酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为将糖转化为乙醇的核心微生物，对葡萄酒的质量和风格塑造发挥着重要作用[1-2]。然而，由于近年来进口商业活性干酵母的广泛使用，国产葡萄酒的同质化现象日益严重。研究表明，本土酿酒酵母具有改善酒体香气和保留酒体本土风味的潜能，从而赋予葡萄酒产区特色和典型性[3-6]。然而，新鲜野生酵母在遗传稳定性、使用便捷性和成本等方面均不利于葡萄酒的规模化酿造，优化高密度培养条件可有效提高菌株的遗传稳定性、降低生产成本和能耗，是本土酿酒酵母工业化利用的前提和基础，对实现进口酵母替代和提升我国葡萄酒的国际竞争力具有重要意义。
高密度培养是一种提高培养液中菌体密度以获得大量活性菌体的培养技术[7]，微生物对营养物质的需求因物种而异[8]。酵母菌的高密度培养受诸多因素影响，其中培养基的营养成分最为关键[9-10]，包括碳源、氮源、无机盐及生长因子，培养条件次之[11]。苏昊等[12]以糖蜜为基础培养基，采用均匀试验设计优化培养基，使酵母菌浓度提高1个数量级，产出成本降低84.25%。王亮等[13]研究发现，YPD培养基是马克斯克鲁维酵母的最佳基础培养基，响应面试验结果表明玉米浆是其最佳氮源，KH2PO4、MnSO4对酵母菌的生长具有显著促进作用。Zhao Hua等[14]通过响应面试验优化，以麦芽糖、玉米浸泡液为培养基，凝乳酶芽孢杆菌所产酶活性提高45.13%。研究发现，部分酵母在28～30 ℃、180 r/min时处于最佳生长状态[9,13]。因此，培养基成分与培养条件对微生物的生长情况具有重要影响。
酿酒酵母FMS筛选自怀来产区葡萄园，Ge Xiaoxin等[15-16]研究发现，菌株FMS具有较好的乙醇耐受性，由FMS酿造的赤霞珠干红葡萄酒醇类、酯类物质含量更高，其可增强葡萄酒的浓郁风味。Wang Xiaodi等[17]将菌株FMS应用于龙眼干白葡萄酒酿造，发现菌株FMS可更快启动乙醇发酵，且其发酵葡萄酒醇类、酯类等挥发性化合物含量显著高于商业酵母处理组。本研究以酿酒酵母FMS为研究对象，通过单因素试验结合正交试验对其培养基组分、培养条件及补料方式进行优化，旨在建立酿酒酵母的高密度培养体系，为制备用于葡萄酒酿造的高活性国产发酵剂提供依据和参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本土酿酒酵母FMS：怀来产区葡萄园中自主筛选获得，保藏号为CGMCC No.25347。
葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆、牛肉浸粉、胰蛋白胨 上海源叶生物科技有限公司；KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCO3、NaCl 国药集团化学试剂有限公司；VB1、VB6、VC、甘氨酸、琼脂粉 北京索莱宝科技有限公司；甘蔗糖蜜 市售。
YPD培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L；YPD固体培养基：YPD液体培养基中加入20 g/L琼脂粉；碳源补充剂：果糖550 g/L；碳氮补充剂：果糖550 g/L、玉米浆150 g/L。
1.2 仪器与设备
DSX-30L-I手提式高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD-Ⅱ洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；SPX恒温培养箱 宁波东南仪器有限公司；ZQTY-70ES恒温振荡摇床 上海知楚仪器有限公司；CP24电子分析天平 奥斯豪仪器（上海）有限公司；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；BA210生物显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株活化及生长曲线测定
