酱香型白酒是中国4大基本香型之一,以酱香优雅、入口醇厚、回味悠长著称[1]。其酿造工艺复杂,高温大曲作为核心糖化发酵剂,以小麦为原料,经“制曲成型、高温发酵、长期储存”工艺制备,发酵温度可达60~70 ℃,富集耐热微生物,推动糖化发酵并生成关键风味物质[2]。曲房作为高温大曲制备场所,多为相对封闭环境,有利于维持微生物代谢与群落稳定。近年来,随着北方等非核心产区酱香型白酒的兴起[3-6],空气微生物在不同酿造区域中的作用逐渐受到关注。
目前,白酒微生物研究主要集中在酱香型白酒大曲[7-8]、酒醅[9-10]、窖泥[11-12]等方面,浓香型和凤香型白酒的酿造车间及厂区空气微生物群落分析亦有报道,康承霞等[13]对四川某浓香型酒厂老车间四季空气微生物进行高通量测序分析发现,不同季节和区域细菌和真菌的多样性及优势群落存在差异;王秀秀等[14]研究某浓香型酒厂厂区、车间内外空气微生物群落,发现细菌类群比真菌更丰富,且厂区内微生物多样性最高;徐晨等[15]对西凤酒新老制酒车间的空气真菌和细菌分布进行分析发现,不同车间和季节的优势菌群存在明显差异。然而,北方地区酱香型白酒厂区、制曲车间和酿酒车间空气微生物研究鲜见报道。
本研究采用高通量测序技术对北方地区酱香型白酒厂区、制曲车间及酿酒车间空气样品中的细菌与真菌群落进行分析,并对微生物进行关联分析,旨在系统解析不同区域空气中细菌与真菌的群落结构、优势种类及其潜在功能,明确微生物在酿造环境中的空间分布规律,为酱香型白酒风味形成及工艺优化提供科学依据。
空气样本取自山东某白酒酒厂;引物 生工生物工程(上海)股份有限公司;DNA Marker 日本Takara公司;琼脂糖 南京生兴生物技术有限公司;GeneGreen核酸染料 上海赛百盛基因技术有限公司;E.Z.N.A.土壤基因组DNA提取试剂盒 美国BioTek公司。
CP1502电子天平 奥豪斯仪器有(上海)限公司;HH-S6A电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司;PX2聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪上海赛默罗生物科技有限公司;DYY5稳压电泳仪北京六一仪器厂;Tanon 1600凝胶成像仪 上海天能科技有限公司;NanoDrop 2000超微量分光光度计 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;LB-KHW-6撞击式空气微生物采样器 青岛路博建业环保科技有限公司。
1.3.1 样品取样方法
选取酱香型白酒厂区环境(CQ)、酿造车间(CJ)、制曲车间(QF)进行微生物采样。采样时间为6月份,为酒厂制曲及酱香型白酒5轮次关键发酵环节,此时空气中微生物活性较高,能够较真实地反映酿造环境的微生物群落特征。空气采样高度设置为距地面50 cm,以代表工作层面空气微生物的实际暴露情况。使用空气微生物采样器进行采集,采样介质为直径8 cm、孔径0.22 μm的无菌醋酸纤维滤膜,采样器流量28.3 L/min,单点采样时长15 min、采样总气量424.5 L。采集结束后,将滤膜取出并装入无菌袋中,送至中国食品发酵工业研究院进行分析检测。
1.3.2 DNA提取、PCR扩增及高通量测序
按E.Z.N.A.土壤基因组DNA提取试剂盒说明书提取空气样品总DNA。提取完成后,通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,以提取的宏基因组DNA为模板,分别对细菌16S rRNA基因V4~V5高变区和真菌ITS1区进行PCR扩增,扩增引物均携带Barcode序列。细菌16S rRNA基因V4~V5区扩增引物为515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。PCR扩增体系:5×TransStart FastPfu缓冲液4 μL、dNTPs 2 μL(2.5 mmol/L)、上下游引物各0.8 μL(5 μmol/L)、TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL、模板DNA 10 ng,使用ddH2O补足至20 μL。PCR扩增条件:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共27个循环;72 ℃再延伸10 min,4 ℃保存。真菌ITS1区扩增引物为ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR扩增体系及条件同细菌。PCR产物使用DNA凝胶回收纯化试剂盒纯化后进行定量分析。
