四川省柑橘种植面积与产量长期位居全国首位，其中‘爱媛38号’因其高糖低酸、风味优良而被广泛种植[1]。目前该品种仍以鲜销为主，但采后贮藏期短，深加工技术尚不成熟，随着产量逐年扩大，其市场售价呈下降趋势，亟需提升产业附加值[2-3]。
发酵技术作为一种有效的果蔬加工方式，可有效延长产品保质期、改善风味并提升功能成分含量，近年来备受关注[4]。目前柑橘汁发酵主要利用酿酒酵母、非酿酒酵母、醋酸菌、乳酸菌等进行单一菌种发酵，少数为复合菌种发酵，产品以果酒、果醋、发酵果汁为主[5-8]。目前我国柑橘深加工仍以初级加工为主，鲜销占比高，发酵产品同质化、香气不足、苦味偏重等问题突出[7-8]。现有研究多聚焦于工艺优化与传统菌种，对本土非酿酒酵母资源挖掘不足[9]。
非酿酒酵母在食品发酵中应用广泛，能够丰富产品香气层次、提高发酵效率并增强产品稳定性[10]。部分非酿酒酵母菌株对高酸、高糖及较高乙醇环境具有较强的适应性，适宜用于柑橘汁发酵体系；同时，其分泌的β-葡萄糖苷酶可水解柑橘汁中糖苷类香气前体物质，促进键合态香气物质释放，从而显著提升果汁的香气复杂度[11]。研究证明，非酿酒酵母在苹果、葡萄等多种果蔬发酵中能够高效转化糖类，生成二氧化碳、有机酸及其他风味物质，进而改善产品口感与香气，加速发酵进程[12]；同时发酵过程中产生的多种代谢物可能具有增强免疫力、延缓衰老和促进肠道健康等多重有益功效[13]。然而，目前针对非酿酒酵母在柑橘汁尤其是‘爱媛38号’柑橘汁发酵中的应用研究较少，其在香气形成、活性成分保留及抗氧化性能调控方面的影响与机制尚不明确。
为此，本研究以‘爱媛38号’柑橘汁为原料，选用4株四川本土非酿酒酵母及1株商业菌株进行发酵，系统比较其发酵性能、抗氧化特性与香气组成等，旨在筛选适用于柑橘汁发酵的本土菌种，为柑橘高值化发酵产品开发提供理论与技术支撑。
1 材料与方法
1.1 菌株、材料与试剂
4株本土非酿酒酵母（Kluyveromyces marxianus WG-60、K. marxianus XC-38、Maudiozyma humilis SS-46、M. exigua CM-51）分离自四川省本土水果，保存在本实验室；商业非酿酒酵母（K. marxianus LAF-4）丹麦科汉森股份有限公司。
‘爱媛38号’采摘自四川眉山仁寿县（东经104°00′～104°30′，北纬29°40′～30°16′）。
YPD液体培养基、WL营养琼脂培养基、琼脂粉 青岛海博生物技术有限公司；氯霉素、福林酚、没食子酸、芦丁、对硝基苯-β-D-半乳糖苷 上海源叶生物科技有限公司；乙酸乙酯、己酸乙酯、苯甲酸乙酯、乙酸异戊酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、正戊醇、异戊醇、苯乙醇、α-松油醇、芳樟醇、香叶醇、正辛醇、1-庚醇、苯甲醛、正烷酮（C4～C9）、正构烷烃（C8～C21） 美国Sigma公司；4-甲基-2-戊醇、4-甲基-2-戊醛 百灵威科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Feyond-A300酶标仪 杭州奥盛仪器有限公司；LDZF-75L立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂； ZQZY-88CE恒温培养箱 上海知楚仪器有限公司；2019C196-11 pH计 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；PAL-1手持糖度计 日本Atago公司；T6紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；8890-5977B气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪 美国Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）纤维头 美国Sigma-Aldrich公司。
1.3 方法
1.3.1 柑橘汁的制备工艺流程及操作要点
工艺流程：原料挑选→清洗、去皮去梗→榨汁→巴氏杀菌→冷却→接种→分装→发酵。
操作要点：选择成熟度适中、无病虫害的‘爱媛38号’柑橘果实，清洗、去皮、去梗后使用食品榨汁机（使用前沸水杀菌30 min）榨汁（FJDZ）；将柑橘果汁65 ℃杀菌30 min（CZ）；-80 ℃甘油管室温解冻后划线培养（WL固体培养基中28 ℃培养48 h）进行活化，挑取单菌落后进行2次纯化（YPD固体培养基中28 ℃培养48 h），最后将纯化菌落接种至YPD液体培养基，28 ℃、150 r/min扩增培养12 h。将活化后的酵母菌悬液（1×106 CFU/mL）按1%接种量接种到柑橘汁中，将接种后的果汁分装至500 mL发酵瓶中，每瓶400 mL，发酵温度为（22±2）℃。糖度（通常为10 g/L以下）和pH值基本不变时，采用巴氏杀菌终止发酵。