将菌株FMS接入YPD培养基活化1～2次并进行稀释涂布，于28 ℃、180 r/min培养48 h。挑取单菌落接入20 mL液体YPD培养基中，28 ℃、180 r/min培养24 h后得到种子液。将活化得到的种子液以4%（V/V）接种量接至装有100 mL YPD培养基的250 mL锥形瓶中，28 ℃、180 r/min培养24 h，期间每隔2 h测定活菌数。
1.3.2 高密度培养基组分优化单因素试验
依次对培养基中碳源、氮源、无机盐、生长因子4种营养组分进行优化。碳源优化中，分别以50～130 g/L蔗糖、麦芽糖、果糖、糖蜜及10～90 g/L葡萄糖作为单一碳源，接种4%（V/V）种子液，40%（V/V）装液量，28 ℃、180 r/min培养10 h后测定活菌数。在碳源优化基础上，进一步筛选氮源种类（蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆、牛肉浸粉、胰蛋白胨）及其添加量（20～60 g/L）。在优选碳源和氮源基础上，分别评估4种无机盐（KH2PO4（0.1～0.5 g/L）、MgSO4（0.5～2.5 g/L）、CaCO3（0.1～0.5 g/L）、MnSO4（0.01～0.09 g/L））和 4种生长因子（VB1、VB6、VC、甘氨酸）及其添加量（0.01～0.08 g/L）对活菌数的影响。每一步优化均以上一阶段优化结果作为对照，碳源优化以YPD培养基作为对照。
1.3.3 高密度培养基组分优化正交试验
在单因素试验结果基础上，以果糖添加量（A）、玉米浆添加量（B）、MnSO4添加量（C）为因素，活菌数为响应值，设计L9(34)正交试验，因素及水平见表1。
表1 高密度发酵培养基优化正交试验因素与水平
Table1 Factors and levels of orthogonal array design for high‑density fermentation medium
水平A果糖添加量/（g/L）B玉米浆添加量/（g/L）C MnSO4添加量/（g/L）1100250.022110300.033120350.04
1.3.4 高密度培养条件优化单因素试验
以正交试验优化得到的最优培养基配方为基础进行培养条件的优化。依次考察不同培养温度（24、26、28、30、32 ℃）、摇床转速（140、160、180、200、220 r/min）、接种量（1%、2%、4%、6%、8%）、装液量（20%、30%、40%、50%、60%）对活菌数的影响，明确最佳培养条件。
1.3.5 酿酒酵母FMS的高密度培养微观形态学观察
以优化后的培养基与培养条件培养为实验组（HCDC），优化前模式培养为对照组（CK），分别培养10 h后，取适量均匀的培养液，分别使用光学显微镜 10倍和40倍物镜进行形态学观察并记录。
1.3.6 补料策略选择
每2 h测定培养液中还原糖含量以监测酿酒酵母FMS高密度培养过程中的耗糖情况。培养10 h后进行残糖反馈补料，分别采用仅补加碳源和补加碳、氮源（11∶3）2种补料策略：1）仅补加碳源：向培养液中补加碳源至还原糖含量达到初始水平；2）碳、氮源同时补加：向培养液中补加碳、氮源至还原糖含量达到初始水平；以未进行补料为对照，考察不同补料策略对菌株FMS生长的影响。
1.3.7 活菌数与还原糖含量测定
参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中稀释涂布平板法进行菌落计数；采用二硝基水杨酸法[18]测定还原糖含量。
1.4 数据处理
数据均为3次平行实验的平均值，结果以x±s形式表示；分别采用Excel 2021和SPSS Statistics 27进行方差分析、单因素方差分析和正交试验设计，P＜0.05表示具有显著性差异；采用Origin 2024进行绘图。
2 结果与分析
2.1 酿酒酵母FMS的生长曲线
由图1可知，FMS在培养2 h后迅速生长繁殖，进入对数生长期，培养10 h时菌株活力达到旺盛期，活菌数达到（8.27±0.01）（lg（CFU/mL）），之后菌株增殖速率逐渐放缓，进入稳定期。该生长规律与韦梦婷等[19]对酿酒酵母FM-S-115的生长特性研究结果基本一致。菌株FMS较短的对数生长期在工业化生产及应用中更具优势。
图1 酿酒酵母菌FMS生长曲线