纯化后的PCR产物用于建库,并在Illumina PE250平台上进行高通量测序。
测序数据经去除低质量序列、接头和引物序列后,按照标准生物信息学流程进行序列拼接、质量控制、操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)聚类及物种注释分析。
基于有效数据进行OTU聚类和物种分类分析,并将OTU和物种注释结合,从而得到每个样品的OTU和分类谱系的基本分析结果。本研究采用97%的相似度阈值,即序列相似度不小于97%的序列被归为同一个OTU,以代表同一物种。随后选择每个OTU的代表序列进行物种注释,基于上海元莘生物平台进行α-多样性分析、群落结构和统计分析,采用Origin 2018对数据、图表进行可视化。
Chao1指数和Observed_species用于衡量群落物种丰富度,数值越高表明群落中物种种类越丰富;Shannon指数和Simpson指数(采用1-D形式)反映群落多样性水平,前者越高表示群落多样性越高,后者越小表明群落优势物种越集中、多样性越低。Pielou’s_evenness用于评估群落均匀度,数值趋近于1时,表明各物种分布越均匀;Goods_coverage用于评估测序深度,其值越高说明样本中未被检测到序列的概率越低,测序结果越能够真实反映样本微生物群落结构[16]。如表1所示,在细菌群落方面,样品CQ的丰富度最高,Chao1指数和Observed_species分别为3 342和3 335,约为样品QF(1 857和1 857)的1.8倍,为样品CJ(940和940)的3.5倍以上,表明厂区空气中细菌物种数量远多于2个生产车间。样品CQ的Shannon指数(5.37)和Simpson指数(0.62)均最高,反映其细菌群落物种丰富,且Pielou’s_evenness(0.81)处于较高水平,说明其细菌群落物种丰富且分布较为均匀,整体多样性最优。样品QF的Shannon指数(4.81)高于CJ(4.07),但Simpson指数(0.22)低于CJ(0.43),QF虽具有较高的物种丰富度,但群落中可能存在少数高度优势物种,导致Simpson多样性指数低于CJ,提示QF虽具有较高的物种丰富度,但群落中可能存在少数高度优势物种,导致物种均匀性相对较差(Pielou’s_evenness=0.72)。样品CJ细菌群落的丰富度、多样性和均匀度指数均较低,表明其群落结构相对单一。
表1 酒厂不同区域空气微生物α-多样性指数
Table1 α-Diversity indices of airborne microorganisms in different distillery zones
编号指数指数指数evennessspeciescoverage CQ3620.083.600.683620.99微生物样品Chao1SimpsonShannonPielou’s_Observed_Goods_CQ3 3420.625.370.813 3350.99细菌CJ9400.434.070.679400.99 QF1 8570.224.810.721 8570.99真菌CJ190.202.090.46191.00 QF370.222.080.48371.00
在真菌群落方面,样品CQ的物种丰富度最高,Chao1指数和Observed_species均为362,分别约为样品QF(37)的10倍和样品CJ(19)的19倍。多样性方面,样品CQ的Shannon指数(3.60)明显高于CJ(2.09)和QF(2.08),Pielou’s_evenness(0.68)亦优于样品CJ(0.46)和样品QF(0.48),表明厂区真菌群落物种组成更丰富、分布更均衡。样品CJ与QF的真菌群落多样性和丰富度均处于较低水平,Shannon指数接近(2.09 vs 2.08),群落结构较为简单。
