水牛（Bubalus bubalis）适应性强，是优质畜禽种质资源，兼具役用与产奶、产肉价值，水牛乳约占全球奶产量的15%，且多种营养成分含量优于普通牛乳：蛋白质、脂肪含量分别比普通牛乳高约1.5、2.0倍，是开发高值乳制品的理想原料[1]。在各类乳制品中，发酵乳制品因口感风味优异、营养价值高，深受广大消费者喜爱。乳酸菌是发酵乳的关键发酵菌种，既参与发酵过程产酸增香，本身也可作为益生菌调节宿主肠道菌群、增强机体免疫力[2]。若要使乳酸菌在宿主体内发挥预期益生效果，产品中需保有足量活菌，GB 19302—2025《食品安全国家标准 发酵乳》明确要求发酵乳中乳酸菌数≥1.0×106 CFU/mL。然而，传统工艺制备的乳酸菌制剂易受pH值、氧化、温度波动等不利环境胁迫，常导致菌体损伤、活性下降[3]，严重影响产品品质，已成为益生菌发酵乳行业普遍关注的技术瓶颈，该问题也已在多项研究中得到反复报道与系统综述[4-5]。
微胶囊化技术是当前提高益生菌环境稳定性的重要技术，该技术以海藻酸钠等高分子材料为壁材包埋功能微生物，通过隔离不利环境提升其存活稳定性[6]。其中海藻酸钠因价格低廉、生物兼容性好，是益生菌包埋最常用的壁材之一，但单一海藻酸钠在发酵乳等酸性产品中易发生崩解，因此常与低聚果糖、壳聚糖、抗性淀粉等复配，以增强胶囊结构稳定性与益生菌保护效果[7]。低聚果糖作为复配壁材时兼具益生元功能，既可增强胶囊结构稳定性，还可促进益生菌增殖，Malos等[8]采用低聚果糖复配包埋的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），在模拟胃肠液中活菌数可达108 CFU/mL，显著高于未包埋对照组（104 CFU/mL）。在众多可应用于发酵乳的益生菌中，植物乳植杆菌因生态适应性强、代谢产物多样，同时兼具抑菌、抗氧化及改善产品风味的潜力，被公认为乳制品及发酵饮料生产中的理想益生菌[9]。
目前关于微胶囊包埋植物乳植杆菌应用于牛乳发酵乳的研究已有较多报道，但针对水牛乳基质的相关研究仍较为缺乏。本课题组前期研究已自主分离获得植物乳植杆菌GLK29并申请发明专利[10]，本研究以海藻酸钠和低聚果糖作为复合壁材，以GLK29为芯材，采用挤压法制备益生菌微胶囊，并将其应用于水牛乳发酵。本研究通过优化壁材配比，监测发酵水牛乳冷藏贮藏期间活菌数、酸度、持水力和质构特性动态变化，评估微胶囊技术在提升益生菌活性与发酵水牛乳品质稳定性方面的应用潜力，旨在为开发高值发酵水牛乳产品提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
植物乳植杆菌GLK29分离自制干酪，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.63163；FD-DVS YF-L904直投式发酵剂（含唾液链球菌嗜热亚种（Streptococcus salivarius subsp. thermophilus）、德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）） 丹麦科汉森公司；新鲜水牛乳 广西壮族自治区水牛研究所种畜场。
低聚果糖（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；海藻酸钠（分析纯） 上海源叶生物科技有限公司；氯化钙（分析纯） 天津市大茂化学试剂厂；氯化钠（分析纯） 成都金山化学试剂有限公司；柠檬酸钠（分析纯） 天津市博迪化工有限公司；白砂糖（食品级） 南宁市碧盈食品包装厂；0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液 广州和为医药科技有限公司；MRS琼脂、MRS肉汤培养基 广东环凯微生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
BSC-1304 II A2洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；SHP-150生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司；D-37520低温离心机 德国Heraeus公司；LX-B50L立式自动电热压力蒸汽灭菌器 常州杰博森仪器有限公司；FTC专业研究级食品物性分析仪 北京盈盛恒泰科技有限责任公司；BAO-250A精密鼓风干燥箱 施都凯仪器设备（上海）有限公司；D9N-50牛奶分离机 隆昌牛奶分离器制造厂。