Fig.1 Growth curve of S. cerevisiae FMS
2.2 酿酒酵母FMS的高密度培养基优化单因素试验结果
2.2.1 碳源对酿酒酵母FMS生长的影响
碳源是酵母菌能量代谢与细胞合成的物质基础，其供给水平直接影响菌体生长速率与生物量积累，是调控发酵过程中菌体增殖的关键因素[8,20]。由图2可知，分别以果糖、糖蜜、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖5种糖类作为FMS菌株单一碳源，活菌数均随碳源添加量增加呈现先上升后下降或趋于稳定的趋势，果糖、糖蜜、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖的最佳质量浓度分别为110、110、70、90、70 g/L。其中，以110 g/L果糖作为碳源时，FMS菌株的活菌数达到（9.48±0.03）（lg（CFU/mL）），显著高于其他碳源处理组（P＜0.05），较对照组提高15.22倍。与杨瑞冬等[21]的研究结果一致。果糖作为己酮糖，可通过特异性转运蛋白和己糖激酶直接进入糖酵解途径，无需水解，从而能更有效提高碳源利用效率和能量生成速率。基于其在促进菌体增殖方面的显著效果及代谢高效性，本研究选用110 g/L果糖进行后续正交试验。
图2 碳源种类及添加量对酿酒酵母FMS活菌数的影响
Fig.2 Effects of carbon-source types and addition on viable cell count of S. cerevisiae FMS
2.2.2 氮源对酿酒酵母FMS生长的影响
氮源是酵母合成蛋白质、核酸等生物大分子的基础，对其生长代谢至关重要。研究表明，有机氮源因富含氨基酸、小肽和生长因子，对微生物增殖的促进效果通常优于无机氮源[22]。由图3可知，对照组菌株生长优于蛋白胨、胰蛋白胨和酵母浸粉组，可能与后者营养成分不够全面有关[23-24]。在供试氮源中，玉米浆与牛肉浸粉均能显著促进菌株FMS生长，其中30 g/L玉米浆效果最佳，活菌数达（10.36±0.01）（lg（CFU/mL））。玉米浆富含氨基酸、短肽、B族维生素和矿物质，能有效支持能量代谢、碳氮平衡及渗透压调节，其氨基酸组成与酿酒酵母需求匹配度较高，有利于氮的高效利用并减少代谢废物积累[25]。该结果与刘开放等[26]的研究结果一致。作为来源广泛、成本低廉的工业副产物，玉米浆在规模化酵母培养中具有良好的应用前景。
图3 氮源种类及添加量对酿酒酵母FMS活菌数的影响
Fig.3 Effects of nitrogen-source types and addition on viable cell count of S. cerevisiae FMS
2.2.3 无机盐对酿酒酵母FMS生长的影响
无机盐在维持酵母细胞渗透压平衡、增强酶活性及调控代谢途径方面发挥着关键作用，是保障细胞结构与功能稳定性的重要因子[20]。由图4可知，随着KH2PO4与MgSO4添加量增加，活菌数呈先增加后下降的趋势，但KH2PO4处理组的活菌数均显著低于对照组（P＜0.05）。研究表明，金属离子可干扰菌体细胞内外的渗透压稳态及酸碱平衡，或与培养基组分发生相互作用，从而形成不利于其生长的化学微环境，进而造成细胞内部稳态失衡[9]。周宁萍等[27]研究发现，植物乳植杆菌NCU001929在高密度培养过程中，活菌数随MgSO4添加量的增加呈先上升后下降的非单调响应，且整体呈现抑制菌体生长的趋势，这与MgSO4对菌株FMS生长趋势的影响一致。
图4 无机盐种类及添加量对酿酒酵母FMS活菌数的影响
Fig.4 Effects of inorganic-salt types and addition on viable cell count of S. cerevisiae FMS
CaCO3与MnSO4对菌株FMS的生长均呈现显著促进作用，以0.03 g/L MnSO4作为生长因子时，菌株FMS活菌数提高至（11.30±0.02）（lg（CFU/mL））。Mn2+作为多种关键酶（如脱氢酶和超氧化物歧化酶）的辅因子或激活剂，广泛参与能量代谢、抗氧化及核酸合成等过程，从而有效促进酵母增殖[27-28]。方诗会等[29]发现适量增加MRS培养基中MnSO4的添加量可增强副干酪乳杆菌的生长性能，与本研究结果一致。这不仅证实了微量金属离子在高密度发酵中的关键作用，也为今后系统优化酵母培养基提供了理论依据与实验基础。Mn2+的高效利用及其在代谢网络中的功能有待进一步深入研究。
