2型糖尿病是世界范围内最普遍的代谢疾病之一，约点糖尿病总人数的90%[1]。该病以高血糖和胰岛素抵抗为核心特征，患者罹患心脏病、肾损伤、神经病变、视力障碍、下肢溃疡等并发症的风险显著升高。此外，复杂的肠道菌群结构与慢性炎症反应密切有关；屏障功能障碍常与肥胖、糖尿病和代谢综合征相伴出现，从而加剧炎症，进一步破坏肠道屏障。二甲双胍是临床常用的口服降糖药物之一[2-3]，但长期服用易产生不良反应[4]。因此，从天然产物中挖掘有效、经济且低毒的功能活性成分，因其安全性与实用性优势，已成为该领域的研究热门。
玉米须既是传统中药材，也常应用于各类食品和保健品中，在医药和食用产品领域具备良好应用潜力。已有研究证实，玉米须可改善糖尿病相关症状[5]，同时兼具抗高血压[6]、降血脂、抗炎等生物活性。前期研究发现，发酵处理会显著改变玉米须的化学成分和功能特性[7]。经发酵后，玉米须中的多酚和黄酮含量提升，抗氧化及降血糖活性也明显增强[8-9]。另有研究表明，乳酸菌发酵玉米须产物的降血糖效果较为突出[10]。然而，目前针对多菌种发酵制备的玉米须发酵液（corn silk fermentation liquid，CSFL）的降糖效果仍缺乏系统性研究。因此，本研究采用多菌种复合二次发酵工艺制备CSFL，采用高脂饮食联合链脲佐菌素诱导2型糖尿病模型，探究CSFL对2型糖尿病模型小鼠的血糖调节作用及脏器保护效果，并结合肠道菌群解析其降糖潜在机制，旨在为玉米须相关保健食品的开发及降血糖药物佐剂的研发提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 动物、菌株、材料与试剂
无特定病原体（specific pathogen free，SPF）C57BL/6J小鼠（60只、6周龄、雄性）由哈尔滨医科大学试验动物部（许可证号：SCXK2024-002）提供，此研究已获得黑龙江八一农垦大学动物伦理委员会批准（批准号：SPXY2025013）；玉米须 青冈县鲜食玉米基地。
类干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）1.152 上海沪峥生物科技有限公司；链脲佐菌素 美国Sigma公司；总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、胰岛素测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；FastDNA™ SPIN基因组DNA提取试剂盒 北京智劼科技有限公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒 北京沿程科技有限公司；盐酸二甲双胍 中美上海施贵宝制药有限公司。
基础饲料（18%粗蛋白、4%粗脂肪、5%粗纤维、8%粗灰分、10%水分和其他挥发性物质）、高脂饲料（49%基础饲料、1.5%胆固醇、0.5%胆酸钠、10%猪油、20%果糖、2%复合维生素、2%碳酸钙和12%酪蛋白） 长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。
1.2 仪器与设备
SHP-250F生化培养箱 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；CT15RE高速离心机 福建日立工机有限公司；台式微生物玻璃发酵罐 上海搏旅仪器有限公司；GA-3血糖测试仪 三诺生物传感股份有限公司；TRACE 1300气相色谱（gas chromatography，GC）仪、ISQ 7000质谱（mass spectrometry，MS）仪 美国赛默飞世尔科技有限公司；LightCycler® 96实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 北京安麦格贸易有限公司。
1.3 方法
1.3.1 CSFL制备
玉米须经清洗烘干、粉碎，以料液比1∶8（g/mL）加去离子水，90 ℃回流提取2 h后，121 ℃灭菌30 min，冷却至室温，得到玉米须水提液。将L. paracasei和S. cerevisiae以2∶1混合制备复合菌悬液，按照10%的总接种量接入玉米须水提液，于微生物发酵罐中120 r/min、 34 ℃发酵72 h。发酵结束，将发酵液于121 ℃灭菌30 min后冷却至室温。按照2%接种量接入A. pasteurianus，于微生物发酵罐中120 r/min、32 ℃发酵24 h。发酵结束，过滤并离心，取上清液于121 ℃灭菌30 min后冷却至室温，制得CSFL。经旋转蒸发仪浓缩，4 ℃冰箱保存备用。
1.3.2 实验动物模型建立及分组