1.3 方法
1.3.1 GLK29微胶囊制备
GLK29微胶囊制备参考陈娟等[11]的方法并进行适当调整。将活化后的GLK29离心并收集菌体，用无菌生理盐水重悬并洗涤3次，调节菌悬液OD600 nm值为1.5～2.0，此时活菌浓度约为107～108 CFU/mL。将GLK29菌悬液与不同浓度灭菌低聚果糖溶液按体积比3∶10混合均匀，静置备用；再将混合液与不同浓度的灭菌海藻酸钠溶液按体积比1∶1混合均匀，得到芯材-壁材复合包埋液。用10 mL无菌医用注射器吸取上述复合包埋液，逐滴挤入预先灭菌并冷却保温至40 ℃的1.5 g/100 mL氯化钙固化液中，滴加完成后固化30 min。将初步固化的微胶囊转入预先灭菌并冷却保温至40 ℃的3.5 g/100 mL氯化钙硬化液中，继续硬化处理10 min。采用无菌水清洗硬化微胶囊3次，过滤除去多余水分后置于4 ℃冰箱保存，备用。
1.3.2 微胶囊配方优化
以1.3.1节所述制备工艺为基准进行单因素试验。其他工艺参数保持不变，其中一组固定海藻酸钠质量分数为3.0%，分别配制质量分数为0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%的低聚果糖溶液，制备微胶囊；另一组固定低聚果糖质量分数为2.5%，分别配制质量分数为1%、2%、3%、4%、5%的海藻酸钠溶液，制备微胶囊。通过测定微胶囊包埋率筛选最优壁材配比。
1.3.3 发酵水牛乳制备
采用牛奶分离机将新鲜生水牛乳进行脱脂处理，使脱脂乳脂肪质量分数小于0.5%；向脱脂乳中加入质量分数7%的白砂糖，充分搅拌混匀后，对混合乳液进行巴氏杀菌处理（85 ℃、10 min）；杀菌完成后将乳液降温至40 ℃，加入质量分数0.006%的FD-DVS YF-L904直投式发酵剂，充分混合均匀后分装至无菌酸奶杯；于42 ℃恒温发酵至滴定酸度大于70 °T，符合GB 19302—2025要求后，转移至4 ℃冰箱后熟贮藏。分别于贮藏1、5、9、13、17 d取样，测定活菌数、滴定酸度、持水力及质构特性。
基于上述基础工艺，设置3组发酵水牛乳处理组，其中空白组仅添加发酵剂，不添加GLK29；游离菌组同步添加发酵剂与体积分数0.3%的GLK29菌悬液（OD600 nm值为1.5～2.0）；胶囊组同步添加发酵剂与0.3 g/100 mL GLK29微胶囊。
1.3.4 包埋率测定
参照De Araújo Etchepare等[12]的方法并略有改动。取1 g微胶囊样品加入99 mL 0.06 mol/L柠檬酸钠溶液中，37 ℃、180 r/min振荡60 min，确保微胶囊完全裂解。分别将裂解后的微胶囊悬液、包埋前的原菌悬液稀释至适宜浓度，均匀涂布于MRS琼脂平板，37 ℃恒温培养48 h后进行菌落计数，包埋率为微胶囊中活菌数与包埋前菌悬液总活菌数的比值。
1.3.5 微生物和理化指标测定
活菌数测定：参照GB 4789.35—2023《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》中的乳酸菌总数计数法，其中游离菌组和空白组按标准方法直接检测；胶囊组样品在无菌条件下取出微胶囊颗粒，依照1.3.4节方法裂解处理后进行菌落计数，剩余发酵乳部分按标准方法检测，该组总活菌数为微胶囊颗粒菌落数与发酵乳本体活菌数之和。
酸度测定：参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》中第一法。
持水力测定：参照Bierzuńska等[13]的方法且稍有改动。精确称量50 mL离心管质量，记为m1，加入20.00 g发酵水牛乳后，总质量记为m2；25 ℃、10 000 r/min离心10 min，静置10 min，弃去上清液后称量离心管与沉淀的总质量，记为m3。持水力按下式计算：
1.3.6 质构特性测定
参照Hovjecki等[14]的方法并稍作修改。检测前，将样品放置在室温下回温，选用直径2.5 cm、高度3.8 cm的圆柱形探头。测定参数：检测速率60 mm/min、形变量20%、触发力0.05 N、力传感器量程50 N。
1.4 数据处理
