γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种天然存在的非蛋白质功能性氨基酸，参与人体中多种代谢活动，GABA具有降低血压、治疗癫痫、改善脑细胞、增强记忆和促进睡眠等多种生理功能[1-3]。黄酒中除含有丰富氨基酸、无机盐、维生素、有机酸等营养成分外，还含功能性物质GABA[4-5]。据文献报道，古越龙山加饭酒中GABA质量浓度达167～360 mg/L[6]。
动植物体内，GABA来源包括GABA支路和多胺降解途径，其中GABA支路是主要途径[7]。谷氨酸脱羧酶是催化谷氨酸（glutamate，Glu）脱羧合成GABA反应中的限速酶，受Ca2+/钙调蛋白调节，当植物处于胁迫环境（冷、热、干旱等）时，H+或Ca2+的累积上调钙调蛋白水平，进而激活谷氨酸脱羧酶并催化Glu转化为GABA[8]。因此，探究黄酒中Glu和GABA含量对解析黄酒中代谢GABA微生物及酿酒发酵过程中Glu和GABA动态变化具有一定的指导意义。
目前，针对Glu和GABA的检测方法主要包括分光光度法[9]、离子色谱-积分脉冲安培法[10-11]、氨基酸分析仪法[12-13]、高效液相色谱法[14-17]。其中，分光光度法灵敏度不高，且需衍生，操作繁琐；离子色谱-积分脉冲安培法需要配备专门的电化学检测器，且存在灵敏度不高的问题；氨基酸分析仪法仪器专属性强，需购买专门的氨基酸分析仪，且前处理复杂，操作繁琐；高效液相色谱法需要衍生，操作繁琐。近年来，越来越多的研究人员采用采用液相色谱-串联质谱法检测果蝇体[18]、南瓜[19]、芦笋保健品[20]、茶叶[21-22]等中的GABA，这些文献大多聚焦单一种类GABA检测，以外标法定量，存在检测步骤繁琐、定量不准确的问题。刘镇等[23]采用内标法定量检测黄酒中的GABA，该方法仅可单独测定GABA。鉴于GABA由Glu转化生成，亟需建立一种可同步检测GABA和Glu的高灵敏度分析方法。
基于此，本研究采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法，以氘代同位素GABA-D6和Glu-D3为内标，建立黄酒中GABA和Glu的快速、同步检测方法，并将此方法应用于不同类型黄酒中GABA和Glu的检测，以期为评价黄酒中GABA和Glu的含量与转化关系提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黄酒样品（花雕酒、清纯三年、手工冬酿、加饭酒） 市售。
乙腈（色谱纯） 德国默克公司；乙酸铵（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；Glu标准品（纯度99.7%）、GABA标准品（纯度99.7%）上海安谱实验科技股份有限公司；Glu-D3标准品（纯度99.7%）、GABA-D6标准品（纯度99.0%） 北京振翔科技有限公司；实验用水（超纯水）由Milli-Q纯水系统制备。
1.2 仪器与设备
1290-6460 UPLC-MS/MS仪（配有电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）源） 美国安捷伦公司；Mili-Q IQ 7015超纯水机 美国密理博公司；JA5300电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Sorvall ST 16R离心机 美国赛默飞公司；UC-23超声仪 浙江浙科仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 GABA和Glu标准溶液配制
GABA和Glu标准溶液（1.00 mg/mL）：准确称量按纯度折算为100%质量的GABA和Glu标准物质各0.10 g（精确到0.000 1 g），加水稀释并定容至100.0 mL。
混合标准中间液（100 mg/L）：吸取1.00 mg/mL GABA和Glu标椎溶液1.0 mL，加水稀释并定容至10.0 mL。
内标溶液（1.00 mg/mL）：准确称量按纯度折算为100%质量的GABA-D6和Glu-D3标准物质各0.10 g（精确到0.000 1 g），加水稀释并定容至100.0 mL。
混合内标工作液（10.0 μg/mL）：吸取1.00 mg/mL内标溶液1.0 mL，加水稀释并定容至100 mL。
1.3.2 样品前处理
准确吸取1.00 mL黄酒样品并准确称量（精确至0.001 g），加入混合内标工作液1.00 mL，加入10 mmol/L乙酸铵溶液，混合均匀，并定容至100 mL。取5.0 mL稀释液，涡旋2 min混匀，10 000 r/min离心5 min，经0.22 μm滤膜过滤后上机测定。
