发酵蔬菜是我国传统发酵食品的典型代表，以其鲜嫩脆爽、风味独特、香气宜人而广受欢迎，并被认为具有解腻开胃、助消化等功能[1]。发酵是辣椒最常见的加工方式之一，可赋予辣椒独特的风味，具有非常重要的经济价值，仅云南省2018年发酵辣椒的市场价值就高达150亿美元[2]。剁辣椒是以新鲜红辣椒为主要原料，经去蒂、清洗、剁碎后添加食盐等辅料，在自然条件下经微生物发酵而成的一种传统发酵辣椒制品，是发酵辣椒中最具代表性的种类之一。其发酵过程中，乳酸菌、酵母菌等微生物共同作用，形成剁辣椒特有的酸香风味。该产品具有鲜辣爽口、风味柔和、营养保存较完整等特点，深受消费者欢迎[3]。
传统发酵辣椒的品质形成依赖于复杂微生物群落的协同代谢，核心类群涵盖乳酸菌、酵母菌、霉菌等[4]。乳酸菌作为发酵过程中的优势菌群，通过代谢产生乳酸等有机酸构建低酸环境，抑制杂菌生长，同时赋予产品基础酸味与营养特性[5]；但自然发酵存在周期长、品质不稳定、亚硝酸盐残留、风味单一等问题，制约了产业的标准化发展[6]。近年研究揭示，酵母菌作为发酵系统的关键功能成员，可通过与乳酸菌的协同或竞争作用调控发酵进程与产物分布[7]：一方面，酵母菌代谢产生酯类、醇类、酮类等风味物质，能有效丰富发酵辣椒的香气层次，如颜宇鸽[8]采用产香酵母与植物乳植杆菌混合发酵辣椒酱，发现产品中酯类、醇类、酮类物质含量显著提升，赋予其浓郁的果香与花香；另一方面，酵母菌可通过同化利用乳酸进而缓解乳酸菌过度产酸等方式调节发酵体系酸度，避免pH值过低，从而改善产品口感与风味协调性，如李佳芯等[9]研究证实，异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）与乳酸菌协同发酵酸菜，可抑制乳酸菌过度产酸，同时提升产品硬度与总酯含量。此外，发酵过程中微生物代谢产生的酚类、维生素等生物活性物质，还能进一步提升发酵辣椒的营养价值[10-11]。目前，酵母菌与乳酸菌的协同作用虽已初步展现出改善发酵蔬菜风味与品质的潜力，但相关成果多集中于模式菌株或单一发酵体系，针对辣椒这一特定基质，复合发酵对其品质影响研究较为缺乏，适配该基质的专用复合发酵剂开发也尚未形成系统化研究体系。
为提升发酵剁辣椒品质，本研究以自然发酵剁辣椒、芥菜为菌种分离来源，定向筛选兼具耐酸、耐盐、耐乙醇性能，且具有优良产香、产酯能力的酵母菌。在此基础上，将所筛酵母菌与实验室前期获得的优质乳酸菌组合进行复配，构建酵母-乳酸菌复合发酵体系，并应用于剁辣椒发酵，以期开发适用于辣椒发酵的专用复合发酵剂，从而为生产风味协调、营养丰富的高品质发酵辣椒提供菌种资源与工艺依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红线椒 市购；自然发酵芥菜 湖南国泰食品有限公司。
无水乙醇、甘油、琼脂、酚酞、氯化钠、氢氧化钠、乳酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）琼脂培养基 青岛海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
SQ810C自动高压蒸汽灭菌器 重庆雅马拓科技有限公司；HCB-1300V超净工作台 青岛海尔生物医疗股份有限公司；UV-1801紫外-可见分光光度计 北京北分瑞利分析仪器（集团）有限责任公司；SPL250生化培养箱 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；CX31光学显微镜 奥林巴斯（中国）有限公司；Bante920实验室pH计 上海般特仪器制造有限公司；SW-2FD涡旋振荡器 美国赛默飞世尔科技有限公司；8890-7250全二维气相色谱-飞行时间质谱仪 美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 剁辣椒制备
选取新鲜、无破损、无腐烂红线椒，经去蒂、清洗后充分沥干表面水分，剁碎后按其质量的8%添加食盐并充分拌匀，随后装入发酵容器中，以液封方式隔绝空气，室温下自然发酵。
1.3.2 酵母菌分离与纯化
分别称取10 g发酵芥菜与剁辣椒样品，加入无菌生理盐水，充分振荡、洗脱以获得菌悬液。菌悬液经梯度稀释后涂布于YPD平板，28 ℃培养3 d。挑取典型酵母菌落，经多次划线纯化获得纯菌株，并于-80 ℃甘油保藏。
1.3.3 酵母菌筛选
1.3.3.1 产香能力测定
通过涂布法将酵母菌接种于YPD固体培养基，28 ℃培养3 d后进行感官评定。采用嗅闻法对酵母菌产香能力进行初步测定，感官评定标准参考宋新燕[12]的方法并稍作改动，如表1所示。
表1 筛选酵母菌株感官评定标准
Table1 Sensory evaluation criteria for screened yeast strains
评定标准香气强度评分甜酒香、酯香、醇香或其他香气浓郁，且持久性好80～90甜酒香、酯香、醇香或其他香气一般，且持久性一般70～79甜酒香、酯香、醇香或其他香气微弱，且持久性较差60～69培养基味或产生其他异味≤60
1.3.3.2 产酯能力测定
参照GB/T 10345—2022《白酒分析方法》测定酵母菌产酯能力。
1.3.3.3 产气能力测定
采用杜氏管发酵法[13]，取-80 ℃甘油保藏酵母菌液100 μL，接种于装有10 mL YPD液体培养基的试管中，28 ℃活化24 h，将菌液按1%（体积分数）接种量接入含杜氏小管的YPD培养基中，28 ℃培养48 h，仔细观察并记录24、48 h时杜氏小管产气情况，比较各菌株发酵能力。
1.3.4 酵母菌的耐受性研究
1.3.4.1 耐酸性测定
将活化后的酵母菌液按1%接种量分别接种于pH 3.0、 3.5、4.0、4.5、5.0的YPD液体培养基中，28 ℃培养48 h，测定发酵液OD600 nm值。
1.3.4.2 耐盐性测定
