∶1，氢气流速30 mL/min，空气流速300 mL/min。
定性与定量：根据标准品保留时间定性，外标法定量。
1.4 数据处理
采用SPSS 21软件进行单因素方差分析，通过Tukey’s HSD法开展事后多重比较，P＜0.05表示差异显著。采用Pearson相关性分析和双侧显著性检验进行相关性分析；采用Origin 2018绘制柱状图，采用ChiPlot在线平台绘制相关性气泡图。
2 结果与分析
2.1 不同大米基础理化指标
由表2可知，7种大米的蛋白质量分数范围为4.17%～6.65%，总淀粉质量分数为14.76%～90.33%，直链淀粉质量分数为1.47%～8.52%，支链淀粉质量分数为12.86%～81.87%。相同储存条件下，储存0个月和14个月的BS大米蛋白质量分数（6.65%、5.50%）分别显著高于YJ大米（5.77%、5.08%），储存19个月BS大米蛋白质量分数（4.21%）显著低于YJ大米（4.89%）； BS大米支链淀粉（80.88%～81.87%）和总淀粉质量分数（86.36%～90.33%）均显著高于YJ糯米，这与何宇淋等[20]的研究结果一致。随着储存时间的延长，大米蛋白质含量呈下降趋势，BS21储存14、19个月后蛋白质量分数分别降低17.29%、36.69%；YJ21蛋白质量分数分别降低11.96%、15.25%。储存时间对BS大米和YJ糯米淀粉组成和含量的影响不一致，BS大米储存14、19个月后总淀粉和支链淀粉含量变化不显著，直链淀粉分别降低31.22%、35.68%；YJ糯米储存14、19个月后，支链淀粉分别降低36.79%、47.84%，总淀粉质量分数则降低34.22%、44.80%。经44个月储存，YJ17蛋白质（4.17%）、支链淀粉（12.86%）和总淀粉质量分数（14.76%）显著 低于YJ21。
表2 不同大米基础理化指标
Table2 Basic physicochemical indicators of different rice samples
理化指标BS21BS20BS19YJ21YJ20YJ19YJ17水分质量分数/%12.10±0.03a1.60±0.01b1.38±0.07b12.58±0.08a1.68±0.38b1.45±0.29b1.49±0.06b脂肪质量分数/%1.03±0.02a0.86±0.05bc0.94±0.04ab0.68±0.01d0.90±0.03bc1.05±0.06a0.79±0.05cd蛋白质量分数/%6.65±0.19a5.50±0.10b4.21±0.02d5.77±0.02b5.08±0.06c4.89±0.05c4.17±0.12d直链淀粉质量分数/%8.52±0.39a5.86±0.12b5.48±0.43b1.47±0.24c1.78±0.12c1.77±0.29c1.90±0.48c支链淀粉质量分数/%81.81±0.73a81.87±2.23a80.88±1.52a31.23±1.27b19.74±3.33c16.29±1.12cd12.86±0.73d总淀粉质量分数/%90.33±0.38a87.73±2.35a86.36±1.46a32.70±1.17b21.51±3.45c18.05±1.01cd14.76±0.48d
注：同行小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
不同大米中水解氨基酸含量见图2。7种大米的水解氨基酸总含量范围为46.65～71.24 mg/g，相同储存时间下，YJ糯米水解氨基酸总含量（56.75～71.24 mg/g） 高于BS大米（46.65～58.20 mg/g）。储存时间的延长导致BS大米和YJ糯米水解氨基酸总含量下降，BS21和YJ21水解氨基酸总含量经14、19个月储存后均降低（BS降低11.55、10.34 mg/g；YJ降低14.49、11.31 mg/g）。7种大米中谷氨酸（9.67～14.09 mg/g）、天冬氨酸（4.32～6.64 mg/g）、亮氨酸（4.43～6.50 mg/g）和精氨酸（3.84～6.02 mg/g）含量均较高，半胱氨酸（0.06～0.79 mg/g）和甲硫氨酸（0.02～0.79 mg/g）含量均低于1 mg/g，这与Wang Chunxiao等[17]的研究结果相似。BS大米和YJ糯米中的水解氨基酸含量处于动态变化，品种对BS和YJ大米水解氨基酸的影响大于储存时间。
图2 不同大米中水解氨基酸含量
Fig.2 Hydrolyzed amino acid contents in different rice samples
2.2 米酒发酵过程中葡萄糖和游离氨基酸含量变化
由图3可知，米酒发酵0～18 h时，葡萄糖含量变化不显著，发酵36 h时，不同储存时间大米发酵醪液葡萄糖含量之间出现显著差异。发酵168 h时，所有大米发酵醪液葡萄糖质量浓度均低于35 g/L，YJ17发酵醪液葡萄糖质量浓度（31.25 g/L）显著高于YJ20、YJ19（分别为16.66、17.62 g/L），不同储存时间的BS大米发酵醪液葡萄糖含量无显著差异。乙醇的产生也验证了葡萄糖的消耗，除样品YJ17发酵醪液乙醇体积分数较低（11.40%）外，其他6种大米发酵醪液乙醇体积分数相差不大（15.50%～16.50%）。大米储存过程中会发生复杂的酶促反应和淀粉组分结构变化[23]，长期储存可能导致大米陈化加剧，可供酿酒酵母乙醇发酵利用的蛋白质和水解氨基酸等营养成分含量下降。
