绿豆为豆科植物绿豆的种子，别名青小豆、菉豆、植豆等。绿豆富含多种营养物质，具有清热解毒、消暑利水之功效，传统上可用于改善暑热烦渴、水肿、泄泻等症状，为常用的药食同源原料[1-2]。近代药理研究表明，绿豆具有抗氧化[3]、降血脂、降血糖[4]、抗肿瘤、护肝[5-6]等活性。绿豆中的代表性黄酮类化合物主要为牡荆素和异牡荆素。其中，牡荆素（4,5,7-三羟基黄酮-8-葡萄糖苷）属于C-糖基化黄酮，异牡荆素为牡荆素的同分异构体，这2种化合物被认为是绿豆中关键的功能活性因子，表现出显著的保肝、抗氧化、抗菌、抗炎及心血管保护功能[7-8]。因此，开展绿豆黄酮的食品开发与应用研究具有重要的现实意义。
露酒是我国独具特色的传统饮料酒，产业历史悠久。GB/T 17204—2021《饮料酒术语和分类》[9]中露酒定义：以黄酒、白酒为酒基，加入按照传统既是食品又是中药材或特定食品原辅料或符合相关规定的物质，经浸提和/或复蒸馏等工艺或直接加入从食品中提取的特定成分，制成的具有特定风格的饮料酒。依托药食同源的传统优势，露酒产业发展势头强劲，市场潜力巨大，预计到2030年，露酒市场规模可达2 000亿元[10]。绿豆露酒是以绿豆为主要原料，经浸提、复配等工艺制成的养生型露酒产品。已有研究中，谭利等[11]基于高效液相色谱-质谱/紫外检测器（high performance liquid chromatographymass spectrometry/ultraviolet visible detector，HPLC-MS/UVD）检测，筛选出牡荆素作为绿豆大曲的关键质控指标。牡荆素和异牡荆素是绿豆中的主要黄酮类成分，是绿豆制品发挥生理活性的主要物质基础。因此，将牡荆素和异牡荆素作为绿豆露酒的双指标开展定性与定量检测，能够更加精准、全面地评价产品品质，可为绿豆露酒的质量稳定与标准化管控提供科学依据。
目前，牡荆素和异牡荆素测定以HPLC法为主，具有适用范围广、成本低、易操作等优点[12]。汤珺等[13]建立了一种同时测定小儿感冒颗粒中异牡荆素等12个活性成分含量的HPLC法；Zhang Aiwu等[14]优化检测条件，开发了一种基于HPLC法同时测定绿豆发芽过程中牡荆素和异牡荆素含量的方法；Luo Jiaqiang等[4]基于HPLC法建立了绿豆和红小豆中牡荆素和异牡荆素含量测定方法；刘小舟等[15]基于HPLC法建立了异牡荆素磷脂复合物中有关物质含量的测定方法，以甲醇作为有机相，各目标峰分离度良好。液相色谱-串联质谱法具有高灵敏度与强特异性，可有效克服基质干扰的优点[16]，但其存在成本高昂、操作维护复杂、仪器普及率低等缺点，仅少量研究将其应用于相关成分检测。例如，谭利等[11]采用HPLC-MS/UVD测定绿豆大曲中牡荆素含量；Zhang Wenyuan等[17]基于液相色谱-质谱非靶标代谢组学技术研究不同类型豆类基本营养成分和代谢物组成。
因此，本研究基于现有HPLC法，拟通过优化色谱条件缩短出峰时间，提升检测效率，旨在建立一种操作简单、精密度高、分析速率快，可同步测定绿豆露酒中牡荆素和异牡荆素含量的方法，以期为绿豆露酒中的有效成分牡荆素与异牡荆素含量测定和品质标准化管控提供可靠技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
7批次代表性绿豆露酒（编号L1～7） 泸州老窖养生酒业有限责任公司。
牡荆素、异牡荆素标准品（纯度均＞98%）、甲醇、乙醇、甲酸（均为色谱纯） 上海麦克林生化科技股份有限公司；实验用水均为超纯水。
1.2 仪器与设备
2695 HPLC仪（配备2487 UVD）、Ultimate LP-C18色谱柱（300 mm×4.6 mm，5 μm） 美国Waters公司；XPR36分析天平（0.000 1 g） 瑞士梅特勒-托利多公司。
1.3 方法
1.3.1 牡荆素、异牡荆素标准溶液配制
分别精密称取50 mg牡荆素、异牡荆素标准品，甲醇溶解，定容至50 mL，制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液，4 ℃避光保存备用。分别吸取0.04、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 mL牡荆素、异牡荆素标准储备溶液于10 mL容量瓶中，甲醇定容，获得质量浓度分别为4、10、20、40、80、160 mg/L的牡荆素、异牡荆素混合标准溶液。现用现配。
