苦荞麦（Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.）属于蓼科植物，是我国重要的粮食经济作物，含有淀粉、蛋白质、膳食纤维及多种微量元素，且富含类黄酮、酚酸、醌类等多酚物质[1]。与青稞、燕麦、甜荞麦等谷物相比，苦荞麦多酚含量高，这也是其有苦味的原因[2-3]。苦荞中大量多酚与膳食纤维、淀粉、蛋白质相结合形成结合态多酚，是苦荞中多酚稳定存在的主要形式[4-5]。苦荞在我国饮食文化中占有重要地位，由于其较高的淀粉含量，常加工为脆片、面条、饼干等制品[6-8]，或通过发酵生产面包、酒、醋、酱制品[9-11]。不同加工方式对苦荞麦产生不同影响，吕佳音[12]研究微波预糊化后挤压膨化对苦荞粉营养成分和理化性质的影响，结果表明该处理可提升苦荞粉粒径大小、吸水性指数、水溶性指数和持水力，更利于面团成形；Wang Junrong等[13]采用蒸汽处理荞麦粉，其淀粉糊化程度随着水分含量增加而增加，通过改变面团的结构显著降低荞麦面条中淀粉的消化率；Biduski等[14]以荞麦粉部分替代小麦粉制作面包，分析面团流变特性与面包内部组织结构，结果显示面团流变行为及面包加工品质无显著波动，且可提升膳食纤维与总必需氨基酸含量，优化产品营养特性；Altıkardeş等[15]采用苦荞发芽处理有效降低抗营养因子含量并提升其抗氧化活性。
纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis var. natto）因其良好的益生性能和能分泌多种高效酶系而广泛用于食品研究与开发[16-18]。Leñini等[19]研究证实，纳豆芽孢杆菌对机体胞外基质蛋白具备较强黏附能力，可形成致密液固相生物膜，同时分泌多种分解食物大分子的胞外酶以促进消化；该菌可于胃肠道定植，调节正常饮食与营养缺乏饮食模式下实验动物血清脂质、蛋白质稳态；Zhang Hanzhuo等[20]采用纳豆菌发酵小米麸皮，可溶性膳食纤维含量增加92.0%、多酚含量增加32.5%、黄酮含量增加16.4%；李浩然[21]研究发现，纳豆菌青稞发酵液与有氧运动的联合干预在肥胖小鼠的脂代谢紊乱方面表现出显著的改善作用。
本研究以苦荞麦为原料制备发酵苦荞麦粉，以游离多酚和感官评分为评价指标，采用正交试验设计优化其发酵条件，并对微观结构、理化指标与微生物指标进行分析，以期制备一种兼具营养和益生功能的膳食谷物冲调粉，为其工业化生产提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 菌株、材料与试剂
纳豆枯草芽孢杆菌HBUTBN06 本实验室保藏；苦荞麦（川荞3号） 凉山州惠乔生物科技有限责任公司。
甲醇、葡萄糖、碳酸钠、酵母膏、蛋白胨、氯化钠、福林酚（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；没食子酸（纯度≥98%） 上海源叶生物科技有限公司。
纳豆枯草芽孢杆菌活化培养基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母膏、10 g/L NaCl、0.2 g/L琼脂，121 ℃灭菌15 min；纳豆枯草芽孢杆菌液体培养基：2 g/L苦荞麦粉、10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母膏、10 g/L NaCl，121 ℃灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
JSM-6390LV扫描电子显微镜 日本电子株式会社；UV-2600i紫外分光光度计 日本岛津公司；FreeZone® 12 L真空冷冻干燥机 美国Labconco公司；HSX-1000恒温恒湿培养箱 常州金坛良友仪器有限公司；CR22N高速冷冻离心机 日本日立公司；SB-12D超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；800C万能粉碎机 永康市红太阳机电有限公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵苦荞粉工艺流程及操作要点