取60只SPF级雄性C57BL/6J小鼠，先开展为期7 d的适应性喂养，以消除环境变化对实验结果的干扰。随后随机挑选10只小鼠作为对照组（NC），饲喂基础饲料；剩余50只小鼠作为造模组，饲喂高脂饲料。4周后，进行禁食、不禁水的过夜处理，连续4 d腹腔注射 40 mg/kg（以体质量计，下同）链脲佐菌素，1周后测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平，FBG≥11.1 mmol/L表明高糖模型造成。将造模成功的小鼠随机分为5组，每组各10只，分别为模型组（MD）、盐酸二甲双胍组（Met）、玉米须水提液组（CSL）、CSFL低剂量组（L-CSFL）、CSFL高剂量组（H-CSFL），于每天上午灌胃给药1次，连续28 d。NC组与MD组生理盐水灌胃剂量为0.1 mL/10 g，CSL与H-CSFL组灌胃剂量分别为0.1 mL/10 g，L-CSFL组灌胃剂量为0.05 mL/10 g，Met组灌胃剂量为0.1 mL/10 g。
1.3.3 体质量、FBG及口服葡萄糖耐量测定
实验期间，对小鼠的体质量与FBG进行周期性记录。灌胃干预28 d，通过口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）评估小鼠糖代谢能力，以2 g/kg剂量为小鼠灌胃葡萄糖，利用血糖仪在灌胃后0、30、60、90、120 min测定血糖浓度，并计算每组小鼠对应的OGTT曲线下面积（area under the curve，AUC）。
1.3.4 血清生化指标测定
TG、TC、HDL-C、LDL-C、CAT、MDA、GSH-Px 和血清胰岛素含量均采用试剂盒测定。胰岛素抵抗指数（homeostatic model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）按式（1）计算：
式中：INS表示空腹胰岛素水平/（mIU/L）。
1.3.5 肝脏指标检测
肝脏AST、ALT水平采用试剂盒测定。
1.3.6 脏器指数测定
取小鼠脏器于生理盐水中漂洗、滤纸吸干，称质量并记录。脏器指数按式（2）计算：
1.3.7 组织切片观察
小鼠肝脏和胰腺组织固定在多聚甲醛溶液中过夜，石蜡包埋切片后，用苏木精和伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色组织切片，在光学显微镜下观察并拍照。
1.3.8 小鼠肠道菌群测定
使用DNA提取试剂盒从小鼠盲肠内容物中提取DNA。以341F（5′-CCTACGGGGNGGCWGCAG-3′）和785R（5′-GACTACHVGGGGTATCTAATCC-3′）为引物对16S rDNA基因高变区V3～V4进行PCR扩增，PCR反应体系为25 μL，包括宏基因组DNA 2.525 μL、2×Phanta Max Master Mix 12.5 μL、上下游特异性引物各0.25 μL，以无菌无酶水补足体积。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，28个循环；72 ℃延伸10 min，10 ℃保持至停止。用2%琼脂糖凝胶电泳检测，并使用DNA凝胶回收试剂盒切胶，并使用PCR仪进行定量。纯化的扩增子以等浓度混合，使用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行测序（PE250）[11]。
1.3.9 短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）定量分析
采用GC-MS测定SCFAs含量。取适量样本于1.5 mL离心管中，加500 μL水，加入100 mg玻璃珠，匀浆1 min，于4 ℃、12000 r/min离心10 min，取200 μL上清，加100 μL 15%磷酸，再加375 μg/mL内标（4-甲基戊酸）溶液20 μL和乙醚280 μL，匀浆1 min，于4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，取上清液上机测试。
GC条件：HP-INNOWax毛细管柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）；分流进样，进样量1 μL，分流比10∶1。进样口温度250 ℃；离子源温度300 ℃；传输线温度250 ℃。升温程序：起始温度90 ℃；以10℃/min升温至120℃；再以5 ℃/min升温至150 ℃；最后以25 ℃/min升温至250 ℃，维持2 min。载气为氦气，载气流速1.0 mL/min。