1.3.2 样品制备
取1 mL甲醇空白溶液、牡荆素和异牡荆素混合标准溶液、绿豆露酒样品，用0.22 μm微孔滤膜（有机相）过滤，待测。
1.3.3 色谱条件
参照刘小舟等[15]的方法并稍作修改，调整初始温度和分段组合洗脱程序。色谱条件：Ultimate LP-C18色谱柱，流动相：A为甲醇，B为0.2%甲酸溶液，检测波长270 nm，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温箱温度40 ℃。分段组合洗脱程序：0～4.9 min， 10% A；4.9～5 min，10%～50% A；5～20 min，50% A； 20～20.1 min，50%～10% A；20.1～25 min，10% A。
定性与定量分析：根据牡荆素、异牡荆素标准品色谱峰保留时间进行定性分析。采用外标法进行定量分析。
1.3.4 色谱条件优化
在1.3.3节的基础上，考察分段组合洗脱（甲醇-0.2%甲酸溶液体积比10∶90和50∶50）与柱温箱温度对色谱峰响应值的影响。
1.3.5 方法学考察
1.3.5.1 标准曲线绘制
参照Zhang Aiwu等[14]的方法，采用外标法进行定量，对4、10、20、40、80、160 mg/L混合标准工作溶液进行HPLC检测。以牡荆素、异牡荆素质量浓度为x轴、对应色谱峰面积为y轴，绘制标准曲线，并根据回归方程计算牡荆素与异牡荆素含量。
1.3.5.2 重复性实验
根据1.3.2节的方法制备6个露酒样品，按1.3.3节的色谱条件进行分析，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.3.5.3 稳定性实验
参照Wang Changhe等[18]的方法并稍作修改，对于日间精密度分析，本研究调整为连续4 d重复测定露酒样品，计算RSD。
1.3.5.4 精密度实验
根据1.3.3节的色谱条件，连续6次测定质量浓度为20 mg/L的牡荆素和异牡荆素混合标准溶液，计算RSD。
1.3.5.5 加标回收率实验
采用加标回收率评价方法的准确性。参照Zhang Aiwu等[14]的方法并稍作修改。取已知目标物含量L1样品3份，分别加入低、中、高3个质量浓度（10、20、30 mg/L）梯度混合标准溶液，经HPLC测定，记录各目标物色谱峰面积，计算加标回收率。
1.3.5.6 检出限（limit of detection，LOD）与定量限（limit of quantitation，LOQ）测定
参照Wang Changhe等[18]的方法，采用逐步稀释法测定并计算目标物LOD和LOQ。具体地，采用甲醇将牡荆素与异牡荆素混合标准工作液稀释至适当质量浓度，按照1.3.3节的方法进行测定。以3倍信噪比对应质量浓度作为LOD，以10倍信噪比对应质量浓度作为LOQ。
1.3.5.7 样品含量测定
利用所建立的方法对7批绿豆露酒样品进行测定。准确吸取1 mL酒样，按1.3.3节的色谱条件进行检测，记录各目标物色谱峰面积，分别计算牡荆素与异牡荆素含量。
1.4 数据处理
本研究测定均重复3次，结果以x±s表示；采用Excel 2019软件对数据进行计算，使用Origin 2018绘图，采用SPSS 21进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 色谱条件优化结果
考虑到各种溶剂的理化性质并结合参考文献[13,15]，选择甲醇-0.2%甲酸溶液为流动相，参考刘小舟等[15]测定异牡荆素磷脂复合物的HPLC检测条件，本研究在洗脱5 min时设置甲醇-0.2%甲酸溶液体积比10∶90和50∶50两组流动相比例进行洗脱。由图1可知，当流动相体积比为50∶50时，色谱图基线平稳，牡荆素与异牡荆素色谱峰峰对称、分离效果良好，且保留时间均小于10 min，理论塔板数和分离度均满足定量分析要求。另外，柱温箱温度对牡荆素和异牡荆素的分离速率存在一定影响，适当提高柱温箱温度可缩短目标物保留时间，综合分离效果与检测效率，最终确定柱温箱温度为40 ℃，流动相流速为1.0 mL/min。
图1 色谱条件优化前（A）、后（B）牡荆素与异牡荆素标准溶液（40 mg/L） HPLC图