将活化后的酵母菌液按1%接种量分别接种至NaCl质量浓度为2、4、6、8、10 g/100 mL的YPD液体培养基中，28 ℃培养48 h，测定发酵液OD600 nm值。
1.3.4.3 乙醇耐受性测定
将活化后的酵母菌液按1%接种量分别接种于乙醇体积分数2%、4%、6%、8%、10%的YPD液体培养基中，28 ℃培养48 h，测定发酵液OD600 nm值。
1.3.5 酵母菌鉴定
将纯化后的酵母菌株划线于YPD平板，28 ℃培养2 d，观察并记录其菌落形态特征。将平板培养物委托武汉自然之力生物科技有限公司进行26S rDNA测序。将获得的序列在NCBI GenBank数据库中进行比对，构建系统发育树，分析菌株同源性并确定其分类学地位。
1.3.6 酵母菌与乳酸菌拮抗性分析
采用琼脂扩散法（牛津杯法）分析酵母菌X1与乳酸菌组合Q（植物乳杆菌H3D、短乳杆菌T216、魏斯氏菌T244和戊糖片球菌206）及乳酸菌组合Y（戊糖乳杆菌6d-16、戊糖片球菌6-12、植物乳杆菌H3D）的拮抗性[14]。将酵母菌作为指示菌混入培养基后，分别加入200 μL乳酸菌发酵液，培养24 h后通过观察抑菌圈的有无判断拮抗作用。
1.3.7 酵母菌与乳酸菌混合发酵
1.3.7.1 发酵菌种组合筛选
为探究酵母菌与乳酸菌复合菌系对剁辣椒风味品质的提升作用并筛选最优发酵组合，设置以下5组：自然发酵（ZR，空白对照）；乳酸菌组合Y单独发酵（YS）、乳酸菌组合Q单菌发酵（QS）、酵母菌X1与乳酸菌组合Y复配发酵（YM）、酵母菌X1与乳酸菌组合Q复配发酵（QM）。将处理好的辣椒与8%（m/m）食盐混匀，YM、QM组按0.1%（m/m）接种量分别加入酵母菌X1和乳酸菌菌粉（总接种量0.2%），YS、QS组则接种0.2%对应乳酸菌，所有样品于室温下发酵7 d。发酵结束后，分析发酵剁辣椒理化指标、感官品质及挥发性风味物质，综合评定以确定最优复合发酵组合。
1.3.7.2 理化指标测定
总酸含量参照GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》进行测定。氨基酸态氮含量依据GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》进行测定。
1.3.7.3 挥发性成分测定
挥发性成分的测定采用全二维气相色谱-飞行时间质谱仪，参考Liu Yuan等[15]的方法稍作修改。色谱条件：一维色谱柱为HP-5ms Ultra Inert毛细管柱（15.0 m×0.25 mm，0.25 μm），二维色谱柱为Rxi-17 Sil MS毛细管柱（21.97 m×250 μm，0.25 μm）。载气为高纯（99.99%）氦气，流速1.0 mL/min。进样口温度250 ℃，分流进样。柱温箱程序升温条件：初始温度50 ℃，以4 ℃/min升至80 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min升至240 ℃，保持4 min。质谱条件：离子源温度200 ℃，电子电离能量70 eV，质量扫描范围m/z 45～350。
采用内标法进行定量分析，以2-辛醇作为内标物质，目标香气成分含量按式（1）计算：
1.3.7.4 感官评定
感官评定小组由12名具有感官分析经验的评价员组成。为减少主观偏差，所有样品均分装于透明一次性品评杯中，并采用3位随机数编号进行盲评。参照文亚诗等[16] 建立的方法并稍作修改，制定感官评价标准，如表2所示，从色泽、组织形态、脆度、滋味和香气5个维度对剁辣椒样品进行综合评价。
表2 发酵剁辣椒感官评价标准
Table2 Sensory evaluation criteria for fermented chopped chili pepper
色泽（20）组织形态（20）脆度（20）滋味（20）香气（20）感官评分色泽红艳不发暗椒块完整性好，质地脆，味道鲜美、发酵香味较轮廓清晰，饱满咀嚼性好柔和，无异味浓郁，无异味，16～20香气协调性好色泽相对较红，椒块完整性较质地较脆，味道较鲜美、发酵香味较不发暗好，轮廓较清浓郁，无异味，11～15晰，饱满咀嚼性较好柔和，无异味香气协调性较好色泽相对较红，椒块完整性一质地稍有脆感，味道一般，发酵香味淡，稍暗般，轮廓较模有异味，气味6～10糊，稍松软咀嚼性一般无异味协调性较差色泽发暗椒块无完整性，质地无脆感，味道较差，无发酵香味，轮廓模糊，松软咀嚼性差有明显异味有异味，气味0～5协调性差
1.3.7.5 品质综合评价
产品品质综合评价参照袁佳[17]建立的加权综合评价法并稍作修改。通过对各项关键品质指标进行加权计算获得综合得分（y），具体按式（2）计算：
式中：x1表示总酸质量分数/%；x1max表示总酸质量分数最大值/%；x2表示感官评分；x2max表示感官评分最大值；x3表示氨基酸态氮质量分数/%；x3max表示氨基酸态氮质量分数最大值/%；x4表示总酯含量/（mg/g）；x4max表 示总酯含量最大值/（mg/g）。
1.4 数据处理
所有实验均独立重复3次，数据以x±s表示。采用Excel 2016进行数据整理与初步计算，采用Origin 2024完成图表绘制。利用MEGA 6.0软件基于特定基因序列构建系统发育树。采用SIMCA软件进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），并通过SPSS Statistics 26软件进行单因素方差分析，P＜0.05表示具有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 酵母菌筛选
从发酵剁辣椒和发酵芥菜中共分离纯化出21株菌株。形态学观察显示，多数菌株呈乳白色或淡黄色，表面光滑或略微皱褶，边缘整齐，部分菌株可形成明显的菌落突起。镜检观察显示，其细胞形态多为圆形或椭圆形，符合典型酵母菌的细胞特征。
2.1.1 产香能力