MS条件：电子电离源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，传输线温度250 ℃。扫描方式：选择离子监测模式。
定性定量方法：通过比对样品色谱峰与混合标准品的保留时间，结合目标物特征离子碎片完成定性分析；根据样品中目标物与内标的峰面积比，采用内标法定量。
1.4 数据处理
采用软件SPSS 22.0和Origin 2024软件进行数据分析，采用单因素方差分析进行显著分析，P＜0.05表示差异显著，数据结果以x±s表示。采用SIMCA 16.0软件进行偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），采用LEfSe软件进行线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析以筛选组间差异物种。
2 结果与分析
2.1 CSFL对2型糖尿病小鼠体质量及日均摄食量与 饮水量的影响
如图1A所示，MD组体质量在整个实验周期内均显著高于NC组，CSFL干预后，体质量有所回升，提示CSFL可改善模型小鼠糖代谢紊乱，提高机体能量利用水平，缓解糖尿病引发的机体组织过度消耗。L-CSFL和H-CSFL组体质量增长速率明显快于MD组。由图1B、C可知，MD组小鼠的日均摄食量和饮水量明显高于NC组。经灌服4周阳性药物和CSFL后，与MD组相比，Met组及CSL、L-CSFL、H-CSFL组小鼠日均摄食量和饮水量均有不同程度下降，其中CSL、L-CSFL、H-CSFL组日均饮食量分别下降9.13%、11.41%、13.42%，日均饮水量分别下降18.71%、28.59%、29.36%。造成这一现象的原因可能是：有毒氮氧化合物是链脲佐菌素的主要毒性产物，其可靶向攻击胰岛β细胞，引发细胞结构破损乃至坏死。胰岛β细胞作为调节糖代谢的关键细胞，其功能受损会扰乱内分泌稳态，导致糖脂代谢紊乱、能量代谢异常，最终表现为小鼠体质量下降[12]。本研究结果表明，经CSFL干预4周后，2型糖尿病小鼠摄食量和饮水量均出现不同程度下降。
图1 CSFL对2型糖尿病小鼠体质量（A）、日均摄食量（B）及饮水量（C）的影响
Fig.1 Effect of CSFL on body weight (A), average daily food intake (B), and average daily water consumption (C) in type 2 diabetic mice
2.2 CSFL对2型糖尿病小鼠FBG的影响
FBG不仅是诊断糖尿病的重要参考指标，更是衡量降血糖效果的主要评价标准[13]。如表1所示，小鼠FBG均大于11.1 mmol/L，且极显著高于NC组（P＜0.001），造模成功。经4周灌胃治疗后，与MD组相比，CSL、L-CSFL、H-CSFL组FBG分别下降35.33%、39.33%和32.67%。Met组、CSFL各剂量组小鼠干预4周后的FBG水平均极显著下降（P＜0.001）。结果表明，CSFL对高血糖小鼠的血糖有一定的改善作用。可能原因是CSFL中的多酚、黄酮类活性成分可能通过改善胰岛素敏感性与胰岛素抵抗，促进血糖转化为糖原，从而有效降低FBG，这与之前的研究[14]一致。
表1 CSFL对2型糖尿病小鼠FBG的影响
Table1 Effect of CSFL on FBG in type 2 diabetic mice
mmol/L组别0周1周2周3周4周NC7.61±0.476.03±0.496.23±0.696.68±0.415.88±0.80 MD12.27±1.45***13.53±1.23***15.67±2.04***18.88±1.18***22.25±1.66***Met13.53±1.23##15.67±2.04###18.88±1.18###22.25±1.66###12.27±1.45###CSL16.40±1.91###19.83±2.13###22.11±2.03###19.10±1.89#14.39±1.97###L-CSFL18.80±1.27###19.83±2.13###20.81±1.66##20.56±1.26###13.50±2.51###H-CSFL17.93±1.51###18.94±0.32###21.07±1.94###20.35±2.19###14.98±1.50###
注：与NC组相比，***.差异极显著（P＜0.001）；与MD组相比， #.差异显著（P＜0.05），##.差异高度显著（P＜0.01）；###.差异极显著（P＜0.001）。下同。
2.3 CSFL对2型糖尿病小鼠OGTT-AUC的影响