综上,厂区(CQ)在细菌和真菌的丰富度、多样性及均匀度方面均显著优于酿造车间(CJ)和制曲车间(QF),而后两者的微生物群落多样性普遍较低,其中CJ的细菌多样性最差;CJ与QF的真菌多样性相近。这种差异可能与厂区作为开放环境接纳了更多来源的空气微生物有关,而生产车间相对封闭的工艺环境对微生物群落产生了较强的选择作用。
由图1A可知,3个样品细菌总OTU为3 964个。各样品特有OTU方面,CQ独有1 787个,远高于QF(767个)和CJ(322个),结合表1中CQ的Shannon指数(5.37)和Pielou’s_evenness(0.81)最高,表明样品CQ不仅独有OTU种类最多,其细菌群落的多样性与均匀性亦最优。两两交集方面,CQ与QF共有710个OTU;CQ与CJ共有150个OTU;CJ与QF之间共有27个OTU,3个样品共有OTU为201个,表明部分细菌类群在酒厂各区域空气中具有普遍分布的特性。总体而言,CQ与2个生产车间之间存在较大比例的共有细菌类群,而CJ与QF之间的共有OTU极少,反映出细菌群落的高度分化,不同车间环境对群落结构具有较强的筛选效应。
图1 酒厂不同区域空气样品细菌(A)和真菌(B)OTU的Venn图
Fig.1 Venn diagrams of bacterial (A) and fungal (B) OTUs in airborne samples from different distillery zones
由图1B可知,3个样品真菌总OTU数为399个,各样品特有OTU数由高到低依次为:厂区(CQ)350个、制曲车间(QF)24个、酿造车间(CJ)11个,CQ的真菌独有种类远多于2个生产车间。两两交集方面,CQ与QF共有6个OTU,CJ与QF共有4个,CQ与CJ仅共有1个,3个样品共有OTU为3个。上述结果表明,厂区真菌群落具有高度的独特性,与2个生产车间的真菌组成差异显著;CJ与QF共有OTU极为有限,反映出不同生产区域空气真菌群落的高度分化。这种差异可能与各区域空气环境及生产工艺设施的特殊性密切相关[17]。
2.3.1 基于门水平的微生物群落结构
2.3.1.1 基于门水平的细菌群落结构
在门水平上,从酒厂不同区域空气样品中共注释到12个细菌门,结果见图2。3个样品共注释到11个优势细菌门(相对丰度≥1%)。样品CQ主要优势菌门为变形菌门(Proteobacteria,52.38%)、拟杆菌门(Bacteroidota,7.14%)、放线菌门(Actinobacteriota,23.69%);样品QF主要优势菌门为变形菌门(36.85%)、厚壁菌门(Firmicutes,33.03%)、拟杆菌门(9.84%);样品CJ主要优势菌门为厚壁菌门(35.40%)、拟杆菌门(29.80%)、变形菌门(13.43%);此外,低丰度菌门在3个样品中的检出情况存在明显差异。Patescibacteria在样品CQ中相对丰度最高(3.20%),而在样品 QF(0.52%)和CJ(0.27%)中相对丰度较低;绿弯菌门(Chloroflexi)在样品CQ(1.46%)、QF(0.87%)和 CJ(0.80%)中均有检出;酸杆菌门(Acidobacteriota)在样品CQ(1.11%)中相对丰度最高,QF次之(0.66%),CJ最低(0.10%)。张红霞[18]对酱香型白酒酒醅中微生物的研究表明,酿酒车间(CJ)中的酒醅微生物群落与空气中的细菌群落具有较为密切的联系。
图2 基于门水平酒厂不同区域空气样品细菌群落结构
Fig.2 Bacterial community structure of airborne samples from different distillery zones at the phylum level
酒醅中厚壁菌门和变形菌门与酿酒车间空气中的部分优势菌门具有一定相似性。此外,酿酒车间酒醅中变形菌门相对丰度较高的特点也与空气中变形菌门的分布趋势相吻合,表明酒醅与车间空气微生物之间的相互作用密切,这可能是由于周期性生产过程中,酒醅与大曲中的微生物相互影响,共同塑造彼此的菌群结构,导致二者形成相似的微生物群落。其中厚壁菌门和变形菌门在酿酒过程中的作用至关重要。厚壁菌门中的乳酸菌和芽孢杆菌等在酒醅和大曲发酵中点主导地位,能够调节发酵环境的pH值,抑制有害微生物的生长,并促进乙醇和香气物质的生成[19]。变形菌门主要包括嗜氧或兼性厌氧的细菌,在酿酒底物的营养转化过程中具有一定作用。