1.3.2 基本理化指标测定
活菌数：按照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》[14]进行检测； pH值及可溶性固形物：分别使用pH计和糖度计测定；总糖含量：采用3,5-二硝基水杨酸法[15]测定；总酸含量：采用指示剂法[16]测定；菌株产β-葡萄糖苷酶能力参考覃宝山等[17]的方法测定。
1.3.3 生物活性成分和抗氧化性能测定
总黄酮和总酚含量：采用分光光度法和福林酚比色法[18]测定；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基及2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除能力参考Kedare等[19]的方法测定。
1.3.4 香气成分测定
参考Wang Dan等[20]的方法，采用顶空SPME结合GC-MS进行香气成分富集和测定。将5.0 mL待测液、1.0 g氯化钠、10 μL 0.800 2 mg/L 4-甲基-2-戊醇溶液（内标）依次加入20 mL萃取瓶中，密封后，于45 ℃恒温条件下平衡20 min后启动检测。采用预处理的50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维头进行SPME，GC条件：色谱柱为HP-INNOWax毛细管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），进样口温度250 ℃，载气为高纯度氦气（流速1.0 mL/min）。升温程序：40 ℃（3 min）→3 ℃/min升至120 ℃→4 ℃/min升至210 ℃（9 min）→8 ℃/min升至240 ℃（2 min）。MS条件：电子电离源，电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃。采用全扫描模式采集数据，扫描范围m/z 35～500。定性定量分析：将质谱数据与NIST 2020标准谱库、目标化合物保留指数及标准品图谱比对，筛选匹配度大于85%的候选挥发性组分；结合离子淌度加以校正，实现同分异构体的有效区分与定性确证；定量检测采用内标法完成。
香气活度值（odor activity value，OAV）分析：基于下式引入动态Logistic回归模型（L0＝0.35、d＝0.82）修正香气强度等级（L）与阈值（C0）的非线性关系，较传统固定参数模型可显著提升预测精度（R2＝0.91）。通过内标法校正样品质量浓度（C），最终计算各化合物的OAV，表征其对香气的实际贡献度。
1.3.5 感官评价
参照钟轲等[18]的方法对感官品评小组（20人）进行3次标准化培训；随后进行柑橘汁感官描述词筛选，并对柑橘汁样品进行香气感官评价。不同菌种发酵柑橘汁香气强度采用0～5分制打分，其中0为“无”，5为“强”，最终取20人的感官评分平均值作为评分结果。
1.4 数据处理
运用Excel 2016和Origin 2025整理数据并绘图；通过SPSS 26.0完成显著性检验、单因素方差分析和相关性分析。
2 结果与分析
2.1 柑橘汁发酵过程中活菌数和β-葡萄糖苷酶活性变化
由图1可知，CZ组（空白对照组）β-葡萄糖苷酶活性较低（0.20 U/mL）；在0～72 h时，5株酵母菌处于对数生长期，且大多数发酵体系活菌数在72 h时最高，β-葡萄糖苷酶活性同样达到最高，其中菌株XC-38组β-葡萄糖苷酶活性最高（260.33 U/mL），LAF-4组最低（117.81 U/mL）。随后酵母菌生长开始进入稳定期，发酵120 h后，菌株WG-60、XC-38和LAF-4组活菌数呈波动下降趋势，但总体仍保持较高水平，而5株酵母菌的β-葡萄糖苷酶活性在72 h后均开始下降，可能是因为酵母菌生长进入稳定期后产酶减少。前期发酵体系中的糖含量丰富，有利于酵母大量生长繁殖；随着发酵的进行，柑橘汁中的营养物质逐渐被消耗，尤其是糖类含量降低，酵母生长速率减缓，产酶减少[18]。
图1 柑橘汁发酵过程中活菌数（A）和β-葡萄糖苷酶活性（B）变化
Fig.1 Variations in viable yeast counts (A) and β-glucosidase activities (B) throughout citrus juice fermentation
2.2 柑橘汁发酵过程中理化指标变化