OGTT是临床诊断糖尿病的关键手段，尤其在早期糖尿病的筛查中具有难以替代的作用[15]。如表2所示，所有小鼠在口服葡萄糖30 min内血糖变化相似，达到峰值，随后便开始逐步下降。此外，在每个时间点MD组小鼠血糖浓度均极显著高于NC组（P＜0.001），说明糖尿病小鼠糖耐量发生异常。NC组血糖在120 min后逐渐恢复到基线水平，而糖尿病组小鼠血糖一直保持在较高水平。与 MD组相比，Met、CSL、L-CSFL、H-CSFL组小鼠血糖浓度极显著降低，AUC也极显著降低（P＜0.001），表明CSFL对2型糖尿病小鼠具有降血糖作用。
表2 CSFL对2型糖尿病小鼠OGTT-AUC的影响
Table2 Effect of CSFL on area under the curve of oral glucose tolerance test in type 2 diabetic mice
组别血糖浓度/（mmol/L）OGTT-AUC/0 min30 min60 min90 min120 min（mmol·min/L）NC5.73±0.2514.90±1.9712.47±2.1711.70±2.827.17±0.8516.91±2.30 MD18.57±2.70***31.3±1.58***32.23±1.85***29.27±3.65***22.37±2.42***41.83±0.32***Met11.70±0.60###30.63±1.04###25.87±1.72###21.83±2.80###15.30±1.47###35.00±1.52###CSL18.30±1.37###30.43±2.80###21.73±1.38###16.80±1.55###16.10±1.01###37.22±2.29###L-CSFL16.63±1.43###30.30±3.00###27.73±1.27###23.70±1.22###15.37±1.36###37.02±2.18###H-CSFL16.67±2.54###29.93±0.91###30.10±3.02###24.60±1.54###17.57±3.01###37.74±1.46###
2.4 CSFL对2型糖尿病小鼠胰岛素及HOMA-IR的影响
胰岛素水平升高与胰岛素抵抗的增加存在实质性联系[16-17]。由图2A可知，与NC组相比，MD组血清胰岛素水平极显著升高（P＜0.001），说明小鼠发生胰岛素抵抗。经灌胃4周治疗后，与MD组相比，H-CSFL组胰岛素浓度极显著下降至8.50 mIU/L（P＜0.001），与金丹莉等[18] 的研究结果相一致。由图2B可知，与NC组相比，MD组HOMA-IR极显著增加（P＜0.001）。经灌胃4周治疗后，Met、CSL、L-CSFL组和H-CSFL组HOMA-IR均有不同程度的降低。与MD组相比，Met、H-CSFL组HOMA-IR分别极显著降低52.59%、37.25%（P＜0.001）；L-CSFL组高度显著降低32.47%（P＜0.01）；CSL组显著降低17.49%（P＜0.05）。这些结果表明，CSFL能够有效改善2型糖尿病引起的胰岛素抵抗。
图2 CSFL对2型糖尿病小鼠胰岛素（A）及HOMA-IR（B）的影响
Fig.2 Effect of CSFL on insulin (A) and homeostatic model assessment for insulin resistance (B) in type 2 diabetic mice
2.5 CSFL对2型糖尿病小鼠血脂水平的影响
糖脂代谢间具有密切的关联性，糖尿病患者通常伴有脂代谢异常情况，血脂水平可直观反映机体脂代谢状态。在代谢相关疾病管理中，调控血脂水平被视作为与调控血糖水平同等关键的干预环节[19]。如图3所示，与MD组相比，H-CSFL组小鼠TC水平极显著降低（P＜0.001）；CSL、L-CSFL组和H-CSFL组TG水平高度显著降低（P＜0.01）；CSL、L-CSFL组及H-CSFL组LDL-C水平极显著下降34.92%、40.11%、42.02%（P＜0.001）。MD组小鼠HDL-C水平高度显著低于NC组小鼠（P＜0.01），与MD组相比，H-CSFL组小鼠HDL-C浓度极显著升高（P＜0.001）。这些结果表明，CSFL对脂质代谢的调节具有明确且积极的意义，其可通过增加HDL-C含量，降低TG、TC及LDL-C水平改善脂质代谢失衡，发挥降血糖作用，与景怡等[20]研究结果相一致。
图3 CSFL对2型糖尿病小鼠血脂水平的影响
Fig.3 Effect of CSFL on blood lipid levels in type 2 diabetic mice
2.6 CSFL对2型糖尿病小鼠氧化应激水平的影响
