库尔勒香梨酵素制备及对斑马鱼炎性肠病的改善作用

高新然1,贾东升1,何婉清1,崔施展1,王明雪1,杨绍东2,赵江丽3,*

(1.河北省农林科学院经济作物研究所,河北 石家庄 050051;2.库尔勒沁知园生物科技有限公司,新疆 库尔勒 841008;3.河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所,河北 石家庄 050051)

摘 要:以库尔勒香梨为原料,以植物乳植杆菌与酿酒酵母为菌种,发酵制备库尔勒香梨酵素。以综合评分为评价指标,通过单因素试验结合响应面法优化其发酵工艺条件,采用2,4,6-三硝基苯磺酸诱导斑马鱼炎性肠病,分别考察库尔勒香梨未发酵原液(PFS组)、库尔勒香梨酵素(PYE组)和阳性药物泼尼松(PRED组)对炎性肠病斑马鱼肠道结构、免疫指标及炎症因子水平的影响。结果表明,最佳工艺条件为:植物乳植杆菌与酿酒酵母比例11∶1、接种量1.6%、白砂糖添加量19%、发酵时间34 h。在此优化条件下,综合评分为93.2。动物实验结果表明,PYE组和PRED组均能增加炎性肠病斑马鱼肠道组织杯状细胞数量,恢复斑马鱼因炎性肠病受损的肠道隐窝结构,提升免疫球蛋白M、免疫球蛋白T表达水平,并降低炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β表达水平。综上,库尔勒香梨酵素能改善炎性肠病斑马鱼肠黏膜损伤,降低炎性细胞因子表达,具有一定的抗炎效果。

关键词:库尔勒香梨酵素;工艺优化;混菌发酵;斑马鱼;炎性肠病;抗炎

库尔勒香梨(Pyrus sinkiangensis Yü)为蔷薇科梨属植物的果实,全果富含熊果苷、绿原酸、儿茶素、表儿茶素等抗氧化活性成分[1-2],以鲜食为主。其最佳采收窗口较窄,采后果皮易转黄及油腻化,采后损耗较大。将库尔勒香梨制备为酵素是实现其高值化利用的有效途径。目前,梨属酵素的研究多集中于雪花梨、南果梨等品种,张笑莹等[3]以雪花梨为原料,采用酿酒酵母-植物乳植杆菌二步发酵工艺制备雪花梨酵素,并对菌株发酵条件进行优化,获得产品符合食用液态植物酵素对理化指标的要求。郝子娜等[4]以南果梨皮渣为原料,辅以红糖进行发酵,制备南果梨皮渣红糖酵素,产品超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力达1 235.35 U/mL,感官品质良好。此外,混菌协同发酵相较于单一菌种发酵具有显著优势,可提升酵素品质与功能活性[5]。刘秀娟[6]研究发现,酵母菌、植物乳植杆菌混合发酵苹果酵素的抗氧化能力、挥发性风味物质及多酚类化合物种类均优于单菌发酵。

经微生物发酵产生的特定生物活性成分不仅能提升产品品质,还对肠道健康具有积极作用[7]。《本草纲目》记载梨可润肺凉心、消痰降火,为梨果抗炎、清热、修护黏膜的功能属性提供传统理论支撑。动物实验发现,库尔勒香梨粗多糖具有镇咳祛痰功效[8],这可能与其通过抑制细胞焦亡而发挥的抗炎作用相关[9],而近期在与其同科同属的莱阳梨相关研究中发现,后者对肠道菌群紊乱、肠道炎症及肠屏障损伤均具有较好的改善作用[10],结合库尔勒香梨中熊果苷、绿原酸等酚类物质的体外抗炎活性,推测其可能存在类似的肠道调控能力。

斑马鱼作为一种经典模式脊椎实验动物,与人类基因组序列相似度达87%[11]。相较于小鼠等哺乳动物,斑马鱼具有身体透明易观察、用药量少、实验周期短、成本低等优势,适用于肠道抗炎活性高通量评价。Gong Xiaoyue等[12]借助宏基因组、代谢组技术结合免疫因子与肠道屏障相关蛋白测定,证实铁皮石斛发酵液多酚能够调控斑马鱼肠道菌群及短链脂肪酸含量、调节肠道免疫,缓解恶唑酮诱导的斑马鱼肠道炎症。但目前鲜见库尔勒香梨酵素改善炎性肠病的研究报道。