由图2可知，CZ组4个理化指标在发酵过程中基本稳定，变化较小，其他组发酵样品pH值、可溶性固形物和总糖含量整体呈现下降趋势，总酸含量显著提高（P＜ 0.05），WG-60和XC-38组总糖和可溶性固形物消耗速率最快，216 h时总糖质量浓度分别降至6.55 g/L和7.86 g/L， 显著低于其他菌株（LAF-4为12.33 g/L）；这一变化主要是因为发酵过程中糖类物质不断被消耗并产生有机酸和其他酸类物质[21]，使pH值下降；发酵过程生成的各类有机酸可赋予果汁差异化风味特征；总酸含量适度提升能够丰富发酵果汁香气滋味，改善风味层次感[22]。
图2 发酵过程中柑橘汁的基本理化性质变化
Fig.2 Dynamic changes in basic physicochemical indicators of citrus juice during the fermentation
CZ组总酸（8.04 g/L）发酵结束时与FJDZ组（7.73 g/L）无显著差异（P＞0.05），而5组发酵样品总酸含量均显著升高（P＜0.05），说明菌株发酵时产酸。WG-60、XC-38、CM-51组和LAF-4组发酵体系pH值降幅相近，从3.87下降至3.60～3.66，其中，XC-38总酸质量浓度最高，为9.50 g/L，表明其代谢活动有机酸产生可能较多，对柑橘汁酸度贡献较大；WG-60、CM-51组和LAF-4组总酸质量浓度分别为9.14、9.08 g/L和9.18 g/L。SS-46发酵的柑橘汁pH值下降速率最快，发酵结束时达3.40，但其总酸质量浓度最低，为8.56 g/L，可能是因为其发酵体系缺少缓冲性弱酸，导致pH值下降较快[23]。WG-60组和XC-38组可溶性固形物和总糖消耗速率最快，表明这2株酵母的代谢活性和发酵效率高；LAF-4组消耗速率次之，SS-46和CM-51最低，但也表现出较高的代谢活性。
2.3 发酵柑橘汁活性物质及其抗氧化活性变化
由图3A可知，与巴氏杀菌前的FJDZ组相比，CZ组总黄酮和总酚含量变化不显著（P＞0.05），所有发酵样品的总黄酮和总酚含量均显著升高或降低（P＜0.05）。其中XC-38组总黄酮和总酚质量浓度最高，分别为145.23 mg/L和485.23 mg/L，是CZ组（118.32 mg/L和445.67 mg/L）的1.23倍和1.09倍，分别提升22.74%与8.88%。WG-60组和LAF-4组总黄酮和总酚含量也有一定提升（P＜0.05），总黄酮质量浓度分别升至130.89 mg/L 和125.67 mg/L，总酚质量浓度分别升至470.45 mg/L和460.12 mg/L；SS-46组和CM-51组总黄酮（110.56 mg/L和105.78 mg/L）和总酚（430.56 mg/L和425.78 mg/L）质量浓度显著低于发酵前（P＜0.05），表明其代谢活动可能导致黄酮和多酚类物质的降解或转化。
图3 发酵结束时柑橘汁的总黄酮和总酚含量（A）和DPPH自由基与ABTS阳离子自由基清除能力（B）
Fig.3 Total flavonoid and total phenolic concentrations (A), together with 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical and 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin
-sulfonic acid) cation radical scavenging capacities (B) of citrus juice upon fermentation completion
如图3B所示，CZ组DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率与杀菌前柑橘汁（FJDZ）相比，仅下降不到1%，变化较小；发酵样品的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力均发生显著变化。其中，XC-38组表现出最优异的抗氧化能力，DPPH自由基清除率最高，达到75.23%，是发酵前CZ样品的1.16倍；ABTS阳离子自由基清除率同样最高，达到78.12%，显著高于其他样品（P＜0.05），是发酵前CZ组的1.14倍；WG-60组和LAF-4组DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力也较强，WG-60组分别为72.45%和75.23%，LAF-4分别为70.12%和73.56%，可能是由于抗氧化物质在发酵过程中被非酿酒酵母代谢转化，如β-葡萄糖苷酶水解糖苷型多酚（黄酮苷、花色苷、结合态酚酸）释放游离态苷元与酚类，提高游离酚含量，从而显著增强发酵果汁的总抗氧化能力[24]； 相比之下，SS-46组和CM-51组抗氧化能力与发酵前相比有所下降，可能是SS-46组和CM-51组含有的抗氧化物质被氧化或转化成不具有抗氧化活性的物质，导致抗氧化活性减弱[25]。