工艺流程：苦荞麦→加水浸泡→蒸煮→混合调配→发酵→搅拌→发酵结束→真空冷冻干燥→粉碎→过筛→发酵苦荞粉。
操作要点：苦荞麦去杂后，称取200 g，以质量比1∶2加生活饮用水，搅拌均匀，室温（25 ℃）浸泡约8 h，至能轻松挤压成细粉为标准。将浸泡好的苦荞麦沥干水分，置于蒸布上，常压蒸约25 min，以内无生心、手压成泥为标准。将蒸煮后的苦荞麦冷却至40 ℃，根据加水浸泡前的荞麦质量，通过添加蒸馏水调整其水分质量分数至40%～70%。将苦荞麦粉碎，过100目筛，按1 g/L加入液体培养基中，121 ℃灭菌15 min后冷却至40 ℃以下。采用接种环挑取一环固体培养基活化后的纳豆枯草芽孢杆菌菌落，接种到灭菌后的液体培养基中，180 r/min、35 ℃摇床培养16 h后，150 r/min、38 ℃摇床培养5 h，培养结束。将调配后的荞麦醅料于35～39 ℃保温，按苦荞麦原料的6%接种种子液，搅拌均匀。设置培养箱相对湿度75%、发酵温度36 ℃，发酵40 h，每天9:00和21:00各翻拌醅料1次。以未发酵苦荞麦粉作为对照。将发酵好的醅料真空冷冻干燥、粉碎，过100目筛，未通过筛的再次粉碎直至通过100目筛，即获得发酵苦荞麦粉。
1.3.2 苦荞麦粉发酵工艺优化
单因素试验：以游离多酚和感官评分为评价指标，分别考察发酵温度（25、28、31、34、37、40 ℃）、相对湿度（60%、65%、70%、75%、80%、85%）、接种量（3%、5%、7%、9%、11%、13%）、发酵时间（18、24、30、36、42、48 h）对苦荞麦粉品质的影响。
正交试验：以游离多酚和感官评分为评价指标，以发酵温度（A）、相对湿度（B）、接种量（C）和发酵时间（D）为影响因素，在单因素试验的基础上，设计L9(34)正交试验优化苦荞麦粉发酵工艺，正交试验因素与水平见表1。
表1 苦荞麦粉发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table1 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing the fermentation process of tartary buckwheat flour
水平A发酵温度/℃B相对湿度/%C接种量/%D发酵时间/h 135726332377573633978839
1.3.3 感官评价
选取色泽（15分）、香气（35分）、滋味（35分）、 体态（15分）构建感官评分体系，发酵苦荞粉冲调饮品感官评定标准见表2。感官评定小组共10人，所有评价员均具备食品相关专业背景与行业品评经验。发酵苦荞粉与常温饮用水以质量比1∶1混合，搅拌溶解后，再加入发酵苦荞粉3倍质量的70 ℃饮用水，搅拌均匀后，随机分发给评价人员，依据评定标准逐项打分。
表2 发酵苦荞粉冲调饮品的感官评价标准
Table2 Sensory evaluation criteria for reconstituted beverages prepared from fermented tartary buckwheat flour
项目（分值）感官评价评分亮黄色，透亮11～15色泽（15）浅黄色，色泽较亮6～10色泽暗沉1～5具有浓郁的谷物香气和发酵香气26～35香气（35）具有谷物香气和发酵香气16～25香气淡，无异味1～15甘甜纯正，浓郁荞麦香味26～35滋味（35）较纯正、有荞麦香味16～25口感差、荞麦香味淡、微酸1～15澄清透亮，有光泽和少许沉淀物11～15体态（15）澄清透明，有光泽和少许沉淀物6～10液体浑浊，无光泽1～5
1.3.4 游离多酚含量测定