本研究以库尔勒香梨为原料,采用植物乳植杆菌与酿酒酵母协同发酵制备库尔勒香梨酵素。以综合评分为评价指标,通过单因素试验结合响应面法优化其发酵工艺条件,采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)诱导斑马鱼炎性肠病,分别考察库尔勒香梨未发酵原液(PFS组)、库尔勒香梨酵素(PYE组)和阳性药物泼尼松(PRED组)对炎性肠病斑马鱼肠道结构、免疫指标及炎症因子水平的影响,以期为库尔勒香梨特色资源的开发提供参考,推动功能性酵素产品在肠道健康领域的产业化发展。

1 材料与试剂

1.1 动物、材料与试剂

野生型AB品系斑马鱼(养殖水:200 mg速溶海盐溶于1 L反渗透水中,电导率450~550 μS/cm、pH 6.5~8.5、硬度50~100 mg/L CaCO3、水温28 ℃,动物生产许可证号:苏动质2023046901-1) 南京一树梨花生物科技有限公司。

库尔勒香梨采摘于新疆巴州库尔勒香梨种植基地;植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)CICC 21806、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC 32298 中国工业微生物菌种保藏管理中心。

硝酸铝、亚硝酸钠 上海易恩化学技术有限公司;氢氧化钠 天津市福晨化学试剂厂;泼尼松、无水柠檬酸、柠檬酸钠、酚酞、没食子酸、芦丁、福林酚 上海麦克林生化科技有限公司;无水乙醇 天津市致远化学试剂有限公司;SOD试剂盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;TNBS 上海源叶生物科技有限公司;苏木素染液、伊红染液 常德比克曼生物科技有限公司;中性树胶 武汉克米克生物医药技术有限公司;阿尔辛蓝-过碘酸希夫(Alcian blue-periodic acid-Schiff,AB-PAS)染色试剂盒 上海贝博生物科技有限公司;斑马鱼适用型肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒 上海酶联生物科技有限公司;斑马鱼适用型免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)T ELISA试剂盒 南京博研 生物科技有限公司;IgM ELISA试剂盒 武汉吉立德生物科技有限公司;三卡因 上海创赛科技有限公司。

1.2 仪器与设备

JJ2000B型电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;D37520型高速冷冻离心机 北京博劢行仪器有限公司;UV-2600型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司;DK-98-II型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;S210型pH计 梅特勒托利多科技(中国)有限公司;FastPrep-24™ 5G全自动组织匀浆仪 美国MP Biomedicals公司;B-510LD4型正置显微镜 意大利OPTIKA公司;S700型全自动轮转式切片机 深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司;DR-H310型电热恒温鼓风干燥箱 广东德瑞检测设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 库尔勒香梨酵素制备工艺流程及操作要点

工艺流程:梨果挑选→清洗→去核→切分→装罐→调整料液比、糖度、pH值→灭菌→接种→避光发酵→离心、过滤→超高压→成品。

操作要点:

原料预处理:选取新鲜库尔勒香梨,以蒸馏水洗净去核后切为3~5 mm薄片。

装罐调配:以切好的香梨质量为基准,按料液比1∶1(g/mL)加入蒸馏水,添加质量分数18%的白砂糖,装入发酵罐中,用无水柠檬酸和柠檬酸钠调节pH值至4.5[3]。

灭菌:对香梨混合液进行巴氏灭菌(85 ℃、20 min)后,冷却至室温。

接种发酵:按植物乳植杆菌与酿酒酵母(浓度均为106 CFU/mL)体积比15∶1接种菌液,32 ℃避光发酵36 h,获得发酵液。

离心过滤、成品:将发酵液离心(5 000 r/min、10 min)、过滤后,超高压(500 MPa、20 min)处理,即得库尔勒香梨酵素[13]。

1.3.2 库尔勒香梨酵素发酵工艺优化

单因素试验:固定基本发酵条件为植物乳植杆菌与酿酒酵母体积比15∶1、混合发酵菌液接种量1.6%、白砂糖添加量18%、发酵时间36 h[3]。分别考察菌种比例(植物乳植杆菌∶酿酒酵母)(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1)、接种量(1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%)、白砂糖添加量(10%、14%、18%、22%、26%)、发酵时间(12、24、36、48、60 h)对库尔勒香梨酵素综合评分的影响。