2.2.4 生长因子对酿酒酵母FMS生长的影响
生长因子是一类微生物自身无法合成、需外源补充以调控细胞代谢的微量有机物，主要包括维生素、氨基酸等[9,30]。由图5可知，3种维生素对菌株FMS均未表现出显著的促生长作用，与徐小芳[31]对副干酪乳杆菌的研究结论基本一致。潘冬梅等[32]研究表明，VB6对酿酒酵母菌体干质量的增加无明显作用。VB1、VC等维生素甚至会抑制植物乳植杆菌NCU137生长，且部分微量元素的添加量不一定与菌株生物量呈现线性关系[30,33]。甘氨酸虽对菌体增殖有一定促进作用，但活菌数较对照组仅提高1.33%。段学辉等[34]研究发现甘氨酸可使酿酒酵母4-S生物量增加86.56%，与本研究存在较大差异，这可能与菌株特性、培养基组成及培养条件不同有关。菌株FMS未表现出对微量元素补充的显著需求，可能是由于碳氮源基质中含有的内源性微量元素已满足其生长需求，与 张馨文等[9]关于葡萄汁有孢汉逊酵母BF-345高密度培养无需额外添加生长因子的结论一致。综上，外源添加生长因子并非实现FMS高密度生长的必要条件。
图5 生长因子种类及添加量对酿酒酵母FMS活菌数的影响
Fig.5 Effects of growth-factor types and addition on viable cell count of S. cerevisiae FMS
2.3 酿酒酵母FMS的高密度培养基正交试验结果
由表2可知，各因素对菌体生长的影响程度依次为玉米浆添加量＞果糖添加量＞MnSO4添加量，反映出玉米浆供应在本研究体系中为最关键因素。通过分析各水平K值，确定高密度培养基的最优组合为110 g/L果糖、30 g/L玉米浆及0.03 g/L MnSO4，在此条件下活菌数为（11.30±0.02）（lg（CFU/mL）），较YPD培养基（（8.27±0.01）（lg（CFU/mL）））提高3个数量级。李东歌[35]通过响应面试验优化酿酒酵母培养基，生物量较YPD培养提高65.8%，活菌数达2.85×109 CFU/mL。 苏昊等[12]以糖蜜为基础培养基，通过优化实现酿酒酵母 高密度培养，活菌数提高1个数量级，达到1.0×1010 CFU/g，且生产成本降低84.25%。与已有研究相比，本研究显著优于多数文献报道的倍增水平。这可能是由于本研究对酿酒酵母FMS高密度培养基的优化更加系统与全面。综上，本研究通过关键因子的主次识别与配比优化极大地提升了菌株FMS的生物量。
表2 酿酒酵母FMS高密度培养基组成优化正交试验结果
Table2 Results of orthogonal array design for the optimization of high-density medium composition for S. cerevisiae FMS
试验号ABCD（空白）活菌数（lg（CFU/mL））1111110.972122211.143133310.994212311.105223111.206231211.107313210.978321311.109332111.05K133.0933.0433.1733.22K233.4133.4533.3033.21K333.1233.1433.1533.19k111.0311.0111.0611.07k211.1411.1511.1011.07k311.0411.0511.0511.06R0.100.140.050.01因素顺序B＞A＞C最优组合A2B2C2
由表3可知，果糖、玉米浆对酿酒酵母FMS生长情况影响极显著（P＜0.01），MnSO4对酿酒酵母FMS生长情况影响显著（P＜0.05）。
表3 正交试验方差分析
Table3 Analysis of variance for orthogonal array design