高血糖状态下，糖基化终产物及自由基产生增加，推动脂质过氧化进程，导致氧化损伤产物蓄积。由此可见，氧化应激水平在一定程度上可反映血糖水平[21]。其中，GSH-Px作为清除超氧产物的核心酶，对维持机体氧化损伤水平稳定具有重要调控作用；而MDA含量变化可直接用于评估机体脂质过氧化反应程度。由图4 可知，与NC组相比，MD组MDA浓度高度显著升高 （P＜0.01），这些变化可能是由于细胞内氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized/reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+/NADH）增加，NADH或NAD+通过呼吸链电子转运体传递的电子泄漏增加，导致机体内活性氧生成量增多，清除速率失衡引发蛋白质、DNA及脂质过氧化反应，最终导致生物大分子氧化损伤。这与Zhang等[22]研究结果相一致。与MD组相比，Met、CLS、L-CSFL、H-CSFL组GSH-Px含量均极显著升高（P＜0.001），MDA浓度不同程度降低，H-CSFL组CAT活性显著升高（P＜0.05）。上述结果表明，CSFL可显著提高机体CAT活性、GSH-Px含量，降低MDA含量，改善抗氧化酶异常及相关的氧化应激损伤。
图4 CSFL对2型糖尿病小鼠氧化应激水平的影响
Fig.4 Effect of CSFL on oxidative stress levels in type 2 diabetic mice
2.7 CSFL对2型糖尿病小鼠肝功能的影响
糖尿病患者长期处于高血糖状态，易诱发多器官并发症，肝肾功能损伤其中典型且重要的临床表现[23]。由图5可知，MD组小鼠ALT和AST活性显著高于NC组（P＜0.001、P＜0.05）。经过二甲双胍和CSFL干预治疗后，相比MD组，Met组和L-CSFL、H-CSFL组AST活性均显著下降（P＜0.05），分别降低15.27%、13.63%、15.13%。CSL组和L-CSFL、H-CSFL组ALT均无显著变化（P＞0.05）。与Tao Zhipeng等[24]的研究结果相一致，表明CSFL可改善小鼠肝功能受损情况。
图5 CSFL对2型糖尿病小鼠肝功能的影响
Fig.5 Effect of CSFL on liver function in type 2 diabetic mice
2.8 CSFL对2型糖尿病小鼠脏器指数的影响
2型糖尿病会引起机体器官病变，脏器指数是反映脏器受损程度的关键指标之一[25]。如表3所示，与NC组相比，MD组小鼠肝脏、脾脏、肾脏指数极显著升高 （P＜0.001），说明高脂饮食可增加小鼠患脂肪肝的风险。与MD组相比，Met组胰腺、肾脏指数显著变化 （P＜0.05），其他各组均无显著差异（P＞0.05）；各组脾脏指数均无显著差异（P＞0.05）；Met、L-CSFL、H-CSFL组肝脏指数均极显著升高（P＜0.001）；L-CSFL组心脏指数无显著差异（P＞0.05），其他各组心脏指数显著升高（P＜0.05）。这与Yang Mingjun等[26]的研究结果相似。结果表明，CSFL可有效改善2型糖尿病模型小鼠降低的脏器指数，使其恢复至接近正常水平，对糖尿病所致的脏器萎缩具有一定缓解作用。
表3 CSFL对2型糖尿病小鼠脏器指数的影响
Table3 Effect of CSFL on organ index in type 2 diabetic mice
组别心脏指数/%肝脏指数/%脾脏指数/%肾脏指数/%胰腺指数/%NC0.54±0.063.45±0.120.21±0.031.29±0.080.72±0.04 MD0.48±0.07***3.90±0.10***0.24±0.03***1.43±0.13***0.54±0.07***Met0.53±0.05#3.49±0.08###0.23±0.031.25±0.09#0.55±0.10#CSL0.54±0.07#3.76±0.13##0.25±0.041.33±0.110.54±0.05 L-CSFL0.52±0.063.63±0.08###0.25±0.031.36±0.260.52±0.06 H-CSFL0.53±0.07#3.53±0.12###0.26±0.041.33±0.130.58±0.09
2.9 CSFL对2型糖尿病小鼠组织病理形态的影响