响应面试验:基于单因素试验结果,以菌种比例(A)、接种量(B)、白砂糖添加量(C)、发酵时间(D)为自变量,以综合评分(Y)为响应值,采用4因素3水平Box-Behnken响应面试验设计优化混菌发酵工艺,因素和水平如表1所示。

表1 库尔勒香梨酵素发酵工艺优化响应面试验设计因素与水平
Table1 Factors and coded levels of response surface test design for fermented process optimization for Korla fragrant pear Jiaosu

15∶11.51424210∶11.61836水平A菌种比例B接种量/%C白砂糖添加量/%D发酵时间/h 315∶11.72248

1.3.3 品质指标测定

参照文献[14]的方法,采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量。以没食子酸为标准品绘制标准曲线,标准曲线方程为y=0.090 9x+0.089 6(R2=0.999),结果以没食子酸当量表示,单位为µg/mL。

参照文献[15]的方法,采用NaNO2-Al(NO3)3法测定总黄酮含量。以芦丁为标准品绘制标准曲线,标准曲线方程为y=0.009 2x+0.051 6(R2=0.999 1)。结果以芦丁当量表示,单位为µg/mL。

参考SOD试剂盒说明书测定SOD活力。

由10名经过培训的实验室工作人员(5名女性、5名男性)组成感官评价小组,从色泽、组织状态、口感、气味4个维度进行感官评价,满分100分,感官评价标准见表2。

表2 库尔勒香梨酵素感官评价标准
Table2 Sensory scoring criteria for Korla fragrant pear Jiaosu

色泽酵素液呈棕黄色,颜色较均匀,光泽稍淡10~14酵素液呈浅棕色,颜色不均匀,光泽暗淡0~9组织状态酵素液浊度较均匀,瓶底有少量絮状沉淀10~14酵素液浊度不均匀,瓶底有大量絮状沉淀0~9口感细腻柔和,酸度适口15~25口感粗糙酸涩0~9气味清甜,香梨气味明显15~25气味气味稍淡,香梨气味不明显10~14项目标准评分酵素液呈淡黄色,颜色均匀,有光泽15~25酵素液浊度均匀无杂质,瓶底无絮状沉淀15~25口感口感较细腻柔和,略酸涩10~14气味刺鼻,无香梨气味0~9

1.3.4 综合评分指标测定

以总酚质量浓度、总黄酮质量浓度、SOD活力与感官评分为评价指标,按2∶2∶2∶4的权重分配构建综合评分体系。综合评分=((总酚质量浓度/最高总酚质量浓度)×0.2+(总黄酮质量浓度/最高总黄酮质量浓度)× 0.2+(SOD活力/最高SOD活力)×0.2+(感官评分/最高感官评分)×0.4)×100[16]。

1.3.5 库尔勒香梨酵素抗炎性肠病作用评估

1.3.5.1 分组及给药

取按最优工艺条件制备的库尔勒香梨酵素液与未经接种发酵的库尔勒香梨原液,分别进行冷冻干燥(冷冻温度-20 ℃、真空度10~20 Pa、冷阱温度-45 ℃)[17],干燥至恒质量,得冻干粉用于动物实验。

成年斑马鱼适应性饲养一周后以每组12尾分为正常对照组(C组)、模型组(M组)、库尔勒香梨未发酵原液组(PFS组,40 µg/mL)、库尔勒香梨酵素组(PYE组,40 µg/mL)、泼尼松阳性组(PRED组,40 µg/mL), 各组间体质量差异不显著(P>0.05)。除C组外,各组均以180 µg/mL三卡因溶液浸泡麻醉至停止活动后,将鱼体腹面朝上置于湿润海绵槽中,在体视显微镜下以微量注射器按1.5 µL/g体质量由肛门向直肠内注射200 µg/mL TNBS溶液,以此构建炎性肠病斑马鱼模型,C组斑马鱼接受等量磷酸盐缓冲液直肠注射。注射完成后将斑马鱼放回养殖缸,稳定8 h后,根据各组用药方案按照1.5 µL/g分别给药,每隔24 h给药一次,连续给药72 h。