1.3.3 仪器条件
UPLC条件：色谱柱：Thermo Acclaim Trinity P1（100 mm×2.1 mm，3 μm）；流动相：10 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）＝3∶7（V/V）。流动相流速0.30 mL/min；进样量10 μL；色谱柱柱温30 ℃。
MS条件：ESI源；正离子扫描；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式；干燥器温度350 ℃；干燥器流速11 L/min；雾化器压力45 kPa；鞘气温度450 ℃；鞘气流速12 L/min；毛细管电压3.5 kV。GABA和Glu及其内标的MRM参数见表1。
表1 GABA和Glu及其对应内标MRM参数
Table1 Multiple reaction monitoring parameters of GABA, Glu and their corresponding isotope internal standards
目标化合物母离子（m/z）子离子（m/z）碰撞电压碰撞能量/eV驻留时间/ms GABA104.187.1、69.1704/13100 Glu172.284.1、130.17019/5100 GABA-D6110.173.2、93.25013/7100 Glu-D3151.187.2、133.25015/5100
1.3.4 基质效应
黄酒样品中天然含有GABA和Glu，难以获得基质空白样品。稳定同位素内标GABA-D6、Glu-D3与目标物GABA和Glu基质效应完全一致，因此本研究通过评估黄酒中GABA-D6、Glu-D3基质效应，间接表征黄酒体系中GABA、Glu的基质效应。纯溶剂标准曲线溶液：准确移取适量混合内标工作液，用初始流动相稀释为10、20、50、100、200 ng/mL混合标准系列溶液。基质匹配标准曲线溶液：取适量黄酒，按合适的样品前处理方法处理，获得黄酒基质溶液，加入适量混合内标工作液，配制成5、10、20、50、100、200 ng/mL基质匹配混合标准溶液。以基质匹配标准曲线斜率与纯溶剂标准曲线斜率比值评估基质效应[24-26]。
1.3.5 方法学考察
1.3.5.1 标准曲线、检出限与定量限测定
吸取适量GABA和Glu混合标准中间液，用初始流动相配制1、5、10、20、50、100 ng/mL混合标准系列溶液，加入10 μL混合内标工作液，按照最佳色质谱条件进行测定，分别以GABA和Glu质量浓度为横坐标（x）、GABA和Glu与对应内标响应值比值为纵坐标（y），绘制标准曲线，建立标准曲线回归方程。
取1.0 mL黄酒样品，加入5.0 μg/L内标溶液，按前述样品前处理，经分离检测后，以3倍和10倍信噪比分别计算GABA和Glu的检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantity，LOQ）。
1.3.5.2 加标回收率实验
选择一份GABA和Glu含量较低的黄酒样品，分别加入相当于约0.5、1、2倍本底值的目标物。按照1.3.2节方法进行样品前处理，按照1.3.3节仪器条件重复测定6次。计算各加标水平的回收率与相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.3.5.3 精密度实验
取GABA和Glu混合标准溶液，按照1.3.3节仪器条件重复测定6次，计算测定值的RSD。
1.3.5.4 重复性实验
选取一份黄酒样品，按照1.3.2节方法进行样品前处理，按照1.3.3节仪器条件重复测定6次。计算测定值的RSD。
1.4 数据处理
采用Excel 2022进行数据处理，Origin 2024进行数据和图形处理。
2 结果与分析
2.1 色谱条件优化
2.1.1 色谱柱的选择
GABA和Glu均为氨基酸类化合物，极性较强，根据前期报道[17,21]，重点考察ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）及Thermo Acclaim Trinity P1柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）对目标物的分离效果。由图1可知，GABA在ACQUITY UPLC BEH C18柱上较难保留，出峰时间在1 min之内，在实际样品检测过程中可能存在干扰较大问题。Glu在ACQUITY UPLC BEH HILIC柱上峰形较差，可能是因为Glu极性偏弱，在ACQUITY UPLC BEH HILIC柱上分离效率不高。Acclaim Trinity P1柱为混合模式色谱柱，其填料硅胶球孔内同时具有反相和阴离子交换特性，GABA和Glu在该色谱柱上均可实现良好保留，且色谱峰峰形对称、尖锐。