由图6所示，NC组肝细胞密集且排列规则，细胞团与周围组织界限清晰，肝细胞排列紧凑。而MD组部分肝细胞出现细胞质染色不均，细胞排列结构疏松呈空泡。肝细胞团出现萎缩，细胞数量减少，局部肝细胞脂肪变性较显著；Met组形态规则，肝细胞之间的间隙结构正常，局部少数肝细胞可见水肿、脂肪小空泡，未见炎性细胞大量浸润。CSL组肝组织可见散在小空泡，存在轻度空泡变性；L-CSFL组血管周围增生程度也有所减弱，出现轻度肿胀，胞浆疏松，同时肝脏脂质积累问题得到显著改善，存在轻度空泡变性；H-CSFL组小鼠脂肪空泡减小，肝脏组织中炎性细胞浸润现象明显减少。进一步观察发现，随着灌胃剂量的增加，小鼠肝脏细胞的结构愈发清晰、完整。这一结果表明，CSFL能够在不同程度上减轻2型糖尿病小鼠肝脏组织的损伤，可对受损组织进行修复，发挥肝脏保护作用。
图6 CSFL对2型糖尿病小鼠肝脏病理形态的影响（×200）
Fig.6 Effect of CFL on the liver histopathology of type 2 diabetic mice (×200)
高糖高脂饮食和链脲佐菌素联合诱导可造成胰岛功能受损，造成胰岛素分泌下降[27]。如图7所示，NC组胰岛形态完整，无结构破损或变形，同时胰岛细胞数量较多，分布均匀，不存在胞质空泡化的情况。MD组出现胰岛形状不规则及萎缩，胰岛细胞分布稀疏、数量较少等情况；CSL组可见腺泡结构紊乱，胰岛形态受损，伴随大量炎症细胞浸润，呈现明显胰腺组织损伤特征；L-CSFL组可见腺泡细胞肿胀、胞浆空泡化，部分腺泡结构紊乱，提示存在胰腺腺泡损伤；H-CSFL组胰岛细胞数量增加（图片左上区域），胰岛萎缩现象得到改善。各剂量CSFL组小鼠胰岛结构更趋规则，胰岛细胞数量有所增加，胰岛萎缩现象得到改善。相关组织病理学研究[28]表明，糖尿病可造成小鼠组织形态学损伤，诱发不同程度的病变；而通过不同剂量CSFL灌胃治疗后，糖尿病小鼠胰腺组织损伤得到不同程度改善，提示CSFL可促进受损胰腺组织修复。
图7 CSFL对2型糖尿病小鼠胰腺病理形态的影响（×200）
Fig.7 Effect of CSFL on the pancreas histopathology of type 2 diabetic mice (×200)
2.10 CSFL对2型糖尿病小鼠肠道菌群的影响
2.10.1 肠道菌群多样性
如图8A～D所示，各组小鼠肠道菌群ACE指数无显著差异（P＞0.05）；与MD组相比，CSL组和CSFL组Chao1指数存在不同程度地显著提高（P＜0.05、P＜0.01）；MD组小鼠Shannon指数极显著低于NC组（P＜0.001），显著低于L-CSFL组和H-CSFL组（P＜0.05）；与MD组相比，L-CSFL组和H-CSFL组Simpson指数显著增加（P＜0.05），Met组的Simpson指数极显著增加（P＜ 0.001）。综上，各处理对肠道菌群物种丰富度无明显影响，但可有效提升菌群多样性，改善糖尿病模型小鼠肠道菌群结构紊乱的状态。如图8E所示，6组样本共有分类操作单元（operational taxonomic units，OTU）263个， 而NC、MD、Met、CSL、L-CSFL组和H-CSFL组特有OTU个数分别为1 108、1 172、1 030、1 321、1 377和1 480。其中Met组OTU数目最少，CSL、L-CSFL和H-CSFL组均有不同程度增加，说明高脂诱导后会干预小鼠肠道菌群的种类数目。CSFL干预可增加小鼠肠道菌群的特有OTU数目，其中H-CSFL组的增幅最大。
图8 肠道菌群多样性、物种OTU Venn图及PLS-DA得分图
Fig.8 Gut microbiota diversity, operational taxonomic unit Venn diagram and partial least squares-discriminant analysis score plot
PLS-DA强调组间的系统性差异，同时最小化组内的随机差异。如图8F所示，NC组和MD组在PLS-DA得分图中完全分开，且与实验组完全分开、无重叠，说明MD组小鼠的肠道菌群结构发生显著变化。Met组与CSL、L-CSFL、H-CSFL组存在较大重叠，即CSFL干预小鼠肠道菌群表现出与Met组较大的相似性，表明CSFL可在一定程度上改善小鼠肠道菌群多样性。
2.10.2 肠道菌群结构
肠道菌群对胰岛素抵抗和餐后葡萄糖应答具有重要调控作用。近年来研究表明，补充益生元可重塑肠道菌群结构、改善肠道屏障通透性，提升血浆胰高血糖素样肽水平，进而降低餐后血糖。另有研究发现，益生菌可调控肠道菌群结构，菌群代谢产物进一步调控宿主肠道内分泌细胞分泌肠促胰岛素，有效下调糖尿病模型小鼠的血糖浓度[29]。本研究首先通过稀释曲线分析探究测序数据量对样本物种丰富度表征的影响。针对肠道菌群的分类特征，分别在门水平和属水平层面比较各组差异。