1.3.5.2 肠道组织结构观察

完成给药周期后,将各组斑马鱼以180 µg/mL三卡因溶液浸泡麻醉后处死,解剖分离其结肠段后1/2处样本,经Bouin’s固定液固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明处理后进行石蜡包埋。切取5 µm厚石蜡组织切片,以梯度乙醇水化后分别进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色及AB-PAS染色,中性树胶封片后于显微镜下观察并记录肠道组织形态。

1.3.5.3 免疫指标及炎症因子检测

取1.3.5.2节解剖所得剩余肠组织,分别精密称定后置于1 mL离心管中,加入适量生理盐水后加研磨珠,置于低温组织研磨机中,4 ℃、12 000 r/min研磨10 min获得组织匀浆,参照ELISA试剂盒说明书,取经4 ℃、4 000 r/min离心15 min的组织匀浆上清液,分别对免疫指标(IgM、IgT)和炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)表达水平进行测定,各样本均进行3次平行实验。

1.4 数据处理

采用SPSS 26.0软件进行数据分析,实验数据均以x±s表示。采用Minitab 17.0软件对结果进行分析;采用Excel 2021软件绘图。采用单因素方差分析比较各组间差异,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 库尔勒香梨酵素发酵工艺优化单因素试验结果

2.1.1 菌种比例的选择

由图1可知,随着菌种(植物乳植杆菌∶酿酒酵母)比例的升高,库尔勒香梨酵素综合评分呈先上升后下降的趋势;当菌种比例为10∶1时,总酚、总黄酮质量浓度及感官评分达最优,分别达331.31、258.70 μg/mL和90.62分,综合评分达到最高(88.29),在此条件下,SOD活力为1 259.89 U/mL。此时,两菌代谢达到良好协同:酿酒酵母消耗氧气、产生乙醇,为植物乳植杆菌创造厌氧环境并贡献酯香前体;植物乳植杆菌降低pH值、抑制杂菌,同时促进酯化反应,提升风味协调性[18]。当菌种比例升至15∶1时,SOD活力达最高(1 960.30 U/mL);可能是随着植物乳植杆菌比例的增加,SOD作为胞内酶,通过微生物的细胞裂解而充分释放,SOD活力明显升高[19]。菌种比例直接决定发酵微生态平衡,影响溶氧动态变化与目标产物扩散速率,对发酵效率及品质稳定性至关重要[20]。因此,综合考量抗氧化物质含量及感官品质,确定最适植物乳植杆菌∶酿酒酵母为10∶1。

图1 菌种比例对混菌发酵库尔勒香梨酵素综合评分的影响
Fig.1 Effects of strain mixing ratios on comprehensive evaluation scores of Korla fragrant pear Jiaosu via mixed-culture fermentation

2.1.2 接种量的选择

由图2可知,随着接种量由1.4%升高至1.8%,库尔勒香梨酵素综合评分呈先上升后下降的趋势;当接种量低于1.6%时,发酵产物积累尚少;随着接种量的增加,总酚、总黄酮质量浓度及感官评分、SOD活力均上升;当接种量为1.6%时,总酚、总黄酮质量浓度及感官评分、SOD活力升至峰值,分别达320.06、278.42 μg/mL及95.28分、1 074.44 U/mL,此时综合评分达到最高(89.00)。当接种量大于1.6%时,发酵菌密度过高而出现竞争性抑制[21],抗氧化活性物质含量及感官评分有所下降。因此,确定最适接种量为1.6%。

图2 接种量对混菌发酵库尔勒香梨酵素综合评分的影响
Fig.2 Effects of total inoculum dosages on comprehensive evaluation scores of Korla fragrant pear Jiaosu via mixed-culture fermentation