采用SPSS 25.0软件进行统计分析，OriginPro 2024软件作图，采用单因素方差分析进行显著性分析，采用Duncan法进行组间多重比较，每个实验进行3次重复，结果以x±s表示。
2 结果与分析
2.1 微胶囊壁材配比优化
GLK29原菌悬液活菌数为7.21～7.70（lg（CFU/mL）），各配方制备的微胶囊活菌数为5.78～7.06（lg（CFU/mL）），包埋率在75%～98%之间。各组微胶囊活菌数均低于原菌悬液，这是滴制剪切、钙离子胁迫、菌体清洗流失等工艺过程导致的正常损耗，与已有文献报道的规律[6,11]相符。由图1A可知，低聚果糖添加量可显著调控微胶囊包埋率，各组包埋率为94.93%～97.92%，包埋率随低聚果糖添加量升高呈先升后降的趋势。当低聚果糖添加量为2.5%时，包埋率最高，达97.92%，显著优于0.5%与4.5%添加组（P＜0.05）；1.5%、3.5%组包埋效果次之，且二者无显著差异（P＞0.05）。由图1B可知，不同海藻酸钠添加量制备的微胶囊包埋率存在显著差异（P＜0.05），包埋率为75.06%～91.63%；随着海藻酸钠添加量升高，包埋率整体也呈现先上升后下降的变化趋势，当海藻酸钠添加量为3%时，包埋率最高，为91.63%。Zhao Qian等[15]研究表明，主壁材海藻酸钠的浓度对微胶囊成型、包埋率及稳定性具有显著调控作用。Rojas-Muñoz等[16]的研究表明，低添加量成膜性不足，高添加量破坏稳定性，而中等浓度同步优化壁材结构和提升益生菌活性，从而获得最高包埋率。因此，将优选中等添加量2.5%低聚果糖和3%海藻酸钠作为壁材配比制备GLK29微胶囊，并评估其在发酵水牛乳中的稳态化效果。
图1 低聚果糖（A）和海藻酸钠（B）添加量对 GLK29微胶囊包埋率的影响
Fig.1 Effects of fructooligosaccharide (A) and sodium alginate (B)dosages on encapsulation efficiency of GLK29 microcapsules
2.2 不同处理组发酵水牛乳贮藏期活菌数稳定性
由图2可知，贮藏第1天，胶囊组水牛乳中的活菌数为8.54（lg（CFU/mL）），显著高于游离菌组 （8.09（lg（CFU/mL）））和空白组 （7.96（lg（CFU/mL）））（P＜0.05）。随着贮藏时间延长至17 d，3组活菌数均呈现下降趋势，第17天时胶囊组活菌数仍保持在8.23（lg（CFU/mL）），显著高于游离菌组（7.62（lg（CFU/mL）））和空白组 （7.21（lg（CFU/mL）））（P＜0.05）；3组活菌数较第1天分别下降3.60%、5.80%和9.42%，胶囊组降幅最小。具体来看，贮藏后期（第9～17天），胶囊组活菌数由8.28（lg（CFU/mL））降至8.23（lg（CFU/mL）），差异不显著（P＞0.05）；游离菌组较第9天显著降低 （P＜0.05）；空白组活菌数始终最低，累计降幅最大，表明微胶囊包埋可有效减缓菌体在贮藏过程中的活性损失。Da Conceição等[17]的研究表明，低聚果糖可作为益生元为益生菌提供营养支持，海藻酸钠能形成物理屏障隔离外界不利因素，二者复合包封2株副干酪乳酪杆菌（Lactobacillus paracasei）LBC81和ELBAL后，可显著提升其在模拟胃肠环境（低pH值、胆汁盐）中的活菌数，且低温贮藏35 d仍可保持稳定存活。综上所述，低聚果糖与海藻酸钠复合壁材协同构建的微胶囊化体系在保持益生菌发酵水牛乳低温贮藏期活菌数稳定性方面具有显著优势。
图2 不同处理组发酵水牛乳贮藏期活菌数变化
Fig.2 Dynamic changes of viable cell counts in fermented buffalo milk of different treatment groups during storage
2.3 不同处理组发酵水牛乳贮藏期酸度稳定性