如图9A所示，在门水平上，拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes）是小鼠肠道菌群中的优势菌群，对维持肠道微生态基础结构具有重要作用。与NC组相比，MD组的Firmicutes和Bacteroidota相对丰度下降。经CSFL干预后，糖尿病小鼠肠道菌群的疣微菌门（Verrucomicrobiota）相对丰度上升。Verrucomicrobiota作为一种广泛分布在健康人体肠道中的有益细菌，当体内Verrucomicrobiota数量或丰度降低时，往往意味着肠道微生物群落结构失衡，表明肠道生态系统出现紊乱状 态[30]，提示可能存在调节炎症发生的正反馈作用。Met组Bacteroidota相对丰度进一步降低，Firmicutes相对丰度下降，Verrucomicrobiota相对丰度上升，表明二甲双胍干预显著改变了菌群结构，对Verrucomicrobiota的富集作用尤为突出。与Met组相比，CSL、L-CSFL组和H-CSFL组Bacteroidota相对丰度均有增加，CSFL干预可有效调节菌群结构，对肠道微生物群的稳定性和结构弹性有更显著的影响。微生物群落的这种稳定性可能有利于长期肠道健康，因为均衡的微生物群与提高代谢效率、改善血糖控制和减少慢性炎症有关。
图9 各组小鼠结肠内容物菌群门水平（A）及属水平（B）微生物组成变化
Fig.9 Changes in the microbial composition at phylum level (A) and genus level (B) of cecal contents in mice from each group
如图9B所示，在属水平上，与NC组相比，摄入不同剂量CSFL和二甲双胍后，杜氏杆菌属（Dubosiclla）相对丰度明显降低，而阿克曼菌属（Akkermansia）相对丰度升高、双歧杆菌属（Biofidobacterium）相对丰度降低。Biofidobacterium可产生乳酸、乙酸等SCFAs，降低肠道pH值，抑制沙门氏菌、大肠杆菌等致病菌的生长繁殖，同时与乳酸菌、Akkermansia等益生菌协同作用，维持肠道菌群多样性与稳定性。同时，膳食纤维对代谢性疾病及免疫反应具有调控作用，具体机制为通过增加Akkermansia相对丰度延缓代谢性疾病发展[31]。上述结果表明，CSFL能够对糖尿病小鼠肠道菌群丰度产生积极影响，有助于改善糖尿病状态下的肠道微生态失衡。
2.11 LEfSe差异分析
LEfSe运用线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）得分评估差异微生物对组间区别的影响程度。LDA得分越高，该微生物在区分不同组别时的作用越显著。以LDA得分＞3.0、P＜0.05筛选标准对显著差异物种进行分析。由图10A可知，将6组小鼠盲肠内容物样品的微生物组成进行对比分析，发现在门、纲、目、科和属分类水平上分别存在6、6、9、12和24个差异显著物种。由图10B可知，NC组中起重要作用的生物标志物主要为Muribaculaceae、黄杆菌属（Flavobacterium）和杜伯氏菌属（Dubosiella）。其中，Dubosiella是一种肠道有益菌，在维系宿主肠稳态过程中具有重要免疫调节功能[32]；Met组中起重要作用的生物标志物为Akkermansia，Akkermansia是一种肠道有益菌，研究表明，提升其丰度可改善肥胖及糖尿病患者代谢紊乱状况[33]；MD组中起重要作用的生物标志物为阿里斯氏菌属（Alistipes）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、Atopobiaceae等，Alistipes可通过发酵复杂多糖生成SCFAs，该产物可进一步参与宿主能量代谢调节[34-35]。CSL组中起重要作用的生物标志物副萨特氏菌属（Parasutterella）、丁酸单胞菌属（Butyricimonas）、厌氧支原体属（Anaeroplasma）等，其中Parasutterella是肠道重要共生菌[36]，Butyricimonas为核心产丁酸菌，可增强肠道黏膜屏障、抑制炎症[37]；L-CSFL组中起重要作用的生物标志物为瓦伦斯回肠杆菌（Ileibacterium valens）、链球菌属（Streptococcus）等；H-CSFL组中起重要作用的生物标志物为Pygmaiobacter、反刍真杆菌群（Eubacterium_ruminantium_group）等，后者丰度升高可通过增加SCFAs生成改善肠道屏障功能、降低慢性炎症[38]。本研究中，以上菌属为各组的差异菌属，提示CSFL和二甲双胍干预可通过调节肠道中相关有益菌丰度改善肠道屏障、降低炎症、增强免疫反应等发挥降血糖作用。
图10 不同分类水平差异物种的LEfSe进化分支图（A）和LDA得分柱状图（B）