游离多酚含量测定参考王犇[22]、Zhu Yong[23]等的方法并加以改进。称取1.0 g样品加入15 mL 75%甲醇，30 ℃超声提取20 min，4 000 r/min离心5 min并保留上清液。重复提取2次，合并上清液后用75%甲醇定容至50 mL。取200 μL上清液加入0.8 mL蒸馏水、200 μL福林酚试剂，混匀，避光反应6 min，加入2 mL 7 g/100 mL Na2CO3溶液和1.8 mL蒸馏水，混匀，避光反应90 min，于760 nm波长处测定吸光度。以没食子酸为标准品建立标准曲线，得到回归方程（y＝0.009 28x+0.006，R2＝0.999 2）。结果以1 g发酵苦荞粉中没食子酸当量表示，单位为mg/g。
1.3.5 发酵苦荞麦粉质量评价
1.3.5.1 微观结构观察
采用扫描电子显微镜观察发酵苦荞粉的颗粒形态。取少量样品均匀置于粘有双面胶的样品台上，喷金后，用扫描电子显微镜选取样品观察，加速电压1.5 kV，调焦观察苦荞粉颗粒表面形态，并于不同放大倍数（50倍与5 000倍）下拍照[24]。
1.3.5.2 理化指标测定
还原糖按照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》中的方法测定，氨基酸态氮按照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》中的方法测定，膳食纤维按照GB 5009.88—2023《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》中的方法测定。
1.3.5.3 微生物指标测定
菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌分别按照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》、GB 4789.3—2025《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》、GB 4789.4—2024《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》中的方法测定。
1.4 数据处理
采用Excel 2019对实验数据进行处理并作图。
2 结果与分析
2.1 苦荞麦粉发酵工艺优化结果
2.1.1 发酵温度
温度是调控微生物增殖的关键因素，在适宜温度区间内菌种快速增殖并进入对数生长期，借助底物合成各类代谢酶，进而分解发酵基质中的大分子组分，生成多种营养活性物质与风味物质。纳豆芽孢杆菌可分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等复合酶系，降解枯叶、豆渣、谷物等富含大分子碳水化合物的植物原料。苦荞富含黄酮、酚酸、单宁等多酚类物质，但大部分多酚与纤维素、蛋白质、低聚糖结合形成结合态；在适宜温度条件下，利用该菌发酵苦荞，可推动结合态多酚转化为游离态多酚[16]。由图1可知，随着发酵温度在25～37 ℃的范围内升高，游离多酚含量由6.35 mg/g逐渐升高至17.22 mg/g，苦荞麦粉冲调饮品感官评分由62.2分升高至81.7分；随着发酵温度在37～40 ℃范围内升高，苦荞粉游离多酚含量与感官评分均呈逐步下降趋势。高温会抑制菌株正常代谢，阻碍结合态多酚向游离态转化，同时不利于苦荞发酵进程，因此，发酵温度为37 ℃时较适宜。
图1 发酵温度对苦荞麦粉发酵的影响
Fig.1 Effects of fermentation temperature on tartary buckwheat flour fermentation
2.1.2 相对湿度
由图2可知，随着相对湿度在60%～75%范围内的增大，游离多酚由9.31 mg/g逐渐增加至17.26 mg/g，而当相对湿度高于75%时，游离多酚含量开始下降，这可能是由于高湿度会提升发酵基质含水量，降低基质内部溶氧量，抑制纳豆芽孢杆菌的增殖与代谢过程。当相对湿度在60%～80%范围内增大时，苦荞麦粉感官评分逐渐增加，相对湿度为80%时，其感官评分最高，为80.8分，当相对湿度高于80%时，感官评分开始下降，因此，相对湿度为75%～80%较适宜。
图2 相对湿度对苦荞麦粉发酵的影响