果汁发酵过程中抗氧化能力与其含有的活性物质，特别是酚类物质含量密切相关[26]，在本研究中，抗氧化活性的增加与总酚和总黄酮含量的增加趋势一致。总黄酮含量与2种自由基清除率相关系数均为0.99（P＜0.01），总酚含量与2种自由基清除率相关系数均为0.97（P＜0.01），说明总黄酮和总酚含量增加会显著提高柑橘汁的抗氧化活性。
2.4 发酵柑橘汁挥发性香气成分与感官特征
2.4.1 发酵柑橘汁挥发性香气成分与香气轮
由图4A可知，GC-MS技术从柑橘汁样品中共检测到145种挥发性香气物质，包括40种醇类物质、28种酯类物质、20种萜烯类物质、18种醛酮类物质、13种芳香烃类物质、10种酸类物质和16种其他类物质（包括酚类、醚类、呋喃类等）。CZ组香气物质为47种，远多于FJDZ组的31种，这可能是由于杀菌过程促使柑橘汁内部一些潜在的香气前体物质发生转化，生成了新的香气成分。研究表明，杀菌处理后香气物质种类的增加，主要源于键合态前体水解、类胡萝卜素与萜类降解、脂肪酸氧化及美拉德反应等途径共同作用，最终形成更为丰富的香气组分谱[26-27]。
图4 发酵结束时不同组别柑橘汁中各类别香气化合物的数量（A）和发酵柑橘汁香气轮（B）
Fig.4 Counts of aroma compounds classified by chemical families in citrus juice from distinct groups after the fermentation (A) and aroma wheels of fermented citrus juice samples (B)
不同酵母发酵后柑橘汁中挥发性香气物质种类与数量存在差异，XC-38、WG-60、CM-51、LAF-4组和SS-46组分别检测到58、56、53、52、48种挥发性香气物质；与发酵前柑橘汁相比，发酵后酯类、醇类、醛酮类和酸类物质种类均有不同程度增加，其中醇类物质在多数发酵样品中占比较高，对柑橘汁的基础香气贡献较大，酯类物质则赋予柑橘汁独特的果香和花香气息，使得发酵柑橘汁的香气更为丰富和复杂。
根据香气感官评价结果构建香气轮，由图4B可知，发酵柑橘汁的香气特征可系统划分为7个主类别（果香、焦糖味、刺激味、花香、草木香、发酵味、坚果香）和26种具体子类别。整体而言，发酵柑橘汁的香气以果香为主导，同时兼具焦糖甜香和发酵带来的复杂性。综合评分（表1）显示，不同处理组的香气特征存在显著差异，发酵前（FJDZ、CZ）煮红薯味较为突出，发酵后5组柑橘皮味比FJDZ都有所提升，LAF-4、WG-60、XC-38和SS-46组侧重于酸枣味、醋酸、发酵曲味和柠檬味；CM-51组果香和花香表现丰富。
表1 不同组别柑橘汁香气描述词得分
Table1 Sensory scores of aroma descriptive attributes for citrus juice from different groups
香气描述词FJDZCZLAF-4WG-60XC-38SS-46CM-51糖果0.710.520.900.810.620.481.33红枣0.670.430.240.140.140.290.33豆沙1.480.620.140.190.330.100.29煮熟红薯味2.951.140.140.380.290.430.62杏仁0.620.140.190.100.100.050.05花卉0.710.671.000.951.050.381.33玫瑰香0.480.480.860.810.950.140.81茉莉花0.330.330.520.240.620.101.00柑橘皮0.952.002.242.942.601.762.14柠檬0.380.761.191.331.141.570.81浆果0.670.811.101.101.380.291.29葡萄0.520.431.000.710.860.330.71酸枣味0.620.430.951.290.861.520.43凤梨0.620.670.901.381.190.810.86苹果0.520.670.670.860.860.760.95樱桃0.140.330.571.051.000.481.14香蕉0.430.520.430.950.900.430.90荔枝0.290.480.380.520.480.290.81发酵曲味0.430.671.761.761.241.240.33乙醇味0.190.321.571.351.110.960.02醋酸0.140.381.761.291.052.860.33指甲油味0.190.240.670.480.290.760.05臭鸡蛋味0.430.520.380.240.240.570.14青草0.710.810.290.290.290.480.43草本味0.670.670.240.430.290.290.38木香0.481.100.050.190.050.100.38