图1 不同色谱柱对GABA和Glu分离效果色谱图
Fig.1 Chromatograms showing separation performance of GABA and Glu on different chromatographic columns
2.1.2 流动相的选择
GABA和Glu均含羧基，呈酸性。为探究流动相酸度对GABA和Glu色谱分离效果的影响，首先向流动相乙腈-10 mmol/L乙酸铵（3∶7，V/V）中加入乙酸，观察含不同体积分数乙酸的流动相对目标物的分离效果。由图2A可知，随着乙酸加入量的增加，Glu出峰时间提前，峰形也有所改善，但是峰宽还是偏宽。其次向流动相中加入甲酸，观察含不同体积分数甲酸的流动相对目标物的分离效果。由图2B可知，当流动相含0.1%甲酸时，2种目标化合物可实现良好分离，峰形也较好。
图2 不同流动相下GABA和Glu分离效果色谱图
Fig.2 Chromatograms showing separation performance of GABA and Glu under different mobile phase systems
2.2 质谱条件优化
Glu为酸性氨基酸，GABA为非蛋白氨基酸，二者分子结构均含有氨基，易发生质子化。在酸性流动相体系中，GABA、Glu及其对应的氘代同位素内标均可结合一个质子，生成母离子[M+H]+，对应的质荷比分别为m/z 104.1、 110.1、149.1、151.1。在MRM模式下优化各母离子的碰撞电压；使用子离子扫描模式，在上述母离子及MS参数下扫描，筛选出响应强度高、稳定性好的2个子离子，同步优化各子离子的碰撞能量，确定最佳MS参数。
2.3 基质效应评价
在采用UPLC-MS/MS测定目标物时，基质效应会影响测定结果的准确度和精密度，当基质效应较大时，需采用内标法或基质匹配标准曲线消除基质影响，选取4种不同类别的黄酒，按照以下3种前处理方法进行处理：1）准确吸取1.00 mL黄酒样品并准确称量（精确至0.001 g），加入10 mmol/L乙酸铵溶液，混合均匀，定容至100 mL；2）准确吸取3.00 mL黄酒样品，加入3.00 mg C18吸附剂粉末，净化后，取1.00 mL黄酒样品并准确称量（精确至0.001 g），加入10 mmol/L乙酸铵溶液，混合均匀，定容至100 mL；3）准确吸取3.00 mL黄酒样品，加入3.00 mg N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）固相吸附剂粉末，净化后，取1.00 mL黄酒样品并准确称量（精确至0.001 g），加入10 mmol/L乙酸铵溶液，混合均匀，定容至100 mL。由图3可见，4种黄酒基质对GABA和Glu均表现出明显的基质效应，且Glu受基质干扰程度远高于GABA，这可能源于GABA和Glu在色谱体系中的洗脱行为不同：Glu保留时间更长，洗脱时段会伴随黄酒中大量酸性共流出杂质，进而产生更强的离子抑制作用。采用C18吸附剂粉末净化后，GABA、Glu所受基质效应并未出现明显改善，而经PSA固相吸附剂粉末净化后，GABA、Glu所受基质效应大幅减弱，这可能与PSA能够有效吸附黄酒基质中的酸性物质和色素有关，从而减少共流出干扰物对质谱响应的抑制有关。
图3 不同样品前处理方法对GABA（A）和Glu（B）基质效应的影响
Fig.3 Effects of different sample pretreatment methods on matrix effects of GABA (A) and Glu (B)
2.4 样品前处理方法确定
UPLC-MS/MS具有灵敏度高、选择性强等优势，黄酒中氨基酸类物质本底浓度较高[1]，理论上可采用大体积直接稀释法稀释样品后直接进样分析。由基质效应结果可知，经C18吸附剂粉末净化处理，GABA与Glu基质效应无明显缓解；采用PSA固相吸附剂粉末净化虽可大幅降低基质干扰，但PSA填料会与体系内酸性目标物结合，可能造成GABA、Glu检测结果偏低，带来定量偏差。综合考虑，本研究最终确定直接稀释法作为样品前处理方式，通过稳定同位素内标校正策略消除基质效应对定量结果的干扰。