由表3可知，筛选所得菌株均能产生挥发性香气，但其香气强度评分存在明显差异。其中，菌株X1、X5、X8和X12能产生浓郁的甜酒香、酯香或醇香，且香气持久性良好；菌株B2有较浓郁的香气；而菌株C6与C8的香气强度相对较弱。基于上述结果，本研究筛选出产香能力突出的7株菌（X1、X5、X8、X12、C6、C8、B2）用于后续实验。
表3 不同菌株产香能力
Table3 Aroma-producing capacity of different strains
发酵芥菜X190发酵芥菜X1290发酵芥菜X590剁辣椒C480发酵芥菜X680剁辣椒C580发酵芥菜X975剁辣椒C885发酵芥菜X1075剁辣椒B285发酵芥菜X1180分离源菌株编号香气强度评分分离源菌株编号香气强度评分发酵芥菜X280剁辣椒C180发酵芥菜X380剁辣椒C280发酵芥菜X480剁辣椒C380发酵芥菜X770剁辣椒C685发酵芥菜X890剁辣椒C780
2.1.2 产酯能力
酯类物质是组成发酵风味的关键成分，多数产香酵母在代谢过程中可合成具有果香特征的酯类化合物，对产品香气组成与品质具有重要影响[18]。如表4所示，X1、B2、C6产酯能力较优，总酯质量浓度分别为1.48、1.14、1.03 g/L。
表4 不同菌株产气及产酯能力
Table4 Gas and ester-producing capacities of different strains
X50.88±0.04 d+++C61.03±0.04bc++C80.92±0.22cd++菌株编号总酯质量浓度/（g/L）产气能力X11.48±0.08a++++X80.94±0.06cd++++X120.95±0.02cd++++B21.14±0.07b+++
注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05），表5同。++、+++、++++.分别表示产气达到杜氏小管体积的1/2、3/4、全部。
2.1.3 产气能力
杜氏小管中产气能力可作为评估酵母菌株发酵速率的指标。由表4可知，不同菌株间产气能力存在明显差异：X1、X8和X12在48 h内气体充满杜氏小管，表明其发酵速率较快；X5与B2产气量约为小管容积的3/4，发酵速率中等；而C6和C8产气量约为1/2，发酵速率较为缓慢。
2.2 酵母菌耐受性
2.2.1 耐酸性
酵母菌的耐酸性对其在发酵体系中的生存与功能发挥至关重要。在辣椒等蔬菜的乳酸发酵过程中，乳酸菌作为优势菌群会产生大量乳酸，导致体系pH值下降至3.2～3.6[19]。该酸性环境会显著抑制酵母菌生长，进而影响其发酵能力[20]。因此，筛选耐酸性优良的酵母菌株是保障发酵过程顺利进行的关键。如图1A所示，在 pH 3.0～3.5的强酸条件下，所有菌株的生长均受到明显抑制，其中X1表现出相对较强的耐受性。当pH≥4.0时，各菌株均能良好生长，且X1的OD600 nm值始终高于其他菌株，表明其在测试菌株中具有最优的耐酸性能。
图1 不同菌株的耐酸性（A）、耐盐性（B）及乙醇耐受性（C）
Fig.1 Acid tolerance (A), salt tolerance (B) and ethanol tolerance (C) of different strains
2.2.2 耐盐性
在蔬菜发酵过程中，酵母菌常面临高盐胁迫[21]，酵母菌的耐盐性直接影响其发酵性能，耐盐性差的菌株易导致发酵启动缓慢，甚至提前终止发酵过程。如图1B所示，在2 g/100 mL NaCl的低盐条件下，菌株X5和X8的OD600 nm值小于0.5，生长状况较差；而X1等其他5株菌 的OD600 nm值约为1.5，表现出相对良好的生长状态。随着NaCl质量浓度升高，各菌株活性整体呈下降趋势，但X1的OD600 nm值始终高于其他菌株，显示出更优的盐耐受性。
2.2.3 乙醇耐受性
在发酵过程中，乙醇的持续积累会对酵母细胞产生毒性作用，抑制其正常生长[22-23]，进而导致发酵的终止[24]。如图1C所示，当乙醇体积分数为2%时，除X5外的其余菌株均生长良好。随着乙醇含量升高，所有菌株的生长均受到不同程度的抑制，但X1的OD600 nm值始终高于其他菌株，表现出最优的乙醇耐受性。
2.3 菌株X1鉴定
菌株X1的菌落呈圆形、乳白色，中部凸起，表面光滑湿润（图2A）；镜检显示其细胞呈椭圆形，通过出芽方式进行繁殖，符合典型酵母菌的形态学特征（图2B）。基于26S rDNA序列比对表明，菌株X1与矮小莫奥德酵母（Maudiozyma humilis）的同源性高于99%，故鉴定该菌株为M. humilis。但是，由图2C可知，菌株X1与M. bulderi聚为一支，这主要由于公共数据库中M. humilis的高质量26S rDNA参考序列数量有限，且M. humilis与M. bulderi亲缘关系十分相近。该菌是一类常见的嗜酸酵母，多从酸面团发酵剂中分离得到[25]。
图2 菌株X1的菌落形态（A）、细胞形态（B）和系统发育树（C）
Fig.2 Colony morphology (A), cell morphology (B) and phylogenetic tree (C) of strain X1
2.4 酵母菌与乳酸菌拮抗性
酵母菌与乳酸菌之间是否存在拮抗作用，直接影响复合菌系的构建及其发酵性能。酵母菌X1与各乳酸菌的拮抗性检测结果表明，全部受试组合中，以各株酵母菌为指示菌时，牛津杯周边均无肉眼可见抑菌圈，菌体菌落未出现生长迟缓、菌落稀疏等受抑制特征。以上结果说明，酵母菌X1与各供试乳酸菌之间均不存在拮抗反应，表明其在生物学相容性方面适于复配使用，可作为后续构建复合发酵体系的基础菌株。
2.5 酵母菌与乳酸菌混合发酵对剁辣椒品质的影响
2.5.1 混合发酵对剁辣椒主要理化及感官品质的影响