2.1.3 白砂糖添加量的选择

由图3可知,随着白砂糖添加量由10%升高至26%,库尔勒香梨酵素综合评分呈先升后降趋势。当白砂糖添加量为10%时,总酚质量浓度最高,为331.57 μg/mL,可能是该糖浓度下渗透压相对较低,有利于胞内酚类物质释放[22],但此时发酵底物不足,产酸产香有限;当白砂糖添加量为18%时,感官评分、SOD活力达最高,分别为96.07分、1 071.26 U/mL,此时综合评分达到最高(88.13)。在此条件下,总酚、总黄酮质量浓度分别为311.98、268.35 μg/mL。混菌体系获得充足的发酵底物,保证植物乳植杆菌与酿酒酵母的正常增殖与代谢[23],生成适量的乳酸、乙醇及酯类物质,产品风味协调。当白砂糖添加量为22%时,总黄酮质量浓度达最高(291.74 μg/mL),但高糖环境抑制微生物生长[24],SOD活力与感官评分均有所下降。因此,确定最适白砂糖添加量为18%。

图3 白砂糖添加量对混菌发酵库尔勒香梨酵素综合评分的影响
Fig.3 Effects of sugar additions on comprehensive evaluation scores of Korla fragrant pear Jiaosu via mixed-culture fermentation

2.1.4 发酵时间的选择

由图4可知,随着发酵时间由12 h延长至60 h,酵素综合评分呈先升后降趋势。当发酵时间为24 h时,菌体快速增殖,氧化应激诱导SOD大量合成[25],SOD活力达最高(1 207.39 U/mL),但发酵时间不足,结合态多酚、黄酮等物质未充分溶出,风味物质积累不足,感官与综合品质偏低。当发酵时间为36 h时,总酚、总黄酮质量浓度及感官评分达最高,分别为316.06、271.57 μg/mL和95.28分, 综合评分达到最高(88.38)。在此条件下,SOD活力为1 055.60 U/mL。此时,植物乳植杆菌与酿酒酵母代谢趋于平衡,多酚、黄酮类抗氧化物质充分溶出,乳酸与乙醇协同酯化生成果香物质[6]。当发酵时间大于36 h后,碳氮耗竭使酚类发生降解,有机酸过量积累导致感官评分持续降低[26]。因此,确定最适发酵时间为36 h。

图4 发酵时间对混菌发酵库尔勒香梨酵素综合评分的影响
Fig.4 Effects of fermentation durations on comprehensive evaluation scores of Korla fragrant pear Jiaosu via mixed-culture fermentation

2.2 库尔勒香梨酵素发酵工艺优化响应面试验结果

2.2.1 响应面试验结果

以菌种比例(A)、接种量(B)、白砂糖添加量(C)、发酵时间(D)为自变量,以综合评分(Y)为响应值,采用4因素3水平Box-Behnken响应面试验设计优化混菌发酵工艺条件,试验设计及结果见表3,方差分析见表4。

表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table3 Box-Behnken design and results

试验号A菌种比例B接种量/%C白砂糖添加量/%D发酵时间/h综合评分35∶11.7183672.32610∶11.6222485.77710∶11.6144879.83810∶11.6224881.0395∶11.6182477.121310∶11.5143681.091410∶11.7143675.321510∶11.5223683.091610∶11.7223681.89175∶11.6143676.35195∶11.6223682.712015∶11.6223686.272210∶11.7182481.432310∶11.5184879.692510∶11.6183692.892610∶11.6183693.5615∶11.5183678.68215∶11.5183681.06415∶11.7183682.03510∶11.6142480.071015∶11.6182485.36115∶11.6184877.451215∶11.6184880.321815∶11.6143682.392110∶11.5182483.322410∶11.7184875.342710∶11.6183692.37

表4 回归模型方差分析
Table4 Analysis of variance for the regression model

方差来源平方和自由度均方FP显著性模型685.281448.9555.87<0.000 1**A89.65189.65102.34<0.000 1**B28.83128.8332.91<0.000 1**C55.08155.0862.88<0.000 1**D31.40131.4035.84<0.000 1**AB13.43113.4315.330.002 1**AC1.5411.541.760.209 9 AD7.2117.218.230.014 1*BC5.2215.225.960.031 1*BD1.5111.511.730.213 4 CD5.0615.065.780.033 3*A2234.171234.17267.30<0.000 1**B2298.101298.10340.28<0.000 1**C 2128.451128.45146.62<0.000 1**D 2194.731194.73222.28<0.000 1**残差10.51120.876 0失拟项9.80100.980 12.750.295 7纯误差0.711820.355 9总计695.7926