2.5 实际样品的MRM色谱图
采用优化后的色谱条件对黄酒样品进行分析，待测目标物GABA和Glu的MRM色谱图见图4。黄酒样品中GABA和Glu峰形良好，目标物出峰时间附近无干扰物，保留时间适中。
图4 黄酒样品中GABA（A）和Glu（B）的MRM色谱图
Fig.4 Multiple reaction monitoring chromatograms of GABA (A) and Glu (B) in Huangjiu samples
2.6 方法学性能评价
2.6.1 线性关系与灵敏度
由表2可知，GABA和Glu分别在1～500 μg/L和10～5 000 μg/L范围内呈良好的线性关系，决定系数（R2）均为0.999 9。GABA和Glu LOD分别为0.15、0.50 mg/L，LOQ分别为0.45、1.50 mg/L。
表2 GABA和Glu的线性方程、决定系数、LODs和LOQs
Table2 Linear equations, determination coefficients, LODs and limits of quantification of GABA and Glu
化合物线性范围/（μg/L）线性回归方程R2LOD/（mg/L）LOQ/（mg/L）GABA1～500y＝2.232x+0.016 90.999 90.150.45 Glu10～5 000y＝1.072x+0.023 70.999 90.501.50
2.6.2 准确度
由表3可知，GABA和Glu在黄酒中的平均加标回收率为88.6%～103.0%（n＝6），RSD为2.23%～5.63%，说明该方法准确度和精密度良好，均满足检测分析要求。
表3 黄酒样品中GABA和Glu加标回收率与RSD
Table3 Spiked recoveries and relative standard deviations of GABA and Glu in Huangjiu samples
化合物本底值/（mg/L）加标量/（mg/L）测定值/（mg/L）平均加标回收率/%RSD/%7.405.0011.55～12.2388.65.63 GABA7.4010.0017.24～18.31103.04.257.4020.0025.8～27.3193.52.2335.7020.0055.02～56.34102.13.45 Glu35.7040.0072.91～75.4296.52.6735.7080.00113.32～115.6398.64.62
2.6.3 精密度
由表4可知，混合标准溶液中GABA和Glu的RSD分别为0.87%、0.89%，RSD较小，表明仪器性能稳定，精密度良好。
表4 GABA和Glu精密度实验结果
Table4 Precision test results of GABA and Glu
化合物质量浓度/（mg/L）平均值/（mg/L）RSD/%GABA10.311.110.510.711.210.310.70.87 Glu99.81031061081091111060.89123456
2.6.4 重复性
由表5可知，样本中GABA和Glu的RSD分别为8.94%、7.86%，表明样本中目标物受干扰较小，表明方法重复性良好。
表5 GABA和Glu重复性实验结果
Table5 Repeatability test results of GABA and Glu
化合物质量浓度/（mg/L）平均值/（mg/L）RSD/%123456 GABA32.1329.3431.2430.5433.6537.5132.408.94 Glu237.9213.4223.4266.3248.4244.6237.97.86
2.7 实际样品检测
选取25份黄酒，其中绍兴黄酒15份，其他地方黄酒10份，按照上述方法检测黄酒中的GABA和Glu。由表6 可知，GABA质量浓度在5.32～53.62 mg/L之间，Glu质量浓度在35.71～320.71 mg/L之间，不同类型黄酒中的GABA和Glu存在明显差异，这可能与黄酒生产工艺有关。其中，3号黄酒为粟米黄酒，GABA质量浓度为7.40 mg/L，Glu质量浓度为35.71 mg/L，二者含量均偏低，可能与其原料粟米自身氨基酸本底水平有关。另外，不同品牌黄酒中GABA和Glu含量无明显差异。
表6 黄酒中GABA和Glu的实际测定结果
Table6 Actual determination contents of GABA and Glu in Huangjiu samples