乳酸菌与酵母菌的共培养体系在多种发酵食品（如葡萄酒、酱油、豆腐、面包等）中已被证实能够有效提升产品风味与整体品质[26]。如表5所示，不同菌种组合的发酵剁辣椒品质存在显著差异，其中YM组（酵母菌X1与乳酸菌组合Y）综合表现最优。该组合发酵产品总酸质量分数达0.86%、总酯含量为21.69 mg/g、氨基酸态氮质量分数为0.23%，感官评分为85.73，各项指标均显著优于其他处理组（P＜0.05），综合评分100.00，表明合理的菌种复配可有效改善剁辣椒的理化品质与感官特性。
表5 不同菌种组合发酵方式对发酵剁辣椒的影响
Table5 Effects of different strain‑combination fermentation modes on fermented chopped chili pepper
菌种总酸质量总酯含量/质量分数/%感官评分综合氨基酸态氮组合分数/%（mg/g）评分ZR0.69±0.01 d 14.99±0.32 d 0.15±0.01 d 77.90±1.65 d 74.17 YS0.74±0.03 b 16.16±0.75 c 0.16±0.01 c 81.19±2.01 b 79.80 QS0.70±0.10 cd 15.77±0.70 d 0.15±0.02 cd 79.40±0.91 bc 76.48 YM0.86±0.20 a 21.69±0.86 a 0.23±0.05 a 85.73±1.25 a 100.00 QM0.72±0.15bc17.08±0.15b0.19±0.04b82.63±0.87b83.80
2.5.2 挥发性风味物质组成解析
由表6可知，从5种不同菌种组合发酵剁辣椒中共鉴定出130种香气物质，包括37种酯类、27种醇类、25种烯类、24种烷烃类、3种醛类、3种酸类、5种酮类、5种酚类以及1种其他物质。其中，酵母菌和乳酸菌混合发酵组（YM组和QM组）分别检出67、58种 挥发性物质，单菌种发酵（YS组：60种，QS组：60种）。 此外，不同发酵组剁辣椒挥发性风味物质的组成与含量存在显著差异。自然发酵组（ZR）、乳酸菌单菌发酵组（YS、QS）及酵母菌与乳酸菌复配发酵组（YM、QM）的挥发性物质总含量分别为 （59.62±6.74）、（123.67±11.78）、（75.85±10.97）、 （658.39±56.67）、（337.79±32.05）μg/g，复配发酵组总含量明显高于单菌发酵与自然发酵组，其中YM组总含量最高，这与Shi Qiao等[27]研究中戊糖片球菌与罗丹尼假丝酵母复合发酵可显著提升发酵辣椒挥发性物质总含量的结论一致。
表6 不同菌种组合发酵方式下剁辣椒挥发性物质组成与含量
Table6 Composition and contents of volatile compounds in chopped chili pepper fermented by different strain combinations
ZRYSQSYMQM酯类乙酸苯乙酯0.30±0.090.93±0.257.91±2.1515.73±4.8717.00±5.31乙酸芳樟酯0.13±0.02NDND30.95±12.3440.6±11.35水杨酸甲酯5.00±2.4418.33±7.241.51±0.789.93±4.217.06±0.192-甲基丁酸-4-甲基戊酯0.33±0.080.23±0.110.28±0.113.74±1.332.30±0.203-甲基丁酸-4-甲基戊酯0.22±0.06ND0.14±0.041.05±0.101.25±0.744-甲基戊酸-4-甲基戊酯0.17±0.040.20±0.070.14±0.071.37±0.481.00±0.02亚油酸乙酯0.79±0.2614.62±5.310.48±0.2013.73±3.691.94±1.15十一烷酸乙酯NDNDND10.38±3.553.62±2.01月桂酸乙酯NDND0.25±0.100.77±0.222.77±1.08乙酸花生酯0.09±0.010.24±0.05NDNDND高水杨酸酯0.18±0.070.56±0.11NDNDND甲酸芳樟酯NDNDND57.17±21.24ND乙酸山嵛醇酯NDNDND1.37±0.33ND乙基-9,12,15-十八碳三烯酸酯NDNDNDND0.52±0.22乙酸异戊酯ND0.59±0.140.92±0.271.54±0.943.04±1.766-壬炔酸甲酯NDND0.13±0.02NDND壬酸乙酯ND0.32±0.070.30±0.112.27±1.41ND 8-甲基-6-壬烯酸异戊酯NDNDND2.11±0.99ND 13-甲基十四烷酸乙酯ND0.32±0.07ND4.60±2.17ND苯甲酸乙酯0.31±0.070.93±0.257.91±3.5515.73±3.6517.00±3.92乳酸丙酯0.28±0.11ND0.56±0.16ND2.84±1.20醇类1-戊醇ND0.34±0.100.28±0.114.39±2.18ND 1-己醇NDND0.60±0.317.08±2.961.92±0.73(S)-2-庚醇ND3.34±2.01ND1.88±0.74ND右旋2-戊醇ND0.75±0.23NDNDND苯乙醇6.02±3.180.33±0.066.01±2.17156.24±36.5951.00±22.36挥发性物质含量/（μg/g）2-羟基丙酸乙酯0.14±0.050.90±0.17ND2.40±0.97ND 2-羟基丙酸丙酯0.28±0.00ND0.56±0.09ND2.84±1.145-甲基壬酸乙酯0.15±0.003NDNDND0.62±0.158-甲基壬酸乙酯0.12±0.010.55±0.170.15±0.061.79±0.875.01±0.38-甲基-6-壬烯酸己酯0.16±0.030.22±0.080.21±0.12.03±1.013.55±0.25棕榈酸乙酯3.20±1.000.20±0.001.95±0.7767.45±21.349.65±0.83α-亚麻酸乙酯0.59±0.140.52±0.200.39±0.0912.63±2.482.13±1.23油酸乙酯0.79±0.31NDND1.52±1.14ND肉豆蔻酸乙酯ND0.20±0.020.10±0.041.11±0.90.73±0.24水杨酸-2-乙基己酯ND0.21±0.00NDNDND甲基乙酸酯NDNDND0.98±0.31ND 