注:*.影响显著(P<0.05);**.影响极显著(P<0.01)。

利用Design-Expert 10.0.8软件对数据进行多元回归拟合,得到二元多项式回归方程为:Y=92.94+2.73A-1.55B+2.14C-1.62D+1.83AB-0.62AC-1.34AD+1.14BC-0.615BD-1.13CD-6.63A2-7.48B2-4.91C2-6.04D2。

由表4可知,回归模型极显著(P<0.000 1),而失拟项不显著(P>0.05),模型决定系数R2=0.984 9,调整决定系数,说明有96.73%的响应值变化可以通过该模型进行解释,表明回归模型拟合度较佳,可用于预测库尔勒香梨酵素制备工艺。由F值可知,影响库尔勒香梨酵素综合评分的因素从高到低排序为:菌种比例(A)>白砂糖添加量(C)>发酵时间(D)> 接种量(B)。

2.2.2 因素交互作用分析

由图5可知,在相应的因素范围内,4组因素交互项对综合评分均存在响应极值,响应曲面整体表现为自中心区域向四周逐步降低的趋势。菌种比例及接种量的交互作用AB对综合评分影响较大,其他3组交互作用(AD、BC和CD)对综合评分也表现出一定的影响。这与方差分析结果一致。

图5 各因素交互作用对混菌发酵库尔勒香梨酵素综合评分影响的响应曲面和等高线图
Fig.5 Response surface and contour plots illustrating interactive effects of various factors on comprehensive evaluation scores of mixedculture fermented Korla fragrant pear Jiaosu

2.2.3 验证实验

采用Design-Expert 10.0.8软件对回归方程进行解析,最佳发酵工艺条件为:菌种比例11.04∶1、接种量1.60%、白砂糖添加量18.67%、发酵时间34.44 h。在此优化条件下,综合评分预测值为93.59。为方便实际操作,将发酵工艺条件调整为:菌种比例11∶1、接种量1.6%、白砂糖添加量19%、发酵时间34 h,经过3次重复实验,库尔勒香梨酵素总酚、总黄酮质量浓度分别为327.39、262.75 μg/mL,SOD活力为1 307 U/mL,感官评分为95.45分,综合评分实际值为93.2,与预测值接近,表明该模型具备预测与实践可行性。

2.3 库尔勒香梨酵素发酵前后品质分析

由表5可知,库尔勒香梨酵素发酵前的总酚、总黄酮质量浓度及SOD活力、感官评分分别由181.61、134.49 μg/mL及635.68 U/mL、80.58分显著增加至327.39、262.75 μg/mL及1 307.00 U/mL、95.45分。发酵过程中微生物分泌各类水解酶,可切断原料中酚类、黄酮组分与大分子物质相连的糖苷键,将结合态活性物质转化为可溶性游离形态;同时微生物代谢破坏梨果肉细胞壁,胞内束缚的酚酸、黄酮类物质大量溶出[27],使体系中活性酚类组分大量积累。混菌发酵生成的小分子有机酸、还原类代谢物可协同提升体系抗氧化酶活性 水平[28],强化体系抗氧化能力。发酵降解梨中青涩、收敛类单宁物质,弱化生梨酸涩刺激感;同时植物乳植杆菌与酿酒酵母协同代谢生成酯类、醛类等风味物质,风味层次更加协调,感官品质大幅提升。综上,混菌发酵可提高酵素品质。

表5 库尔勒香梨酵素发酵前后品质指标变化
Table5 Variations in quality parameters of Korla fragrant pear Jiaosu before and after mixed-culture fermentation

指标发酵前发酵后总酚质量浓度/(μg/mL)181.61±1.91b327.39±4.52a总黄酮质量浓度/(μg/mL)134.49±2.11b262.75±3.74a SOD活力/(U/mL)635.68±7.14b1 307.00±11.63a感官评分80.58±1.29b95.45±2.12a

注:同行小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.4 库尔勒香梨酵素对炎性肠病斑马鱼肠道组织结构的影响