样品序号GABA质量浓度/（mg/L）Glu质量浓度/（mg/L）1号9.71184.322号19.72271.824号22.81154.636号23.32122.117号14.82213.9211号39.43224.2219号17.81209.2220号14.1477.7221号21.81252.9123号20.91117.623号7.4035.715号10.41103.628号37.91239.639号13.34157.6110号53.6249.6512号29.25157.6113号31.21240.7214号24.42267.2515号32.13237.9116号34.91237.5217号36.43201.7118号35.91284.8122号31.91320.7124号5.3247.2125号41.91258.12
3 结 论
本研究基于同位素内标-超高效液相色谱-串联质谱法建立了黄酒中GABA和Glu的同时检测方法，采用Acclaim Trinity P1色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），采用ESI正离子MRM模式进行检测，以稳定同位素内标法定量。GABA和Glu在线性范围内决定系数均为0.999 9，LOD分别为0.15、0.50 mg/L。综上，本方法前处理过程操作简单、耗时短、有机溶剂用量少、成本低，兼具良好的准确度与精密度，适用于各类黄酒中GABA和Glu的同时、快速分析。
[1] 龚金炎, 单之初, 潘兴祥, 等. 传统手工黄酒发酵过程中常见游离氨基酸和γ-氨基丁酸的变化研究[J]. 中国食品学报, 2017, 17(5): 232-238. DOI:10.16429/j.1009-7848.2017.05.030.
[2] 李玲, 杨玲, 路江浩, 等. 产γ-氨基丁酸的复合益生菌制品对睡眠的改善作用[J]. 中国微生态学杂志, 2022, 34(9): 1006-1012.DOI:10.13381/j.cnki.cjm.202209003.
[3] Oh S J, Kim H S, Lim S T, et al. Enhanced accumulation of gammaaminobutyric acid in rice bran using anaerobic incubation with various additives[J]. Food Chemistry, 2019, 271: 187-192. DOI:10.1016/j.foodchem.2018.07.175.
[4] 谢广发, 张波, 王兰, 等. 中国黄酒中功能因子研究进展[J]. 食品与发酵工业, 2024, 50(14): 364-370. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.037351.
[5] 周建弟, 赖敏辉, 应维茂, 等. 黄酒功能性成分与保健功能研究进展[J]. 酿酒, 2021, 48(5): 24-29. DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2021.05.008.
[6] 谢广发, 戴军, 赵光鳌, 等. 黄酒中的γ-氨基丁酸及其功能中国酿造[J]. 中国酿造, 2005, 24(3): 49-50. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2005.03.017.
[7] Bown A W, Shelp B J. Does the GABA shunt regulate cytosolic GABA?[J]. Trends in Plant Science, 2020, 25(5): 422-424. DOI:10.1016/j.tplants.2020.03.001.
[8] Podlešáková K, Ugena L, Spíchal L, et al. Phytohormones and polyamines regulate plant stress responses by altering GABA pathway[J]. New Biotechnology, 2019, 48: 53-65. DOI:10.1016/j.nbt.2018.07.003.
[9] 胡京枝, 董小海, 余大杰. 紫外分光光度法测定含乳饮料中游离氨基酸含量[J]. 中国食品添加剂, 2007, 18(6): 164-166; 64.DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2007.06.033.