2-甲基-3-丙烯基环丙烷羧酸甲酯ND0.62±0.24NDNDND辛酸乙酯ND0.28±0.050.15±0.12.95±1.341.94±1.00乳酸乙酯0.14±0.050.90±0.23ND2.40±0.75ND 12-氧代十二烷酸乙酯ND1.45±0.41NDNDND水杨酸高孟酯0.18±0.090.56±0.21NDNDND异戊醇5.21±1.540.37±0.155.90±2.5713.80±5.9829.51±10.384-甲基-1-戊醇0.70±0.20NDNDND0.83±0.242-庚醇ND0.19±0.070.37±0.14NDND左旋2-戊醇NDND0.24±0.092.73±1.240.44±0.173-甲基-2-戊醇ND0.73±0.15NDNDND芳樟醇5.47±2.540.60±0.1412.94±8.5419.33±2.55ND 2,6-二甲基-3,7-辛二烯-2,6-二醇0.11±0.07ND0.33±0.13ND0.58±0.11
续表6
挥发性物质含量/（μg/g）ZRYSQSYMQMα-松油醇2.27±1.050.54±0.225.06±0.2917.43±6.7310.90±5.21顺-香叶醇NDNDNDND0.81±0.263-甲基-1-戊醇NDND0.60±0.00NDND 2-癸烯-1-醇0.14±0.03NDNDNDND 5-甲基-1-庚醇NDND4.84±2.19NDND(S)-2-己醇NDNDND1.70±0.36ND 4a,5-二甲基-3-(1-丙烯-2-基)-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氢萘-1-醇ND1.02±0.430.15±0.02NDND(1R,3aS,8aS)-7-异丙基-1,4-二甲基-1,2,3,3a,6,8a-六氢薁NDND4.16±2.61NDND顺式香叶醇NDNDND3.13±1.44ND DL-2,3-丁二醇ND31.88±5.71ND3.81±1.420.55±0.08顺-5-乙烯基四氢-α,α,5-三甲基-2-呋喃甲醇ND3.23±1.030.14±0.03NDND 3-甲基-2-丁醇ND8.23±2.93NDNDND香叶基芳樟醇NDNDND2.39±0.580.76±0.25顺-4-侧柏醇0.16±0.11NDNDNDND顺-6-十五碳烯-1-醇NDNDND3.13±1.26ND烯类4-甲基-1-戊烯ND0.62±0.22ND2.63±1.15ND苯乙烯0.26±0.074.03±2.140.4±0.192.81±1.031.78±0.581-甲基-4-(1-甲基亚乙基)环己烯0.08±0.010.21±0.080.16±0.04ND0.46±0.15(S)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯ND0.30±0.100.15±0.01ND0.44±0.181-二十三碳烯NDND0.10±0.02NDND[1S-(1α,2β,4β)]-1-乙烯基-1-甲基-2,4-双(1-甲基乙烯基)环己烷0.09±0.011.74±0.290.23±0.10NDND 4,4-二甲基-3-(3-甲基-3-丁烯亚基)-2-亚甲基双环[4.1.0]庚烷NDNDND4.48±2.180.98±0.14 D-柠檬烯0.09±0.01NDNDNDND(1R)-2,2-二甲基-3-亚甲基双环[2.2.1]庚烷NDND0.11±0.04NDND(1S)-6,6-二甲基-2-亚甲基双环[3.1.1]庚烷ND0.32±0.170.33±0.10NDND 2-异丙基-3-乙烯基环氧乙烷NDNDND2.96±1.36ND(4aS-顺)-2,4a,5,6,7,8,9,9a-八氢-3,5,5-三甲基-9-亚甲基-1H-苯并[7]环庚烯ND2.34±1.030.59±0.24NDND(4aS,9aR)-3,5,5,9-四甲基-2,4a,5,6,7,9a-六氢-1H-苯并[7]环庚烯5.81±2.360.30±0.10NDND38.89±5.74[1S-(1α,2α,3aβ,4α,8aβ,9R*)]-十氢-1,5,5,8a-四甲基-1,2,4-亚甲桥薁0.12±0.11NDNDND0.64±0.21β-桉叶烯ND10.67±2.080.15±0.04ND2.24±1.33(1R,2S,7R,8R)-2,6,6,9-四甲基三环[5.4.0.0(2,8)]十一碳-9-烯0.71±0.210.61±0.210.30±0.13ND3.30±1.752-甲基-1-十四碳烯0.99±0.27ND0.91±0.257.36±3.1411.00±2.48顺-2-甲基-7-十八碳烯ND1.33±0.43ND3.97±2.10ND反-2-甲基-7-十六碳烯ND0.13±0.020.10±0.021.24±0.240.81±0.32顺-7-十六碳烯ND1.21±0.63NDNDND 3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯NDNDND1.06±0.15ND(E)-10-甲基-4-十一碳烯NDNDND1.14±0.13ND(E)-7-十四碳烯NDNDND1.64±0.73ND(E)-5-十四碳烯NDNDNDND1.20±0.424,6,8-三甲基-1-壬烯NDNDND1.24±0.41ND醛类α,4-二甲基-3-环己烯-1-乙醛0.09±0.020.21±0.070.38±0.110.98±0.230.48±0.212-异亚丙基-5-甲基-4-己烯醛0.18±0.04NDNDNDND(Z)-14-甲基-8-十六碳烯醛NDNDND1.98±1.06ND酸类0.16±0.11NDNDNDND L-乳酸NDND0.35±0.15NDND甲基丙二酸NDND0.51±0.254.84±2.150.74±0.33羟基乙酸NDNDND3.92±1.88ND酮类3-羟基-2-丁酮NDNDND2.41±1.220.61±0.21紫罗兰酮0.13±0.04NDNDNDND