由图6A可知,与C组相比,M组斑马鱼肠组织出现较显著的炎症浸润情况,并伴有绒毛结构损伤及肠上皮细胞排列紊乱等典型肠道损伤特征;PFS组肠道绒毛结构较M组有所恢复,但局部仍存在绒毛融合、炎性细胞浸润等损伤残留;而PYE组和PRED组肠组织隐窝结构均得到恢复,炎症浸润程度显著降低,肠道结构基本恢复正常。由图6B和表6可知,M组和PFS组经TNBS诱导后,被染为蓝色的酸性黏蛋白比例较C组明显降低,颜色深度也较C组明显降低,杯状细胞亦明显减少,接受给药后的PYE组和PRED组均表现为酸性黏蛋白区域染色深、面积占比明显增加、杯状细胞数出现恢复趋势。因此,库尔勒香梨酵素可通过减轻肠道炎症、修复组织结构与黏膜屏障,有效缓解斑马鱼炎性肠病。

图6 炎性肠病斑马鱼肠道组织HE染色(A)与AB-PAS染色(B)
Fig.6 Hematoxylin-eosin (A) and Alcian blueriodic acid-Schiff (AB-PAS) (B) staining of intestinal tissues of IBD zebrafish

表6 炎性肠病斑马鱼肠道AB-PAS染色结果中酸性黏蛋白面积占比
Table6 Relative area ratios of acidic mucins in intestinal tissues of IBD zebrafish determined by AB-PAS staining

组别酸性黏蛋白面积占比/%C8.52±0.17 M2.56±0.12#PFS2.24±0.25 PYE6.39±0.19**PRED6.82±0.15**

注:#.与C组比较,差异显著(P<0.05);**.与M组比较,差异极显著(P<0.01)。表7同。

2.5 库尔勒香梨酵素对炎性肠病斑马鱼肠道免疫指标及炎症因子的影响

由表7可知,M组免疫指标IgM、IgT较C组显著降低(P<0.05);而相较于M组,PYE组和PRED组IgM、IgT均显著增加(P<0.05、P<0.01),PFS组差异不显著(P>0.05);相比C组,M组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著提升(P<0.05);PYE组和PRED组均显著低于M组(P<0.05、P<0.01),PFS组与M组差异不显著(P>0.05)。这表明未发酵原液对斑马鱼炎性肠病无明显改善作用,一方面可能因其缺少发酵产生的短链脂肪酸等代谢产物[29];另一方面,未发酵原液中的酚酸、黄酮等多为结合态糖苷且被细胞壁所包裹,生物利用度低,发酵酶解使其转化为游离态苷元,故PFS组有效活性物质游离态水平远低于PYE组。由此可见,发酵工艺对库尔勒香梨发挥肠道抗炎功效起关键作用:一方面可能源于发酵菌产生多种功能性代谢产物,通过调节免疫相关因子、改善肠道紧密连接蛋白表达等途径修复肠道屏障损伤[30];另一方面发酵提升酚类物质含量,通过上调IgM等免疫球蛋白表达水平调控肠道黏膜免疫[31],因此,未发酵原液改善作用有限,而发酵对库尔勒香梨酵素发挥抗炎免疫作用具有关键作用。

表7 炎性肠病斑马鱼免疫指标及炎症因子表达水平
Table7 Immune indices and expression levels of proinflammatory cytokines in IBD zebrafish

(µg/mL)(µg/mL)(pg/mL)(pg/mL)(pg/mL)C22.11±1.981.58±0.1026.20±2.61397.26±30.5710.69±1.43 PYE16.12±1.72*1.33±0.08**35.84±2.38**490.21±20.11*19.63±2.04**组别IgM质量浓度/IgT质量浓度/IL-1β质量浓度/IL-6质量浓度/TNF-α质量浓度/M13.81±0.89#1.11±0.08#43.62±2.46#538.01±64.15#22.96±1.71#PFS14.01±0.751.13±0.0742.21±2.53521.05±52.1323.13±1.85 PRED20.61±1.69**1.71±0.12**30.34±3.18**416.07±20.59**11.64±1.65**