2.3.1.2 基于门水平的真菌群落结构
在门水平上,从酒厂不同区域空气样品中共注释到4个真菌门,结果见图3。3个样品共注释到4个优势真菌门(相对丰度≥1%),白酒厂不同区域空气样品的真菌群落均以子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)为主要优势类群,但组成存在差异:厂区(CQ)的子囊菌门相对丰度为52.37%,担子菌门相对丰度为36.11%,未分类真菌相对丰度为9.47%,接合菌门(Zygomycota)相对丰度为2.03%;制曲车间(QF)中子囊菌门相对丰度为88.95%,担子菌门相对丰度为10.99%,未分类真菌相对丰度为0.06%;酿造车间(CJ)中子囊菌门相对丰度为72.15%,担子菌门相对丰度为27.85%,未检出其他真菌门。
图3 基于门水平酒厂不同区域空气样品真菌群落结构
Fig.3 Fungal community structure of airborne samples from different distillery zones at the phylum level
向绪军等[20]的研究表明,高温大曲的真菌群落结构中子囊菌门的相对丰度高达95.98%,与制曲车间(QF)空气真菌群落的组成特征具有一定相似性。这种相似性表明,制曲车间空气中的真菌可能通过气溶胶或颗粒物沉降等方式进入大曲,进而对大曲发酵过程产生影响,二者之间存在潜在的相互作用。子囊菌门和担子菌门在酿酒过程中发挥着不同的功能作用。子囊菌门中的酵母菌(如Saccharomyces cerevisiae)是白酒发酵的核心微生物,负责将糖转化为乙醇和二氧化碳,并生成多种风味化合物,直接影响酒的品质、口感和乙醇体积分数[21]。担子菌门在酿酒体系中相对丰度较低,但其所含的木质纤维素降解菌能够分解纤维素和木质素等复杂底物[22],为酵母的发酵活动提供可利用的可发酵糖,参与某些传统酿酒工艺中特定风味物质的形成。
2.3.2 基于属水平的微生物群落结构
2.3.2.1 基于属水平细菌群落结构
由图4可知,共注释到42个细菌属,39个优势细菌属。厂区(CQ)优势细菌属共17个,前5位依次为糖多孢菌属(Saccharopolyspora,11.76%)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas,9.11%)、袁其朋氏菌属(Qipengyuania,4.89%)、假单胞菌属(Pseudomonas,4.54%)和不动杆菌属(Acinetobacter,3.41%),其他12个优势属丰度介于1.01%~2.83%之间;制曲车间(QF)优势细菌属共18个,前5位依次为克罗彭斯特菌属(Kroppenstedtia,11.52%)、假单胞菌属(8.35%)、芽孢杆菌属(Bacillus,7.37%)、枝芽孢杆菌属(Virgibacillus,5.07%)和奇异球菌属(Deinococcus,4.32%),其他13个优势属丰度介于1.11%~4.31%之间;酿酒车间(CJ)优势细菌属共19个,前5位依次为拟杆菌属(Bacteroides,19.23%)、梭杆菌属(Fusobacterium,9.63%)、普雷沃菌属(Prevotella,7.45%)、瘤胃球菌属(Ruminococcus,6.90%)和粪杆菌属(Faecalibacterium,3.94%),其他14个优势属丰度介于1.13%~3.86%之间。
图4 基于属水平酒厂不同区域空气样品细菌群落结构
Fig.4 Bacterial community composition of airborne samples from different distillery zones at the genus level