续表6
十九烷0.74±0.220.26±0.111.15±0.449.74±3.483.75±1.89挥发性物质含量/（μg/g）ZRYSQSYMQM 4-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮ND0.55±0.140.09±0.001.49±0.480.66±0.15反-β-紫罗兰酮0.08±0.01ND0.13±0.010.38±0.140.34±0.09(E)-1-(2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-基)-2-丁烯-1-酮0.11±0.03ND0.17±0.04ND0.44±0.10酚类2-乙基苯酚0.12±0.05NDNDNDND 4-乙基苯酚ND0.33±0.110.15±0.03NDND 2-甲氧基-4-乙烯基苯酚NDND0.10±0.011.28±0.620.60±0.044-乙基-2-甲氧基苯酚3.08±1.300.31±0.10NDND0.44±0.025-乙烯基-2-甲氧基苯酚ND0.34±0.12NDNDND烷烃类顺-1,2-二甲基环己烷8.30±3.12NDNDNDND 2-环丙基丙烷NDND0.10±0.04NDND 1-壬基环庚烷NDNDNDND0.52±0.161,2-二甲基环己烷NDNDND60.12±20.43ND 3-甲基-5-丙基壬烷NDNDND1.49±0.35ND十四烷0.08±0.01NDNDNDND十六烷0.14±0.040.30±0.00NDNDND二十七烷NDND0.12±0.02NDND十五烷NDNDNDND2.16±0.81十八烷NDNDNDND1.47±0.432-甲基十八烷ND0.47±0.13NDNDND 2-甲基十九烷NDND0.16±0.02NDND 3-甲基十三烷1.20±0.52NDND9.09±3.14ND 3-甲基十四烷NDND0.78±0.18NDND 4-甲基十六烷NDNDNDND1.03±0.1210-甲基十九烷1.96±0.740.29±0.102.26±1.0717.08±10.8524.00±12.338-己基十五烷0.18±0.110.21±0.06NDNDND 2,3,5,8-四甲基癸烷0.10±0.07NDNDNDND 2,6-二甲基十七烷ND1.14±0.08ND6.63±2.39ND十七烷0.32±0.14NDNDNDND 2,6-二甲基十八烷NDNDND1.69±0.86ND丙基环丙烷NDNDNDND2.78±1.037-己基二十烷0.89±0.13NDND30.19±5.71ND其他2-甲氧基-3-异丁基吡嗪0.14±0.01ND0.21±0.061.51±0.760.94±0.28总含量59.62±6.74123.67±11.7875.85±10.97658.39±56.67337.79±32.05
注：ND.未检出。
剁辣椒中共检出37种酯类物质，酵母菌与乳酸菌混合发酵样品的酯类物质含量均高于自然发酵组和单菌发酵组。其中，YM组中乙酸芳樟酯（30.95 μg/g）、乙酸苯乙酯（15.73 μg/g）及特有的甲酸芳樟酯（57.17 μg/g）含量较高，棕榈酸乙酯与水杨酸甲酯亦在复配发酵组中呈现较高水平。酯类是构成剁辣椒香气的核心组分，复配发酵通过微生物代谢协同作用有效强化酯类关键香气物质的生 成[28]。其中，酯类物质作为含量最丰富的类别，赋予剁辣椒浓郁的花果香与油脂香[29]。具体而言，乙酸芳樟酯、乙酸苯乙酯及甲酸芳樟酯赋予剁辣椒柠檬-玫瑰复合香气及清甜果香，共同丰富其香气层次[30]；而棕榈酸乙酯与水杨酸甲酯则为剁辣椒增添油脂香和冬青叶气息[31]。
剁辣椒中共检出27种醇类物质，其中芳樟醇在YM组中的含量为（19.33 μg/g）；苯乙醇与α-松油醇在YM组中含量最高，分别为156.24、17.43 μg/g。醇类物质的产生主要依赖于微生物活动及氨基酸降解作用[32]，是辣椒制品花香与果香的重要来源[33]。其中芳樟醇是辣椒的特征香气物质之一，赋予其柑橘花香；苯乙醇赋予剁辣椒浓郁的玫瑰、蜂蜜样甜香，α-松油醇则贡献薄荷松针香[34]。
此外，2-甲氧基-3-异丁基吡嗪作为发酵辣椒特征风味物质，赋予剁辣椒青胡椒、坚果风味、泥土香和青豌豆香气[35]，其含量在YM组（1.51 μg/g）较自然发酵组提升约9.8倍。这与刘媛等[36]在不同产地剁辣椒中鉴定该物质为关键香气活性成分的结果相符。
2.5.3 差异香气物质筛选
通过OPLS-DA对不同混菌发酵剁辣椒样品进行风味轮廓区分。由图3A可知，自然发酵组（ZR）与乳酸菌单菌发酵组（YS、QS）样本点高度聚集，表明这 3组在挥发性风味物质组成上无显著差异，提示乳酸菌组合Y与Q作为单一发酵剂对风味的调控作用较为相似；而添加酵母菌X1的复配发酵组（YM、QM）样本点则与上述3组明显分离，说明酵母菌的参与是导致辣椒风味轮廓发生显著改变的关键因素。置换检验结果（图3B）进一步证实了OPLS-DA模型具有良好的可靠性与稳定性，为不同发酵方式下挥发性风味物质的差异分析提供了统计依据。以变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）＞1为筛选标准，从模型中提取出对区分不同发酵方式具有重要贡献的差异香气物质。由图3C可知，芳樟醇（具花果香气）、水杨酸甲酯（冬青油香气）、异戊醇（白兰地醇香）、2-甲氧基-3-异丁基吡嗪（青椒与青豌豆香气）、乙酸异戊酯（香蕉风味）是区分各组风味差异的核心挥发性物质。这些化合物在不同发酵组间分布特征显著不同，对各组风味轮廓的区分贡献较大，也是导致不同混菌发酵方式产生差异化风味特征的主要原因。