[10] 于宏晓, 徐海涛, 马强, 等. 离子色谱-积分脉冲安培法测定烟草中18种游离氨基酸[J]. 中国烟草科学, 2012, 33(4): 51-54.
[11] 宋卫得, 杜利君, 高尧华, 等. 积分脉冲安培检测-离子色谱法同时测定果汁中20种氨基酸[J]. 中国食品添加剂, 2019, 30(8): 132-138.DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2019.08.016.
[12] Lu Mengqian, Han Jieyun, Zhu Biying, et al. Significantly increased amino acid accumulation in a novel albino branch of the tea plant (Camellia sinensis)[J]. Planta, 2019, 249(2): 363-376. DOI:10.1007/s00425-018-3007-6.
[13] 渠淑萍, 李宇, 刘金秀, 等. 氨基酸分析仪测定饲料中的含硫氨基酸[J]. 分析仪器, 2024(2): 38-41. DOI:10.3969/j.issn.1001-232x.2024.02.008.
[14] Duan Wen, Huang Yan, Xiao Junfei, et al. Determination of free amino acids, organic acids, and nucleotides in 29 elegant spices[J]. Food Science & Nutrition, 2020, 8(7): 3777-3792. DOI:10.1002/fsn3.1667.
[15] 汪建飞, 索绪斌, 张涵. 衍生化法测定γ-氨基丁酸的含量及稳定性研究[J]. 化学应用与研究, 2022, 34(4): 909-914. DOI:10.3969/j.issn.1004-1656.2022.04.028.
[16] 吴慧, 崔本来. 柱前衍生-高效液相色谱法检测运动型饮料中γ-氨基丁酸的含量[J]. 中国酿造, 2018, 37(11): 154-158. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2018.11.031.
[17] 谌珍, 刘青茹, 张晓伟, 等. 高效液相色谱法测定桑叶γ-氨基丁酸和谷氨酸[J]. 食品研究与开发, 2019, 40(3): 162-166. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2019.03.029.
[18] 孙博群, 张紫燕, 唐超, 等. 稳定同位素内标高效液相色谱串联质谱检测果蝇体内γ-氨基丁酸[J]. 军事医学, 2022, 46(7): 540-545.DOI:10.7644/j.issn.1674-9960.2022.07.011.
[19] 秦宇, 侯蓓蓓, 张斌骏, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定南瓜中γ-氨基丁酸的含量[J]. 食品安全质量检测学报, 2020, 11(2): 528-532.
[20] 刘晓茂, 杨志伟, 崔宗岩, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定芦笋保健食品中L-茶氨酸和γ-氨基丁酸[J]. 食品科技, 2018, 43(3):277-281.
[21] 屠钰, 李无双, 朗文成, 等. 串联质谱法实时直接测定茶叶中γ-氨基丁酸含量[J]. 分析化学, 2020, 48(9): 1252-1259. DOI:10.19756/j.issn.0253-3820.191665.
[22] Zhou Peng, Zhao Feng, Chen Mingjie, et al. Determination of 21 free amino acids in 5 types of tea by ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) using a modified 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) method[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2019, 81: 46-54. DOI:10.1016/j.jfca.2019.05.007.
[23] 刘镇, 马嘉俊, 胡建刚, 等. 同位素内标液相色谱-串联质谱法检测酒类产品中γ-氨基丁酸[J]. 中国酿造, 2023, 42(6): 239-244.DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2023.06.038.
[24] GB/T 27417—2017 合格评定 化学分析方法确认和验证指南[S].
[25] 高玉杰, 张立佳, 刘丽君, 等. UPLC-MS/MS测定生乳与豆制饮品中咪唑烟酸残留[J]. 中国酿造, 2023, 42(2): 235-239. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2023.02.039.
[26] Matuszewski B K, Constanzer M L, Chavez-Eng C M. Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS[J]. Analytical Chemistry, 2003, 75(13): 3019-3030. DOI:10.1021/ac020361s.