图3 米酒发酵过程中葡萄糖含量变化及发酵终点乙醇体积分数
Fig.3 Changes in glucose content during rice wine fermentation and ethanol volume fraction at the fermentation end point
氨基酸是微生物生长营养和米酒滋味物质的重要来源[24]，其组成受大米品种、发酵菌株和酿造工艺等因素影响[25]。由图4可知，甘氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、组氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、丙氨酸和脯氨酸11种氨基酸是BS大米和YJ糯米发酵米酒中的主要氨基酸，这11种氨基酸总质量浓度超过25 mg/L，其他6种氨基酸在整个发酵过程中均处于较低水平，尤其是苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸3种氨基酸，其质量浓度均未超过15 mg/L。由表3可知，7种大米发酵醪液中游离氨基酸总含量均呈先降低后增加的趋势。发酵18 h时，与BS21相比，BS20、BS19发酵醪液游离氨基酸总质量浓度增加（增加量分别为96.25、100.73 mg/L），与YJ21相比，YJ20、YJ19发酵醪液游离氨基酸总质量浓度降低（降低量分别为88.72、74.55 mg/L）。发酵36 h和168 h时，与BS21相比，BS20、BS19与YJ20、YJ19发酵醪液游离氨基酸总含量均增加。整个发酵过程中，YJ17游离氨基酸总含量均低于YJ21，说明较长的储存时间对大米中游离氨基酸影响较大。
图4 米酒发酵中游离氨基酸含量
Fig.4 Free amino acid contents during rice wine fermentation
表3 米酒发酵过程中游离氨基酸总量变化
Table3 Changes in total free amino acids during rice wine fermentation
mg/L发酵时间/hBS21BS20BS19YJ21YJ20YJ19YJ1718 219.31315.56320.04371.95283.23297.40273.4836 130.22271.30201.50111.08139.75139.49104.05168 270.97323.79301.77349.39438.25406.92272.18
2.3 不同大米发酵米酒高级醇和乙酸酯类化合物含量变化
由表4可知，7种大米的总高级醇质量浓度为223.48～405.63 mg/L，BS20与BS19发酵米酒总高级醇质量浓度（405.63、400.94 mg/L）显著高于YJ20与YJ19（264.32、259.90 mg/L）。不同储存时间BS大米发酵米酒总高级醇含量无显著差异，不同储存时间YJ糯米发酵米酒总高级醇含量也无显著差异（P＞0.05）。因此，米酒总高级醇含量受大米储存时间影响较小，但受大米品种的显著影响。
表4 不同大米发酵米酒中高级醇和乙酸酯含量
Table4 Higher alcohol and acetate ester contents in rice wines fermented from different rice samples
mg/L化合物BS21BS20BS19YJ21YJ20YJ19YJ17正丙醇10.27±0.00b6.23±0.18c19.03±0.00a2.95±2.06de1.25±0.00ef0.00±0.00f0.00±0.00f异丁醇153.47±20.81ab171.90±20.10a166.00±11.67a109.34±5.06c75.09±1.04cdef62.84±30.19def72.82±0.00cdef异戊醇166.05±14.93ab175.57±10.47a168.03±8.78ab155.78±8.66ab142.78±6.50bc152.16±0.00ab114.10±0.00cde苯乙醇50.31±0.87a51.93±1.15a47.87±2.94a50.00±0.11a45.20±0.62ab44.90±0.35abc36.56±0.00cd高级醇总计380.09±36.61a405.63±29.23a400.94±23.38a318.06±15.88ab264.32±8.15b259.90±30.54b223.48±0.00b乙酸乙酯18.75±0.08abc17.09±0.45abc18.10±1.12abc23.79±1.29a21.55±1.10ab16.93±8.84abc18.97±0.00abc乙酸苯乙酯4.31±0.09a4.05±0.20ab2.31±1.85bc3.84±0.30abc3.31±0.47abc3.45±0.41abc3.72±0.00abc乙酸酯总计23.06±0.01a21.14±0.25a20.40±0.72a27.64±1.58a24.86±0.63a20.38±8.43a22.69±0.00a