Fig.3 Multivariate statistical analysis of volatile compounds in chopped chili pepper fermented by different strain combinations
图3 不同菌种组合发酵剁辣椒挥发性化合物的多元统计分析
3 结 论
本研究从自然发酵芥菜与剁辣椒样品中筛选获得一株优良产香酵母菌株M. humilis（编号X1），该菌株具备高产酯活性、快速发酵能力及良好的多重胁迫耐受性。将该菌株与乳酸菌复配进行剁辣椒发酵，结果显示，混合发酵组总酸、总酯及氨基酸态氮含量均显著高于纯乳酸菌发酵组，感官评分也明显提升，且其风味轮廓与纯乳酸菌发酵组和自然发酵组存在较大差异。其中，混合发酵YM组（酵母菌X1与乳酸菌组合Y）剁辣椒品质最优，关键香气成分如乙酸苯乙酯、苯乙醇等含量明显提高，形成了独特的风味特征。综上，菌株X1（M. humilis）可作为优良产香发酵剂，与乳酸菌协同发酵能有效提升剁辣椒风味品质，为传统发酵蔬菜的风味调控与功能性发酵剂开发提供理论依据与技术参考。
[1] 张诗瑶, 孙钰薇, 刘志佳, 等. 中华传统发酵蔬菜风味轮廓及风味形成研究进展[J]. 中国食品学报, 2022, 22(12): 373-388.DOI:10.16429/j.1009-7848.2022.12.036.
[2] Ye Zi, Shang Zhixun, Li Meiqi, et al. Evaluation of the physiochemical and aromatic qualities of pickled Chinese pepper (Paojiao) and their influence on consumer acceptability by using targeted and untargeted multivariate approaches[J]. Food Research International, 2020, 137:109535. DOI:10.1016/j.foodres.2020.109535.
[3] 杨倩, 肖路遥, 白旭红, 等. 剁辣椒源益生菌筛选及其在发酵剁辣椒中的应用[J]. 食品工业科技, 2025, 46(3): 178-187. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2024040173.
[4] 刘鑫, 王家旺, 隋雨萌, 等. 中国传统发酵蔬菜中微生物多样性及其对品质形成影响研究进展[J]. 食品科学, 2024, 45(10): 290-297.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230701-006.
[5] Yuan Yingzi, Yang Yutong, Xiao Lele, et al. Advancing insights into probiotics during vegetable fermentation[J]. Foods, 2023, 12(20):3789. DOI:10.3390/foods12203789.
[6] 汪铃, 王亮. 传统发酵蔬菜制作工艺、品质特征及影响因素研究概况[J]. 中国酿造, 2022, 41(7): 21-25. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2022.07.005.
[7] 贺伟春. 直投式乳酸菌发酵黄菜品质研究及其产品研发[D]. 太谷:山西农业大学, 2024. DOI:10.27285/d.cnki.gsxnu.2024.000702.
[8] 颜宇鸽. 产香酵母与植物乳植杆菌混菌发酵对遵义辣椒酱品质提升研究[D]. 重庆: 西南大学, 2023. DOI:10.27684/d.cnki.gxndx.2023.000523.
[9] 李佳芯, 练银银, 宋佳佳, 等. 酵母菌与乳酸菌协同发酵对酸菜品质和风味的影响[J]. 食品与发酵工业, 2026, 52(7): 201-209.DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.043328.
[10] 李佳佳, 唐延东, 郝惠阳, 等. 中国传统发酵蔬菜中微生物多样性研究进展[J]. 食品研究与开发, 2025, 46(8): 218-224. DOI:10.12161/j.issn.1005-6521.2025.08.028.
[11] Liu Lu, Li Guolong, Cui Lu, et al. The health benefits of fermented fruits and vegetables and their underlying mechanisms[J].Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2024,23(6): e70072. DOI:10.1111/1541-4337.70072.
[12] 宋新燕, 肖茜, 王蓉蓉, 等. 自然发酵剁辣椒中优良酵母菌的筛选及鉴定[J]. 中国酿造, 2022, 41(6): 69-73. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2022.06.012.
[13] 申鹏森, 田争福, 田晓菊, 等. 一株降解氨基甲酸乙酯酿酒酵母菌的筛选及鉴定[J]. 食品与发酵工业, 2022, 48(9): 20-25. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.029211.