2.4.2 发酵柑橘汁香气物质OAV
OAV通过比较香气物质的实际质量浓度与嗅觉阈值评估其对整体风味中的贡献；当OAV≥1时，该物质的浓度已超过其嗅觉阈值，能够被人体感知，从而对风味产生显著影响；当1＞OAV＞0.1时，该香气物质具有潜在风味贡献，可通过协同作用、增香效应、风味修饰参与整体香气形成。各组香气差异主要由关键挥发性化合物的种类和质量浓度决定[28]，7组样品中OAV≥0.1的香气成分共有70种，基于OAV绘制聚类热图，结果如图5所示。
图5 发酵柑橘汁香气化合物OAV聚类热图
Fig.5 Clustered heatmap based on odor activity value of volatile aroma compounds in fermented citrus juice
由图5可知，醇类物质在柑橘汁中种类最多，是花果香和青草气味的主要呈香物质；苯乙醇（玫瑰）在发酵前含量较少，发酵后各组OAV＞1，是样品中呈现玫瑰香气的核心物质；3-甲基-1-丁醇（苹果、香蕉）和2-甲基-1-丙醇（苹果）同样在发酵组较为突出，尤其是在SS-46组。酯类物质在果汁中种类也较多，大多与果香有关，辛酸乙酯呈现菠萝香、甜味，而苯甲酸甲酯则提供草莓味和甜味。醛酮类和酸类物质主要呈现奶甜香和花果香气，3-羟基-2-丁酮呈现黄油味、奶油香，XC-38组OAV为100；苯乙酮呈现茉莉香和甜香，在WG-60、CM-51组含量较高。萜烯类主要与果香和木香有关，其中β-水芹烯在FJDZ、CZ组和SS-46组含量较高，提供松木香和柑橘香，1,3,8-对-薄荷三烯是原汁中薄荷香气的主要呈香物质，杀菌后香气几乎完全损失；而柠檬烯在LAF-4和WG-60组含量较高，主要呈现柑橘香和松木味。其他类物质中，甲基吡嗪主要体现烤坚果味、焦香，XC-38组含量较高，为柑橘汁提供烤坚果味和焦香。β-葡萄糖苷酶可分解苷结合态香气前体，产生萜烯类、醇类、醛类等游离香气物质。发酵后样品中2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、辛酸乙酯等化合物含量均有所提高，验证了β-葡萄糖苷酶可能有助于增加部分香气物质的生成，增加样品香气的复杂性。LAF-4组香气以柠檬烯（OAV＝100）、壬酸乙酯与癸酸甲酯为主，呈现典型柑橘香与奶油蜡香；WG-60组香气以2,6-二甲基-2,4,6-辛三烯（OAV＝100）和反式-香芹醇为主，其特征为木香与青草香味；XC-38组香气以甲基吡嗪（OAV＝ 22.44）与3-羟基-2-丁酮（OAV＝100）为核心，整体香气以奶香和坚果烘烤调为主；CM-51组苯乙醇（玫瑰香）、3-甲基-1-丁醇（苹果香）与苯乙酮（茉莉香）存在协同作用，呈现花香与果香。SS-46组β-水芹烯和 1-(2-呋喃基)-2-丁酮等OAV更高，其松木香和焦糖味特征较为明显。综合来看，四川本土菌株中XC-38在香气复杂度与抗氧化活性方面更具优势。
3 结 论
本研究系统评价了5株非酿酒酵母（WG-60、XC-38、SS-46、CM-51、LAF-4）在‘爱媛38号’柑橘汁发酵中的性能差异，及其对柑橘汁抗氧化性能和香气特性的影响。5株非酿酒酵母在柑橘汁发酵中表现出显著差异，WG-60组 和XC-38组活菌数增长较快，XC-38组β-葡萄糖苷酶活性最高（260.33 U/mL）；在代谢活性方面，WG-60组 和XC-38组总糖和可溶性固形物消耗速率最快；在酸度调控方面，XC-38组总酸质量浓度最高（9.50 g/L）， 显著高于商业菌株LAF-4（9.18 g/L），WG-60、XC-38组与LAF-4组pH值降幅相近，表明它们的酸度调控能力与商业菌株相当；XC-38组总黄酮和总酚质量浓度最高，分别为145.23 mg/L和485.23 mg/L，抗氧化活性约为发酵前的1.2倍。柑橘汁发酵后，香气的种类均有所提升，XC-38组香气复杂度最高。
综合来看，本土非酿酒酵母菌株发酵可使柑橘汁的pH值降低，这有助于延长保质期；发酵后总糖含量减少，符合人们对低糖饮品的追求；同时，高产β-葡萄糖苷酶的非酿酒酵母显示出有助于提升果汁香气的潜力。其中WG-60和XC-38表现出显著的优势，它们在产酸能力、糖消耗速率及抗氧化能力方面均表现突出，在总酸和酚类物质生成方面比商业菌株LAF-4更具优势，兼具高效的发酵性能和功能性成分调控潜力，并且XC-38产生的香气成分更佳。这一结果凸显了本土筛选菌株的独特应用价值，为‘爱媛38号’柑橘汁发酵的生产加工提供了重要的理论依据和技术支撑。
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