Fig.10 Linear discriminant analysis effect size taxonomic cladogram (A) and linear discriminant analysis score histogram (B) of taxa enriched at different taxonomic levels
2.12 CSFL对小鼠粪便中SCFAs含量的影响
SCFAs作为肠道菌群发酵不易消化碳水化合物的特征性代谢产物，是维持肠道屏障完整性、调节肠道动力等正常功能的关键效应分子[39]。由表4可知，2型糖尿病小鼠粪便SCFAs中，乙酸、丙酸、丁酸点比较高。与NC组相比，MD组乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸含量均极显著降低（P＜0.001），这与Wang Gang等[40] 的研究结果相一致。与MD组相比，Met、CSL、CSFL组6种SCFAs含量均有不同程度增加，对于乙酸、丙酸，各组均有极显著差异（P＜0.001）；对于丁酸，仅Met组无显著差异（P＞0.05）；对于戊酸，CSL组和H-CSFL组有极显著差异（P＜0.001）；对于异戊酸，CSL组和L-CSFL组有极显著差异（P＜0.001）。研究表明，SCFAs在能量代谢中发挥关键作用，这也表明其有望成为预防、改善代谢紊乱及相关疾病的营养作用靶点，其中乙酸可降低食欲、参与脂肪代谢[41]；丙酸可降低血脂、抑制胆固醇合成、提高胰岛素敏感性、抑制食欲[42]； 补充丁酸可缓解小鼠胰岛素抵抗并增加能量消耗、增强肠道黏膜的免疫防御能力、调节神经炎症、阻止有害物质通过肠道进入血液循环[43]。结果表明，CSFL可能通过调控SCFAs水平进一步缓解2型糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱。
表4 CSFL对2型糖尿病小鼠粪便中SCFAs含量的影响
Table4 Effect of CSFL on short-chain fatty acids levels in feces of type 2 diabetic mice
μg/g分组乙酸丙酸丁酸异丁酸戊酸异戊酸NC673.32±8.68237.45±1.91104.68±3.0121.48±0.1316.26±0.3316.03±0.43 MD665.40±21.48***142.81±0.87***67.32±1.23***10.39±0.02***9.69±0.32***14.77±0.29***Met718.46±4.61###295.96±5.84###70.50±0.2518.55±0.33###10.07±0.2713.27±0.20 CSL776.24±2.20###234.19±5.69###87.78±0.95###15.12±0.28###21.60±0.28###12.69±0.17###L-CSFL615.50±3.68###233.34±7.20###119.87±1.91###17.13±0.61###11.07±0.12##8.45±0.06###H-CSFL931.48±5.67###243.40±4.69###149.10±3.95###18.54±0.76#28.24±0.82###17.80±0.51##
3 结 论
本研究以玉米须为原料，分别制备其水提液（CSL）与多菌种复合二次发酵液（CSFL），探究二者对高血糖小鼠的干预效应及相关机制。结果表明，CSFL与CSL均可改善高血糖小鼠的生理代谢指标，以CSFL作用更为显著。CSFL可更显著降低FBG水平、提升葡萄糖耐受能力；在调节糖脂代谢方面，CSFL可更有效升高胰岛素水平，降低TC、TG及LDL-C水平，提升HDL-C水平，缓解血脂代谢紊乱效果优于CSL；还具备肝脏保护能力，通过显著提高CAT、GSH-Px水平，降低MDA水平，减轻肝脏氧化应激反应，减少机体氧化损伤，维护肝细胞完整性；HE染色结果证实，其能明显减轻肝组织变性，减少肝组织空泡状结构，对糖尿病小鼠肝脏、胰腺组织损害具有缓解和修复作用，在肠道微生态方面，CSFL可更显著调节肠道菌群结构与多样性，而CSL仅表现出温和的调节作用，表明发酵工艺可显著提升玉米须的生物活性。玉米须作为药食同源原料，对2型糖尿病模型小鼠具有安全性高、作用显著、无明显不良反应等优势，提示其在降血糖领域有着巨大的市场潜力和应用价值。本研究表明CSFL有望作为功能性食品成分辅助治疗糖尿病，为玉米须的高值化利用提供理论基础。另外，CSFL降血糖功效的更深层次作用机制尚需开展进一步研究。
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