方差来源平方和自由度均方FP显著性A0.01920.009120.5710.008**B0.02920.014185.7140.005**C0.00320.00222.4290.043*误差020总计1 148.3639
注：*.影响显著（P＜0.05）；**.影响极显著（P＜0.01）。
2.4 酿酒酵母FMS的高密度培养条件优化结果
由图6可知，摇床转速、培养温度、接种量与装液量均显著影响菌体生长。摇床转速为200 r/min时，活菌数达到最大值，为（11.49±0.05）（lg（CFU/mL）），该转速既可保证体系维持适宜溶氧水平，又能有效降低流体剪切力对细胞的损伤[36]，较180 r/min培养活菌数提升0.19（lg（CFU/mL））；培养温度28 ℃（活菌数（11.49±0.05）（lg（CFU/mL）））处于酿酒酵母的最适代谢区间，有利于酶活性发挥及菌体稳态维持[37]；接种量4%（活菌数（11.49±0.05）（lg（CFU/mL）））可有效平衡生长延滞期与对数生长期时长，避免因初始菌体密度过高导致的营养竞争与代谢压力[24,38]；装液量40%（活菌数（11.49±0.05）（lg（CFU/mL）））协同摇床转速200 r/min确保氧气供需平衡[38-40]，使FMS菌株在该培养体系中达到最佳生长水平。
图6 培养条件对FMS活菌数的影响
Fig.6 Effects of culture conditions on viable cell count of S. cerevisiae FMS
2.5 酿酒酵母FMS的高密度培养微观形态
显微形态分析为评估培养优化效果提供直接的细胞学证据。由图7可知，经高密度培养菌体细胞密度明显增加，与活菌数提升3个数量级的定量结果高度吻合，共同证实优化策略的有效性，为产业化发酵中获得高活力种子液奠定了坚实基础。
图7 酿酒酵母FMS高密度培养微观形态图
Fig.7 Micrograph of S. cerevisiae FMS under high-density culture
2.6 酿酒酵母FMS的补料策略优化
酿酒酵母FMS的生长代谢与还原糖消耗呈现典型的正相关性。由图8A可知，在培养4～10 h内菌体快速增殖，伴随还原糖含量急剧下降；培养10 h后因碳源匮乏，生长进入稳定期。该结果印证了碳源是高密度培养的关键限制因素，其充足供给是氮源及其他营养物质高效利用的前提[31,41]。
图8 优化培养基及培养条件下酿酒酵母FMS的耗糖与生长曲线（A）及补料策略优化（B）
Fig.8 Sugar-consumption and growth curves (A) and fed-batch strategy optimization (B) of S. cerevisiae FMS under optimized medium and culture conditions
为进一步提高高密度培养效果，在培养10 h后尝试以反馈补料方式分别添加碳源及碳、氮源（11∶3），以维持初始糖含量。然而，由图8B可知，补料操作并未显著提升最终活菌数。这与相关研究中补料培养可进一步提高生物量的结论[34,42]存在差异。这可能是由于菌株FMS难以有效突破该体系固有的生理与物理限制。一方面，溶解氧传递受限及代谢副产物积累成为菌体生长瓶颈[43]；另一方面，补料培养前FMS菌体密度已经得到显著提升，可能由于菌株固有的生理限制，活菌数不再增加。补料培养对本菌株的增益有限，从实用经济角度出发，优先考虑非补料方式培养。
3 结 论
本研究对本土酿酒酵母FMS（CGMCC No.25347）高密度培养基与培养条件进行系统优化。通过单因素试验和正交试验确定高密度培养基组成为110 g/L果糖、30 g/L 玉米浆、0.03 g/L MnSO4；通过单因素试验确定FMS的最佳培养条件为培养温度28 ℃、摇床转速200 r/min、 装液量40%（V/V）、接种量4%；适宜采用非补料的普通摇瓶培养方式。菌株FMS在上述条件下培养至对数期的活菌数最高可达到11.49（lg（CFU/mL）），相较于初始YPD培养基培养的8.27（lg（CFU/mL））提高3个数量级，可为本土酵母商业发酵剂的制备奠定基础。
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