Fig.2 Effects of relative humidity on tartary buckwheat flour fermentation
2.1.3 接种量
由图3可知，随着接种量在3%～7%范围内的增加，游离多酚含量明显升高，由10.64 mg/g逐渐增至17.82 mg/g， 当接种量大于7%时，游离多酚含量变化趋于平稳，最高含量可达18.60 mg/g。感官评分随接种量的增加呈先升高后降低，由68.2分升高至79.2分，而后逐渐降低，原因可能是接种量过高会造成发酵底物被过度消耗，菌株代谢生成黏性物质及其他劣变风味组分，进而降低样品感官评分。因此，纳豆枯草芽孢杆菌接种量为7%较适宜。
图3 接种量对苦荞麦粉发酵的影响
Fig.3 Effects of inoculum on tartary buckwheat flour fermentation
2.1.4 发酵时间
由图4可知，当发酵时间在18～36 h范围内增加时，感官评分由65.30分增至80.90分，当发酵时间超过36 h，感官评分开始下降。游离多酚则随发酵时间增加，先由3.84 mg/g增至17.39 mg/g，而后稳定于17.88 mg/g左右。因此，发酵时间为36 h为宜。
图4 发酵时间对苦荞麦粉发酵的影响
Fig.4 Effects of fermentation duration on tartary buckwheat flour fermentation
2.1.5 正交试验优化结果
苦荞麦粉发酵工艺条件优化正交试验设计结果如表3所示，方差分析结果如表4所示。
表3 苦荞麦粉发酵工艺条件优化正交试验设计结果
Table3 Results of orthogonal tests for optimizing fermentation parameters of tartary buckwheat flour
1111113.2165.34212319.5883.55223118.9976.47313219.3979.48321317.2277.59332118.3879.2游离K255.3152.8854.6352.80多酚K354.9952.4455.7054.12 K1208.1228.2219.6220.9感官K2236.7226.0234.8228.3试验号ABCD游离多酚含量/（mg/g）感官评分2122216.6772.13133317.3270.76231216.7476.8 K147.2052.1847.1750.58 R8.110.708.533.54评分K3236.1226.7226.5231.7 R28.62.215.210.8
表4 正交试验结果方差分析
Table4 Analysis of variance for orthogonal test data
评价指标方差来源平方和自由度平均方差FP显著性A14.06227.031168.4750.005 9**B0.08320.0421.0000.500 0游离多酚C14.39527.198172.4670.005 8**D2.13421.06725.5620.037 6*误差0.08320.042 A178.036289.018211.3880.004 7**B0.84220.4211.0000.500 0感官评分C38.616219.30845.8500.021 3*D20.329210.16424.1370.039 8*误差0.84220.421
注：*.影响显著（P＜0.05）；**.影响极显著（P＜0.01）。
根据F值，各因素对游离多酚含量的影响程度由主至次依次为：接种量＞发酵温度＞发酵时间＞相对湿度，最佳发酵工艺条件为A2B2C3D3；各因素对感官评分的影响程度由主至次依次为：发酵温度＞接种量＞发酵 时间＞相对湿度，最佳发酵工艺条件为A2B1C2D3。由表4可知，接种量、发酵温度对游离多酚含量有极显著影响（P＜0.01），发酵时间对其有显著影响（P＜0.05），相对湿度影响不显著（P＞0.05）；发酵温度对感官评分有极显著影响（P＜0.01），而接种量、发酵时间对其有显著影响（P＜0.05），相对湿度影响不显著（P＞0.05）。