乳酸菌在冷藏条件下仍会持续代谢产生有机酸，引发发酵乳后酸化现象，后酸化会影响发酵乳的风味、品质稳定性和货架期表现[18]。如图3所示，随着贮藏时间延长至第9天，各组酸度均呈升高趋势，但不同处理方式下酸度变化规律存在明显差异。胶囊组酸度由95.49 °T逐渐升高后降低，于第13天达到峰值（108.63 °T），随后略降至第17天的107.37 °T，表明其在贮藏后期酸度变化较为平缓。游离菌组前期酸度升高较快，由94.16 °T增至第9天的106.26 °T，并于第17天达到最高值（109.30 °T），较第13天（104.30 °T）显著升高（P＜0.05），表现出明显的后期酸积累趋势。空白组酸度除第9天外均低于2个益生菌添加组，酸度由第1天92.94 °T升到第17天104.81 °T。与第1天相比，第17天胶囊组、游离菌组和空白组酸度分别增加11.88、15.15、11.87 °T。总体来看，胶囊组酸度维持相对稳定，而游离菌组后期酸积累更明显。值得注意的是，游离菌组第17天酸度达到最高水平（109.30 °T），但其活菌数（7.62（lg（CFU/mL）））低于胶囊组（8.23（lg（CFU/mL））），说明后酸化程度并非仅由活菌数量决定，还与菌体代谢活性及酸性物质积累过程有关。微胶囊化可能通过形成保护性凝胶网络调节菌体与乳基质环境的物质交换，降低乳酸生成速率，从而缓解贮藏后期酸度升高。该结果与Kailasapathy等[19]研究结论相一致，其指出海藻酸钠-淀粉复合包埋体系可改善乳酸菌贮藏过程中的代谢稳定性，调控酸性物质积累。
图3 不同处理组发酵水牛乳贮藏期酸度变化
Fig.3 Dynamic changes of acidity in fermented buffalo milk of different treatment groups during storage
2.4 不同处理组发酵水牛乳贮藏期持水力稳定性
持水力代表发酵乳蛋白凝胶网络的保水能力，可反映凝胶网络的致密性，是评价发酵乳质地的关键指标[20]。 由图4可知，随着贮藏时间延长，各处理组持水力均呈现先升高后降低的变化趋势。贮藏第1天，胶囊组持水力为25.90%，显著高于游离菌组（23.27%）和空白 组（23.17%）（P＜0.05）。随着贮藏进行，各组持水力逐渐升高，并于第13天达到峰值，其中胶囊组、游离菌组和空白组分别达到29.90%、30.04%和29.09%。值得注意的是，第13天游离菌组持水力略高于胶囊组，但两者差异不显著（P＞0.05），可能与贮藏中期蛋白凝胶网络进一步重排及菌体代谢活动对凝胶结构的阶段性影响有关。随后进入贮藏后期（13～17 d），各组持水力均发生下降，胶囊组由29.90%降至26.32%，下降幅度小于游离菌组（30.04%降至23.63%）和空白组（29.09%降至22.19%），表明微胶囊化处理有助于减缓贮藏后期持水性能的下降。孙敏等[21]的研究表明，低聚果糖可通过结合自由水及改善蛋白凝胶网络结构提高低脂凝固型发酵乳的持水力。Li Hongbo等[22]研究表明，海藻酸钠微胶囊可显著提高搅拌型发酵乳持水力（P＜0.05），其作用可能与海藻酸钠亲水基团结合水分以及复合网络结构填充凝胶孔隙有关。结合本研究结果推测，低聚果糖-海藻酸钠复合壁材形成的微胶囊结构，可能通过增强水分结合能力、改善凝胶网络稳定性降低水分迁移，从而提高益生菌发酵水牛乳的持水性能。
图4 不同处理组发酵水牛乳贮藏期持水力变化
Fig.4 Dynamic changes of water-holding capacity in fermented buffalo milk of different treatment groups during storage
2.5 不同处理组发酵水牛乳贮藏期质构特性稳定性
硬度和内聚力是评价发酵乳凝胶结构特性及贮藏稳定性的重要质构参数，其中硬度反映凝胶网络强度及抗压变形能力，内聚力表征凝胶内部结构结合程度及抗机械破坏能力[23]。如图5A所示，随贮藏时间延长，各处理组硬度均呈现先升高后波动变化的趋势，但不同处理体系的凝胶结构演变规律存在差异。胶囊组硬度由第1天的0.433 N显著增加至第13天的1.079 N（P＜0.05），随后第17天仍保持较高水平（1.039 N），表明其凝胶网络在贮藏过程中逐渐形成并具有较强的结构保持能力。游离菌组硬度于第9天达到最大值（1.009 N），显著高于同期胶囊组和空白组（P＜0.05），随后下降并维持于0.65 N左右；空白组硬度整体较低，第17天为0.699 N。相较于其他处理组，胶囊组在贮藏后期表现出更高的硬度保持能力，说明微胶囊化处理有利于提高发酵乳凝胶体系的结构稳定性。如图5B所示，各处理组均表现出随贮藏时间延长而降低的变化趋势，并在后期趋于稳定。