值得注意的是,酿造车间(CJ)空气中检测出较高丰度的拟杆菌属、梭杆菌属、普雷沃菌属、瘤胃球菌属、粪杆菌属等口腔和肠道共存的厌氧菌,合计点比为47.15%。该类菌群通常并非空气环境固有微生物,其在本研究中大量检出的原因可能来自两方面:一方面,该车间存在浓香与酱香共车间生产或浓香车间改造为酱香车间的生产背景,浓香酿造环境中的窖泥、糟醅及人员操作所携带的肠道相关厌氧菌群可能在同一车间内交叉扩散并随气溶胶进入空气样本;另一方面,不排除6月单次采样期间,因操作人员在采样点附近的瞬时活动(如交谈、走动)导致人体来源菌群以气溶胶形式偶然混入样本,即采样期偶发污染的可能性。由于本研究仅为单次采样,尚无法区分上述2种情形,后续需结合多时间点重复采样与操作人员阴性对照实验,进一步验证该类菌群在酿造车间空气中的真实定殖状态与来源。
酒厂3个区域的空气细菌群落组成差异显著,未发现同时存在于3个区域的共有优势细菌属。这种群落分化与各区域的环境及工艺特征密切相关,不同的微气候条件与生产活动对微生物的定殖和富集具有明显的选择效应。厂区作为开放环境,空气中糖多孢菌属相对丰度最高,该菌在白酒酿造中具有重要的生香功能[23]。制曲车间的主要优势菌属为芽孢杆菌属和克罗彭斯特菌属,二者在酱香型白酒酿造中可促进醇类、酯类及吡嗪类等风味物质的生成,对酒体风味的形成具有重要贡献[24];此外,制曲车间空气中奇异球菌属的检出,与王秀秀等[14]在机械化白酒酿造环境中的研究结果一致,也与该酒厂机械化程度较高的生产实际相符。酿造车间则以厌氧菌为主要优势类群,与车间封闭、高湿度的发酵环境相适应。
2.3.2.2 基于属水平真菌群落结构
由图5可知,共注释到31个优势真菌属。厂区(CQ)优势真菌属共16个,前5位依次为Leptodontidium(20.67%)、伞菌属(Amanita,14.71%)、未分类真菌(Fungi_unclassified,9.47%)、Sebacina(8.93%)和子囊菌门未分类属(Ascomycota_unclassified,8.43%),其他优势真菌属相对丰度为1.15%~5.97%;制曲车间(QF)优势真菌属共12个,前5位依次为曲霉属(Aspergillus,42.58%)、发菌科未分类属(Trichocomaceae_unclassified,29.20%)、红曲霉属(Monascus,5.90%)、烟管菌属(Bjerkandera,5.66%)和散囊菌目未分类属(Eurotiales_unclassified,2.14%),其他优势真菌属相对丰度为1.05%~1.73%,呈现以发酵相关霉菌为主的群落特征;酿酒车间(CJ)优势真菌属共12个,前5位依次为红曲霉属(Monascus,35.78%)、侧耳属(Pleurotus,22.92%)、曲霉属(Aspergillus,11.20%)、Rasamsonia(7.12%)和圆盘菌科未分类属(Orbiliaceae_unidentified,4.21%),其他优势属相对丰度为1.37%~4.16%。
图5 基于属水平酒厂不同区域空气样品真菌群落结构
Fig.5 Fungal community composition of airborne samples from different distillery zones at the genus level
值得特别关注的是,侧耳属在酿酒车间空气中相对丰度高达22.92%,其为典型的大型担子菌,通常非白酒酿造环境固有微生物,推测其来源可能包括:车间附近存放或使用含木质纤维素的物料(如菌棒、秸秆、木屑),为担子菌孢子释放提供了基质,或酿酒车间内木质设备或建筑结构的腐朽部位滋生了担子菌子实体,6月温湿度适宜其孢子大量释放进入空气。由于本研究仅为单次采样,尚无法确定侧耳属在酿酒车间空气微生物中的真实定殖状态与持续存在性,还需后续通过多时间点采样及基质溯源分析加以验证。另外,曲霉属在制曲车间和酿酒车间中点有较高丰度,分别为42.58%和11.20%。曲霉属常作为发酵过程中关键霉菌,能够分解淀粉和其他复杂有机物,产生糖化酶和其他酶类,促进发酵反应,提高酒的产量和风味[25]。厂区(CQ)空气样品中的Leptodontidium和伞菌属等可能与酒厂环境中的微生物群落稳定性有关;制曲车间(QF)中的曲霉属(42.58%)点主导地位,这类霉菌在酒曲中具有至关重要的作用,能够产生酶类促进小麦等原料的糖化反应,是发酵过程中不可或缺的微生物;而在酿酒车间(CJ)中,红曲霉属作为优势真菌属,其产生的红色素和酶类能够在发酵过程中影响酒的色泽与风味,同时也对酿酒的发酵过程有一定的酶促作用[25]。