[14] Zhang Fengfeng, Zhou Ke, Xie Fengxing, et al. Screening and identification of lactic acid bacteria with antimicrobial abilities for aquaculture pathogens in vitro[J]. Archives of Microbiology, 2022, 204(12): 689. DOI:10.1007/s00203-022-03285-y.
[15] Liu Yuan, Zhao Lingyan, Yang Chunya, et al. Sensory score prediction and key aroma compounds characterization in fermented chopped pepper[J]. Food Chemistry: X, 2025, 29: 102743. DOI:10.1016/j.fochx.2025.102743.
[16] 文亚诗, 刘家祺, 周泉, 等. 不同线椒品种对剁椒品质影响及剁椒加工适宜性评价模型的构建[J]. 食品科学, 2025, 46(20): 57-65. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250217-066.
[17] 袁佳. 丹参和红花提取液醇沉工艺及包裹损失现象的研究[D].杭州: 浙江大学, 2011.
[18] Yan Shoubao, Chen Xiangsong, Xiang Xingben. Improvement of the aroma of lily rice wine by using aroma-producing yeast strain Wickerhamomyces anomalus HN006[J]. AMB Express, 2019, 9(1): 89. DOI:10.1186/s13568-019-0811-8.
[19] Xiao Muyan, Xiong Tao, Peng Zhen, et al. Correlation between microbiota and flavours in fermentation of Chinese Sichuan Paocai[J]. Food Research International, 2018, 114: 123-132. DOI:10.1016/j.foodres.2018.06.051.
[20] 李玉花. 山西葡萄产区酿酒酵母的优选与鉴定及其共发酵特性分析[D]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2021. DOI:10.27229/d.cnki.gnmnu.2021.000971.
[21] Zhang Yanhe, Zhang Yanping, Zhu Yan, et al. Proteomic analyses to reveal the protective role of glutathione in resistance of Lactococcus lactis to osmotic stress[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(10): 3177-3186. DOI:10.1128/AEM.02942-09.
[22] 赖颖, 郭婕, 郭静娜. 浓香型白酒生产中耐酒精酵母菌的选育研究[J].酿酒科技, 2015(1): 31-36. DOI:10.13746/j.njkj.2014107.
[23] Qiu Zilong, Jiang Rongrong. Improving Saccharomyces cerevisiae ethanol production and tolerance via RNA polymerase II subunit Rpb7[J]. Biotechnology for Biofuels, 2017, 10(1): 125. DOI:10.1186/s13068-017-0806-0.
[24] 何迎粉, 何荣荣, 刘敦华, 等. 海藻糖与酿酒酵母乙醇耐受性相关性的研究进展[J]. 中国酿造, 2020, 39(11): 1-4. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2020.11.001.
[25] Wittwer A E, Li J A, Howell K. Applying deconstructed sourdough communities and fermentation parameters to low-FODMAP wheat bread production[J]. European Food Research and Technology, 2026,252(2): 97. DOI:10.1007/s00217-025-04942-4.
[26] Chen Shuoyu, Zhang Fanxin, Ananta E, et al. Co-inoculation of Latilactobacillus sakei with Pichia kluyveri or Saccharomyces boulardii improves flavour compound profiles of salt-free fermented wheat gluten[J]. Fermentation, 2024, 10(2): 75. DOI:10.3390/fermentation10020075.
[27] Shi Qiao, Tang Xin, Liu Biqin, et al. Correlation between microbial communities and key odourants in fermented Capsicum inoculated with Pediococcus pentosaceus and Cyberlindnera rhodanensis[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2023, 103(3): 1139-1151. DOI:10.1002/jsfa.12321.
[28] 唐鑫, 张艺馨, 刘卫红, 等. 外源接菌对发酵辣椒微生物群落和挥发性风味化合物的影响[J]. 食品科学, 2023, 44(10): 132-141.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220601-005.
[29] Wang Jingjing, Wang Rongrong, Xiao Qian, et al. SPME/GC-MS characterization of volatile compounds of Chinese traditional-chopped pepper during fermentation[J]. International Journal of Food Properties,2019, 22(1): 1863-1872. DOI:10.1080/10942912.2019.1684320.
[30] 江雪梅, 王锋, 周书栋, 等. 不同辣椒品种对发酵剁辣椒品质及风味的影响[J]. 中国调味品, 2023, 48(4): 1-6; 19. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2023.04.001.
[31] 唐蓉, 陈骏飞, 杨海泉, 等. 乳酸菌与酵母菌联合发酵对芥菜理化性质及保藏期品质的影响[J]. 食品工业科技, 2024, 45(10): 141-148.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2023070065.
[32] 杜书. 酸菜自然发酵过程中风味及质地变化规律研究[D]. 沈阳:沈阳农业大学, 2013.
[33] 陆宽, 王雪雅, 孙小静, 等. 电子鼻结合顶空SPME-GC-MS联用技术分析贵州不同品种辣椒发酵后挥发性成分[J]. 食品科学, 2018,39(4): 199-205. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201804030.
[34] 王宏伟, 刘宏娟, 覃业优, 等. 不同年份陶坛剁椒在贮藏过程中的品质风味变化[J]. 食品科学, 2025, 46(3): 169-178. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240415-133.
[35] 秦双霞. 多菌共生发酵乳酸菌群的构建及其对轻盐发酵剁椒品质的影响[D]. 长沙: 湖南农业大学, 2024. DOI:10.27136/d.cnki.ghunu.2024.001333.
[36] 刘媛, 杨沛泉, 赵玲艳, 等. 气相色谱-质谱联用、高效液相色谱结合电子感官技术评价剁椒风味品质[J]. 食品科学, 2025, 46(10): 188-198. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240617-112.