胶囊组内聚力由第1天的0.56下降至第13天的0.39，随后略升至0.42；游离菌组由0.61下降至0.44～0.47范围内；空白组下降至0.45后基本保持稳定。内聚力降低表明贮藏过程中蛋白凝胶网络内部结合力发生一定程度弱化，但不同处理体系对凝胶结构稳定性的维持能力存在差异。结合持水力结果发现，第13天胶囊组持水力达到29.90%，同时硬度达到1.079 N，二者同步达到较高水平，说明较强的水分保持能力可能与凝胶网络致密化及结构稳定性维持密切相关。本研究结果与Li Hongbo等[22]关于海藻酸钠微胶囊改善发酵乳质构特性的研究结果相一致，海藻酸钠复合壁材形成的微胶囊结构可能通过其亲水性及空间网络作用增强体系水分结合能力，并对凝胶网络孔隙结构产生填充作用，从而提高蛋白凝胶体系的致密性。
图5 不同处理组发酵水牛乳贮藏期硬度（A）和内聚力（B）变化
Fig.5 Dynamic changes of hardness (A) and cohesiveness (B) in fermented buffalo milk of different treatment groups during storage
2.6 不同处理组发酵水牛乳贮藏期品质相关性分析
通过相关性分析能够明确发酵乳各指标间的关联和协同变化规律，进一步评价微胶囊包埋对产品贮藏稳定性的调控效果。由图6可知，不同处理组之间指标相关模式存在一定差异，3组整体上硬度与酸度、持水力，以及持水力与酸度呈显著正相关（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），但内聚力与上述指标呈显著负相关（P＜0.001）， 说明3组发酵乳凝胶内部完整性均随贮藏时间延长呈现下降趋势。胶囊组中活菌数与酸度、硬度呈显著负相关（P＜ 0.001），硬度与酸度呈显著正相关（P＜0.001），表明胶囊体系有效地减缓了酸化进程，同时有助于保持乳酸菌活力，这种受控酸化过程使得产品凝胶更坚实、质地更稳定，该结论与D’Amico等[24]的研究结论一致，已有研究证实微胶囊技术能稳定提升多种乳制品的品质，Laina等[25] 采用电喷雾封装鼠李糖乳酪杆菌并添加到酸奶中，也观察到微胶囊可有效减缓酸奶酸化进程。游离菌组活菌数和酸度呈显著负相关（P＜0.001），酸度和硬度呈显著正相关（P＜0.05）；空白组中活菌数与酸度、硬度呈显著负相关（P＜0.05、P＜0.001），酸度和硬度呈显著正相关（P＜0.001）。相比之下，游离菌组和空白组各指标的相关性显著低于胶囊组，对产品品质的稳定性控制效果较差。综合分析表明，微胶囊化体系提升了发酵乳在低温贮藏中品质稳定性，这一结果与前述研究结论一致。
图6 不同处理组发酵水牛乳贮藏期品质指标相关性
Fig.6 Correlation of quality indicators for fermented buffalo milk from different treatment groups during storage
3 结 论
本研究以低聚果糖和海藻酸钠为壁材，以植物乳植杆菌GLK29为芯材制备微胶囊，比较GLK29微胶囊（胶囊组）、游离GLK29（游离菌组）和不添加GLK29（空白组）发酵水牛乳在4 ℃贮藏期间的品质变化。结果表明，低聚果糖与海藻酸钠添加量可影响调控微胶囊包埋性能，低聚果糖添加量为2.5%时，包埋率达到97.92%，海藻酸钠添加量为3%时，包埋率达到91.63%。贮藏实验结果表明，微胶囊化处理可有效提高GLK29在发酵水牛乳贮藏过程中的活性保持能力，并对酸度、持水性能及凝胶结构演变产生正向调控作用。与游离菌组和空白组相比，胶囊组贮藏17 d后活菌数仍保持在8.23（lg（CFU/mL）），活菌数降幅仅为3.60%，同时第17天硬度仍维持在1.039 N，表明复合壁材微胶囊体系有助于同时维持益生菌存活状态及发酵乳品质稳定性。综合分析表明，低聚果糖-海藻酸钠复合微胶囊体系能够协调菌体稳定性与发酵乳品质特性变化，有效提高益生菌发酵水牛乳的贮藏稳定性。本研究主要基于贮藏期间活菌数及品质指标变化评价了微胶囊体系的作用效果，后续仍需结合微胶囊结构特征、菌体体内释放行为及发酵过程代谢调控机制等方面开展深入研究，以进一步阐明复合壁材体系对发酵乳品质形成与演变的作用机制。
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