由于正交试验以游离多酚含量和感官评分为评价指标获得的最佳发酵工艺条件在相对湿度（B）和接种量（C）上不一致，采用综合平衡法确定最优方案。相对湿度（B）对游离多酚含量和感官评分影响均不显著，且较低的相对湿度有利于节约生产成本，因此选则B1；接种量对游离多酚含量影响极显著，因此优先选则C3，最终确定最优方案为A2B1C3D3。最优方案未出现在试验组，因此将最优方案与试验组A2B1C2D3进行验证，结果表明，2种工艺条件下游离多酚含量分别为19.62 mg/g和19.60 mg/g，感官评分分别为83.6分和83.5分。基于游离多酚含量差异不显著、冲调发酵苦荞麦粉的体态和滋味，综合考量能源节约问题，选取试验组A2B1C2D3方案，即发酵温度37 ℃、相对湿度72%、纳豆枯草芽孢杆菌接种量7%、发酵时间39 h。
2.2 发酵苦荞粉品质
2.2.1 发酵苦荞粉微观结构
由图5可知，未发酵苦荞麦粉颗粒大、表面粗糙，且结构排列有序、平整紧密、碎片大小不一、边缘锋利。由图6可知，发酵苦荞麦粉颗粒小、表面圆滑、结构疏松多孔，碎片为较均一的圆形或椭圆形。由此可见，苦荞籽粒经高温蒸煮与充分发酵后，原本完整致密的颗粒碎裂，形成疏松多孔、近圆形的细小碎片。水分浸润、高温作用协同纳豆芽孢杆菌分泌的复合酶系，破坏原有淀粉颗粒与蛋白质空间构象：淀粉发生糊化，纤维大分子被酶解为低聚糖与单糖，蛋白质分解为小分子肽和游离氨基酸，部分结合态多酚也转化为游离态多酚。发酵过程将大量大分子组分降解为易吸收小分子，物料形成的疏松多孔结构还可促进消化液渗入，强化体内酶解反应，提升胃肠消化吸收效率，这与Zhang Shimei[16]、Li Xia[25]等的研究结果一致。
图5 未发酵苦荞麦粉扫描电子显微镜图
Fig.5 Scanning electron microscopy graphs of unfermented tartary buckwheat flour
图6 发酵苦荞麦粉扫描电子显微镜图
Fig .6 Scanning electron microscopy graphs of fermented tartary buckwheat flour
2.2.2 发酵苦荞麦粉理化指标与微生物指标
经测定，发酵苦荞粉还原糖质量分数为（6.48±0.26）%，可快速为人体供能；氨基酸态氮质量分数达（0.22±0.05）%，能够补充机体必需氨基酸；游离多酚含量为（19.61±1.23）mg/g，具备良好抗氧化活性；膳食纤维质量分数高达（20.37±0.32）%，对维持肠道健康具有积极作用。
发酵苦荞麦粉菌落总数为（5.6±0.6）×108 CFU/g，大肠菌群数低于3 MPN/100 g，沙门氏菌未检出。由于采用纳豆枯草芽孢杆菌单一菌株发酵苦荞麦，菌落总数检出菌株均为纳豆枯草芽孢杆菌。纳豆芽孢杆菌属于传统发酵食品许可使用菌株，食用安全性良好，同时具备多种益生功能：该菌可形成芽孢，能够耐受胃酸环境抵达肠道；进入肠道后通过消耗肠道内氧气营造厌氧微环境，抑制有害菌繁殖；还可代谢生成短链脂肪酸，进而维护肠道健康。
发酵后的苦荞麦粉经70 ℃生活饮用水冲调后呈亮黄色，体态均一、甘甜可口，具有浓郁的谷物香和酯香气。
3 结 论
以能够分泌丰富酶系的纳豆枯草芽孢杆菌为发酵菌株，以游离多酚和感官评分为评价指标，采用单因素试验和正交试验优化获得苦荞麦粉最佳发酵工艺条件：发酵温度37 ℃、相对湿度72%、纳豆枯草芽孢杆菌接种量7%、发酵时间39 h。在此条件下发酵制备的苦荞麦粉由原来完整紧密不规则的大颗粒结构变成碎片化、疏松多孔的近似圆形小颗粒，可见纳豆菌发酵能有效促进苦荞麦大分子物质降解，有利于人体消化吸收。经热水冲调的发酵苦荞麦粉呈亮黄色，甘甜宜人、香气浓郁。发酵苦荞麦粉含有还原糖、氨基酸态氮、多酚及较高含量的膳食纤维、具有益生功能的纳豆枯草芽孢杆菌，可满足消费者追求健康的需求。
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