由图5可知，发酵36 h时，异戊醇和异丁醇含量较高，BS20和BS19发酵米酒高级醇（正丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇）相差不大；YJ17发酵米酒苯乙醇含量最低，其他3种高级醇含量在各YJ组中差异不大。发酵168 h时，与BS21相比，BS20发酵米酒正丙醇含量显著降低（P＜0.05），BS19显著增加（P＜0.05）；与YJ21相比，YJ19发酵米酒异丁醇含量显著降低（P＜0.05），YJ17发酵米酒异戊醇和苯乙醇含量均显著降低（P＜0.05）。由表4可知，7种大米发酵产生较低含量乙酸酯类化合物，质量浓度为20.38～27.64 mg/L。由图5可知，乙酸酯类化合物的产生主要集中于36～168 h，发酵36 h时，仅YJ19和YJ17发酵米酒产生乙酸苯乙酯，发酵168 h时，BS19发酵米酒乙酸苯乙酯含量明显低于其他发酵米酒，其他大米发酵米酒乙酸苯乙酯含量差异不显著。
图5 米酒发酵过程中高级醇和乙酸酯类化合物含量
Fig.5 Contents of higher alcohols and acetate esters during rice wine fermentation
2.4 碳氮消耗与醇酯生成相关性分析
在Pearson相关性分析中，相关系数0.8～1.0为极强相关、0.6～0.8为强相关、0.4～0.6为中等相关、0.2～0.4 为弱相关、0.2以下为不相关。由图6可知，BS21组和YJ21组葡萄糖与高级醇、乙酸酯类化合物之间存在强相关性，BS19组葡萄糖与正丙醇相关性变弱，与乙酸苯乙酯无相关性（相关系数小于0.2），YJ19组葡萄糖与异丁醇相关性减弱。YJ17组葡萄糖与醇酯形成相关性远不及其他大米。储存时间影响BS大米和YJ糯米米酒发酵中葡萄糖消耗与醇酯形成相关性。因此，对大米发酵液中葡萄糖、游离氨基酸与高级醇及乙酸酯进行相关性分析。
原料氨基酸的组成差异影响酿酒酵母代谢产生高级醇[26-27]，从而引起碳氮消耗与醇酯生成相关性变化[17]。由图6可知，17种游离氨基酸多与醇酯形成存在强相关，且总体上BS大米相关性强于YJ糯米。2种大米发酵醪液游离氨基酸、高级醇和乙酸酯类化合物之间的相关性随储存时间增加表现出不同趋势，具体为：BS组游离氨基酸与正丙醇相关性逐渐减弱（相关性强弱顺序排列：BS21＞BS20＞BS19），与异丁醇、异戊醇、苯乙醇和乙酸乙酯则呈现相反趋势（相关性强弱顺序排列：BS19＞BS20＞BS21）；与YJ21组相比，YJ20、YJ19组和YJ17组游离氨基酸与异丁醇、异戊醇、苯乙醇和乙酸乙酯的相关性减弱，且随储存时间增加呈现先减弱后增强趋势（相关性强弱顺序排列：YJ21＞YJ20＞YJ17＞YJ19）。前体氨基酸通过Ehrlich途径合成相应的高级醇[28-29]，苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸4种氨基酸分别生成正丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇[10,30]。BS20组和BS19组缬氨酸-异丁醇、苯丙氨酸-苯乙醇相关性增强，苏氨酸-正丙醇相关性减弱。YJ20组苏氨酸-正丙醇、亮氨酸-异戊醇、苯丙氨酸-苯乙醇相关性增强，缬氨酸-异丁醇相关性减弱；YJ19组和YJ17组苏氨酸-正丙醇、苯丙氨酸-苯乙醇相关性减弱。由于酿酒酵母高级醇和乙酸酯类化合物代谢途径的复杂性，不同储存时间、不同品种大米氨基酸与高级醇和乙酸酯类化合物的相关性并未呈现规律变化趋势。米酒发酵中，氨基酸经微生物代谢生成高级醇和乙酸酯类化合物，而储存时间和品种差异导致BS大米和YJ糯米原料起始和发酵过程中氨基酸组成不同，进一步影响醇酯生成差异，最终使BS大米和YJ糯米发酵米酒中氨基酸代谢与醇酯生成之间形成复杂的动态关联。
图6 葡萄糖、游离氨基酸与高级醇及乙酸酯的相关性分析
Fig.6 Correlation analysis of glucose and free amino acids with higher alcohols and acetate esters
3 结 论
以不同储存时间贵州白水大米和辽宁有机糯米为原料，系统分析基础理化指标、水解氨基酸含量及米酒发酵过程中的高级醇和乙酸酯类化合物的变化规律。相同储存时间下，BS大米支链淀粉和总淀粉含量显著高于YJ糯米，水解氨基酸含量则低于YJ糯米；随储存时间延长，2种大米蛋白质及水解氨基酸含量均不同程度下降。7种大米发酵米酒总高级醇质量浓度为223.48～405.63 mg/L，总乙酸酯质量浓度为20.38～27.64 mg/L；相同储存时间下，BS大米所酿米酒总高级醇含量显著高于YJ糯米，17种游离氨基酸与高级醇、乙酸酯多呈强相关且BS相关性强于YJ，储存时间对2种大米游离氨基酸与醇酯相关性影响不一致；储存44个月大米葡萄糖消耗与高级醇、乙酸酯形成相关性最弱，品种对碳氮-醇酯相关性的影响强于储存时间。综合以上结果，若需酿造高级醇含量丰富的米酒，建议优先选用储存时间较短的BS大米；若需酿造低高级醇健康型米酒，则建议选用储存时间较长的YJ糯米，本研究为从原料碳氮成分层面定向调控米酒醇酯品质提供了理论依据。
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