Fig.1 HPLC chromatograms of vitexin and isovitexin standard solutions (40 mg/L) before (A) and after (B) chromatographic condition optimization
2.2 专属性验证
取空白溶液、混合标准工作溶液、绿豆露酒样品，按优化后的色谱条件进行HPLC分析，结果表明，绿豆露酒样品色谱图中可检出与混合标准溶液对应位置的特征色谱峰，两种目标物分离度均大于1.5，且空白溶液在牡荆素、异牡荆素对应保留时间处无色谱干扰峰，证明该色谱条件可实现绿豆露酒中牡荆素、异牡荆素的有效分离与精准检测。报道显示，基于HPLC法的牡荆素与异牡荆素检测周期普遍偏长，其中牡荆素保留时间在14～33 min之间，异牡荆素保留时间在15～50 min之间[4,13-14,19-27]。在本方法中，牡荆素和异牡荆素标准品保留时间分别为9.502 min和9.806 min；绿豆露酒样品中牡荆素和异牡荆素保留时间分别为9.395 min和9.694 min，出峰时间均小于10 min，检测速率更快，且与标准品保留时间差异较小，进一步证明该方法在绿豆露酒牡荆素和异牡荆素含量测定应用中的可行性与适用性。本方法单针样品总分析时长仅25 min，相较于现有检测手段，操作简便、分析效率更高。
2.3 方法学性能评价
2.3.1 线性关系
由图2可知，牡荆素的线性回归方程为y＝17 057x+ 74 342（R2＝0.999 9），异牡荆素的线性回归方程为 y＝24 632x+42 661（R2＝0.999 9）。结果表明，牡荆素和异牡荆素在质量浓度4～160 mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系，满足样品定量检测要求。
图2 牡荆素（A）与异牡荆素（B）标准曲线
Fig.2 Standard curves for vitexin (A) and isovitexin (B)
2.3.2 重复性
由表1可知，牡荆素、异牡荆素平均质量浓度分别为30.67、19.59 mg/L，RSD分别为1.09%、0.63%，RSD均小于1.10%，证明该方法具有良好的重复性，能够满足定量检测要求。
表1 重复性实验结果
Table1 Results of repeatability test
593 38530.43592 70130.39荆素524 66019.57 19.590.63目标物峰面积质量浓度/（mg/L）平均质量浓度/（mg/L）RSD/%601 14030.88 596 27030.60牡荆素594 25930.48 30.671.09607 40631.25528 29619.72 523 82519.53异牡521 97119.46529 70019.77523 32619.51
2.3.3 稳定性
由表2可知，绿豆露酒样品中牡荆素与异牡荆素质量浓度的RSD分别为2.04%、2.12%，表明4 d内重复测定结果的精密度良好，方法稳定性符合要求。
表2 稳定性实验结果
Table2 Results of stability test
目标物测定值放置时间/d123432.2635.1932.3032.49质量浓度/（mg/L）32.2131.3831.9531.59牡荆素30.9933.2932.1232.04平均质量浓度/（mg/L）31.8233.2932.1232.04RSD/%2.0420.9322.6620.3321.12质量浓度/（mg/L）21.1021.2621.7121.00异牡荆素21.2121.9621.0221.06平均质量浓度/（mg/L）21.0821.9621.0221.06RSD/%2.12
2.3.4 精密度
由表3可知，待测标准溶液牡荆素和异牡荆素质量浓度的RSD分别为0.97%和1.11%，且多次进样下2种目标物的色谱保留时间无明显偏移，表明在该色谱条件下，方法具有良好的可靠性。
表3 精密度实验结果
Table3 Results of precision test
目标物质量浓度/（mg/L）平均质量浓度/（mg/L）RSD/%牡荆素2109..06072109..09761199..968119.880.97异牡荆素2200..22422109..29472109..481120.141.11
2.3.5 加标回收率实验