注:*.与M组比较,差异显著(P<0.05)。

3 结 论

本研究以库尔勒香梨为原料,以植物乳植杆菌与酿酒酵母为发酵菌种,制备库尔勒香梨酵素。通过单因素试验及响应面法优化发酵工艺条件,并探究库尔勒香梨酵素对斑马鱼炎性肠病的改善作用。结果表明,库尔勒香梨酵素最佳发酵条件为:植物乳植杆菌与酿酒酵母比例(11∶1)、接种量1.6%、白砂糖添加量19%、发酵时间34 h,在此优化条件下,综合评分为93.2。动物实验结果表明,PYE组和PRED组均能增加炎性肠病斑马鱼肠道组织杯状细胞数量,恢复斑马鱼因炎性肠病受损肠道隐窝结构,提升免疫指标IgM、IgT表达水平,并降低炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达,从而有效缓解斑马鱼炎性肠病。本研究可为库尔勒香梨精深加工及资源化利用提供技术参考,也可为开发具有肠道健康调节功能的发酵产品奠定实验基础,对特色果蔬高值化利用具有重要的理论与应用价值。

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Preparation of Korla Fragrant Pear (Pyrus sinkiangensis Yü) Jiaosu and Its Ameliorative Effect on Inflammatory Bowel Disease in Zebrafish

GAO Xinran1, JIA Dongsheng1, HE Wanqing1, CUI Shizhan1, WANG Mingxue1, YANG Shaodong2, ZHAO Jiangli3,*

(1. Institute of Economic Crops, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050051, China;2. Korla Qinzhiyuan Biotechnology Co. Ltd., Korla 841008, China; 3. Institute of Biotechnology and Food Science,Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050051, China)

Abstract: Korla fragrant pear (Pyrus sinkiangensis Yü) Jiaosu was produced via mixed-culture fermentation using Lactiplantibacillus plantarum and Saccharomyces cerevisiae with Korla fragrant pear as raw material. Taking comprehensive evaluation score as assessment indicators, the fermentation conditions were optimized by single-factor experiment combined with response surface methodology. A 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid-induced zebrafish inflammatory bowel disease (IBD) model was established to evaluate the effects of raw unfermented pear juice (PFS group), Korla fragrant pear Jiaosu (PYE group), and positive control prednisone (PRED group) on intestinal histology, immune markers, and proinflammatory cytokine levels of IBD zebrafish. The results demonstrated that the optimal fermentation parameters were an inoculation ratio of L. plantarum to S. cerevisiae 11:1, a total inoculum 1.6%, sucrose addition 19%, and fermentation duration 34 h, under which the comprehensive evaluation score reached 93.2. Animal experimental results showed that both groups, PYE and PRED, could effectively increase the number of goblet cells in intestinal tissues, restore damaged intestinal crypt architecture, upregulate the expression of immunoglobulins M and T, and downregulate the levels of inflammatory factors tumor necrosis factor α, interleukin 6, and interleukin 1β in IBD zebrafish. In summary, Korla fragrant pear Jiaosu can effectively alleviate intestinal mucosal injury and suppress the overexpression of proinflammatory cytokines in zebrafish,presenting evident anti-inflammatory activity.

Keywords: Korla fragrant pear Jiaosu; process optimization; mixed-culture fermentation; zebrafish; inflammatory bowel disease; anti-inflammation

收稿日期:2026-03-11

基金项目: 新疆维吾尔自治区重点研发任务专项(2023B02019-3)

第一作者简介: 高新然(2004—)(ORCID: 0009-0002-9182-682X),女,本科生,研究方向为发酵食品。E-mail: 15690505830@163.com

*通信作者简介: 赵江丽(1981—)(ORCID: 0000-0001-8775-2202),女,高级工程师,博士,研究方向为果品营养与加工。E-mail: 434856680@qq.com

DOI: 10.11882/j.issn.0254-5071.2026.08.018

中图分类号:TS255.44;Q95-33

文献标志码:A

文章编号:0254-5071(2026)08-0157-08

引文格式:高新然, 贾东升, 何婉清, 等. 库尔勒香梨酵素制备及对斑马鱼炎性肠病的改善作用[J]. 中国酿造, 2026, 45(8): 157-164.DOI: 10.11882/j.issn.0254-5071.2026.08.018. http://www.chinabrewing.net.cn

GAO Xinran, JIA Dongsheng, HE Wanqing, et al. Preparation of Korla fragrant pear (Pyrus sinkiangensis Yü) Jiaosu and its ameliorative effect on inflammatory bowel disease in zebrafish[J]. China Brewing, 2026, 45(8): 157-164. (in Chinese with English abstract) DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.08.018. http://www.chinabrewing.net.cn