如图6所示,在酿酒车间(CJ)、制曲车间(QF)和生产厂区(CQ)的细菌丰度数据对比中,不同区域显示出明显的菌属分布差异。酿酒车间(CJ)中,Bacteroides、Fusobacterium和[Ruminococcus] gnavus_group相对丰度较高,提示该环境可能更有利于厌氧或发酵相关菌属的富集。制曲车间(QF)中,Kroppenstedtia、Pseudomonas和Bacillus点比较高,可能与制曲过程中的高温、高湿环境有关。厂区(CQ)则以Saccharopolyspora和Sphingomonas为优势菌属,同时Pseudomonas和Qipengyuania相对丰度较高,反映了开放环境接纳多源微生物并形成复杂群落结构的特征。整体来看,不同区域在菌属组成上具有明显的功能与环境适应性差异。
图6 不同酿造区域空气细菌群落组成热图
Fig.6 Heatmap of airborne bacterial community composition across different brewing zones
由图7可知,真菌群落在不同区域之间表现出更强的区域专属性,许多菌属仅在某一区域中检测到较高丰度。酿酒车间(CJ)中,Monascus、Pleurotus和Aspergillus为主要真菌,其中Monascus可能与酒类发酵过程中的红曲代谢相关,Pleurotus通常为大型担子菌,推测其来源于车间中的木质材料或纤维素基质。制曲车间(QF)中,Monascus、Aspergillus和Trichocomaceae_unclassified点主导,显示出曲块制备中常见的丝状真菌群落特征。厂区(CQ)中,Ascomycota_unclassified、Amanita、Leptodontidium等环境真菌较为丰富,可能与室外空气或植被影响有关[26]。
图7 不同酿造区域空气真菌群落组成热图
Fig.7 Heatmap of airborne fungal community composition across different brewing zones
制曲车间(QF)的细菌和真菌群落均表现出最强的工艺相关特异性,其微生物组成与制曲这一生物转化过程高度对应。酿酒车间(CJ)的微生物群落则更多指向厌氧发酵与产物形成阶段的功能特征。厂区(CQ)作为开放式环境,其微生物组成呈现典型的环境本底群落特征,与2个生产车间形成明显区隔。上述结果表明,酒厂各区域空气微生物群落并非随机分布,而是由各区域物理环境条件、生产工艺流程及人员操作活动共同塑造的结果。
本研究采用高通量测序技术解析了厂区环境(CQ)、酿造车间(CJ)和制曲车间(QF)的空气样本微生物群落结构。结果表明,3个区域的微生物群落在丰富度、多样性及物种组成上存在差异。厂区环境(CQ)细菌与真菌的物种丰富度和多样性指数均最高,优势细菌属为糖多孢菌属(Saccharopolyspora)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)等,优势真菌属为Leptodontidium和伞菌属(Amanita)等;制曲车间(QF)呈现出以发酵功能性微生物为主的群落结构,优势细菌属为克罗彭斯特菌属(Kroppenstedtia)、假单胞菌属(Pseudomonas)及芽孢杆菌属(Bacillus)等,优势真菌属为曲霉属(Aspergillus)等;酿造车间(CJ)呈现出以厌氧菌为主的群落结构,其优势细菌属为拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)等,优势真菌属为红曲霉属(Monascus)等。细菌和真菌的群落结构均存在明显的区域特征,厂区空气样本的细菌群落与酿酒车间和制曲车间差异最大。各区域的优势微生物在发酵过程中发挥不同功能,厚壁菌门和子囊菌门在糖化、发酵及风味物质生成中点据核心地位,变形菌门和担子菌门参与营养转化和有机物分解。本研究为解析北方酱香型白酒的微生物生态与区域风味关联、指导生产环境调控及品质提升提供了科学依据。
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