由表4可知，牡荆素加标回收率为94.60%～97.10%，异牡荆素加标回收率为94.93%～96.75%，均处于合理范围，表明本方法准确度良好。
综合各项方法学验证结果，该检测方法精准可靠，适用于绿豆露酒样品中牡荆素与异牡荆素的定性鉴别及定量测定。
表4 加标回收率实验结果
Table4 Results of spiked recovery test
目标物加标量/（mg/L）本底值/（mg/L）测定值/（mg/L）回收率/%RSD/%1041.1894.601.29牡荆素2031.7251.0896.801.133060.8597.100.78异荆牡素23100021.15443009...765093999466...479035001...441279
2.3.6 LOD与LOQ
以3倍和10倍信噪比确定牡荆素和异牡荆素的LOD与LOQ。结果显示，牡荆素和异牡荆素的LOD分别为0.37、0.30 mg/L，LOQ分别为1.25、1.02 mg/L，表明该方法对露酒中牡荆素和异牡荆素的定量分析具有良好的灵敏度。
2.3.7 不同样品的测定结果
表5结果显示，不同批次绿豆露酒中牡荆素质量浓度为11.80～32.12 mg/L，异牡荆素质量浓度为9.82～21.15 mg/L，不同批次绿豆露酒中牡荆素与异牡荆素含量存在一定差异。因此，本方法可精准检测各样品间目标物含量，适用于多批次绿豆露酒样品的批量检测与品质监控。
表5 实际样品测定结果
Table5 Determination results of actual samples
样品目标物质量浓度/（mg/L）RSD/%L1异牡牡荆荆素素2321..0122±±00..6198aa03..2558L2异牡牡荆荆素素2301..4258±±00..2045bb01..2121L3异牡牡荆荆素素3211..7115±±00..3409aab20..9340L4异牡牡荆荆素素192.9.113±±00..1028dd01..6176L5异牡牡荆荆素素1126..0531±±00..4123cc21..0651L6异牡牡荆荆素素191..8820±±00.0.014dd00..3161L7异牡牡荆荆素素1126..0601±±00..0378cc20..3645
注：同列小写字母不同表示同种目标物、不同样品之间差异显著（P＜0.05）。
3 结 论
本研究建立可同时测定绿豆露酒牡荆素、异牡荆素的HPLC法，以甲醇-0.2%甲酸溶液为流动相，通过梯度洗脱程序、柱温等色谱参数系统优化后确定整套检测条件：Ultimate LP-C18色谱柱（300 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：A为甲醇，B为0.2%甲酸溶液，检测波长270 nm，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温40 ℃。在此条件下，牡荆素和异牡荆素标准品保留时间分别为9.502 min和9.806 min；两种目标物在质量浓度4～160 mg/L范围内线性关系良好，LOD为0.37、0.30 mg/L，LOQ为1.25、1.02 mg/L，加标回收率为94.60%～97.10%，准确度满足定量分析要求。本研究建立的HPLC法单针样品总分析时长仅25 min，检测效率优于现有报道方法。实际样品检测结果显示，不同绿豆露酒中牡荆素质量浓度为11.80～32.12 mg/L，异牡荆素质量浓度为9.82～21.15 mg/L，不同批次绿豆露酒中牡荆素、异牡荆素含量存在一定的差异。
该方法还存在以下局限性：方法的误差可能源于标准品称量的微小偏差、进样器的偶然误差及色谱柱经多次使用后分离效率的小幅下降。此外，7批样品的有限数据尚不能完全代表市场产品的整体牡荆素、异牡荆素水平，对不同含量水平背后工艺参数的关联分析是后续研究的重点，通过考察不同工艺参数（如浸提温度、时间、乙醇体积分数）对2种活性成分浸出率的影响，为生产实践提供直接指导。
总之，该方法简便易行，专属性、灵敏度、准确度和重复性高，具有较好的适用性，可为绿豆露酒的质量控制和品质评价提供参考依据。后续研究可考虑将此方法拓展至绿豆皮、绿豆芽等制品的检测；在方法条件优化的基础上，可引入质谱检测器以进一步提高定性的准确性和灵敏度。
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