L-肉碱，又称维生素BT，是一类分子式为C7H15NO3的两性离子化合物，其结构同时含季铵基与羧基，因而具有高水溶性。L-肉碱广泛存在于哺乳动物组织中，虽为类氨基酸，却并不参与蛋白质构建，而是在能量代谢中发挥关键作用：将长链脂肪酸转运至线粒体基质，使其经β-氧化产生ATP[1-4]。L-肉碱缺乏会导致脂肪酸氧化受阻及能量代谢紊乱[5]。通常人体通过肝肾合成及膳食摄入获得L-肉碱，主要来源包括红肉、乳制品与水产。鉴于其生理功能，L-肉碱已广泛应用于婴幼儿食品、运动营养品、减脂食品及素食者补充剂[6]，并在畜牧业中作为重要饲料添加剂使用[7]。据报道，2024年全球L-肉碱市场规模达到约2.27亿美元，预计未来几年将以年均5%左右的速率增长。目前L-肉碱的生产方法主要包括以环氧氯丙烷为原料的化学合成法[8-9]、以4-氯乙酰乙酸乙酯为起始物的酶拆分法[10]和以巴豆甜菜碱或γ-丁基甜菜碱为前体的微生物发酵法[11]。其中，微生物发酵法产L-肉碱因环境友好愈发受到研究人员的关注，如卢向锋等[12]从假单胞菌（Pseudomonas sp.）L-1中克隆得到γ-丁基甜菜碱羟化酶基因bbh，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现高效表达；Arense等[13]对E. coli的肉碱代谢网络进行代谢工程改造，构建出高产工程菌，从而实现巴豆甜菜碱近完全转化；Kugler等[14]将源于粗糙脉孢霉（Neurospora crassa）的4步L-肉碱生物合成途径导入E. coli，并结合转录因子生物传感器，验证了利用工程菌从底物生物合成L-肉碱的可行性。而在微生物发酵合成L-肉碱研究中，准确测定前体的消耗量和产物的生成量，对于优化发酵工艺、提高L-肉碱产量具有重要意义。
L-肉碱及γ-丁基甜菜碱的测定方法包括酶法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法及液相色谱-质谱联用法[15-16]。最新发布的GB 5009.300—2025《食品安全国家标准 食品中左旋肉碱的测定》收录了上述3类方法：酶法通过乙酰辅酶A与L-肉碱反应产生可显色的辅酶A；液相色谱-质谱联用法采用同位素内标，有效提高定量准确性；HPLC法通过衍生化反应提高检测的专属性和灵敏度。由于L-肉碱为高极性、带永久正电荷的季铵型化合物，在常规C18柱上的保留较弱[17]，HPLC法的衍生化操作虽能提高其检测灵敏度[18]，但过程繁琐、耗时费力。通过在流动相中加入离子对试剂（如四丁基氢氧化铵、1-辛烷磺酸钠、庚烷磺酸钠等），可有效增强极性化合物在C18柱上的保留时间[19-22]，其机理为离子对试剂与分析物形成疏水性更强的离子对络合物，从而获得更佳的色谱保留与分离效果[23]。
本研究采用实验室前期筛选获得的一株以γ-丁基甜菜碱为前体产L-肉碱的剑菌（Ensifer sp.）WQ-1[24]，基于反相离子对色谱原理[25]，通过优化前处理溶剂、流动相（组成、配比及pH值）、柱温等检测条件，建立免衍生化离子对HPLC法，以期实现发酵液中L-肉碱与γ-丁基甜菜碱的快速同步测定，为微生物产L-肉碱的代谢研究和发酵工艺优化提供可靠的分析方法。
1 材料与方法
1.1 菌种、材料与试剂
剑菌WQ-1由本实验室从土壤中分离诱变获得，保藏编号CCTCC M 20252114。
L-肉碱标准品（纯度99.99%）、无水甜菜碱、1-辛烷磺酸钠、K2HPO4·3H2O、KH2PO4（均为分析纯）、乙腈、甲醇（均为色谱纯） 上海泰坦科技股份有限公司；γ-丁基甜菜碱盐酸盐（纯度98%） 湖北巨胜科技有限公司；磷酸、浓盐酸、硫酸镁（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；Oxoid™酵母提取物粉末美国赛默飞世尔科技公司；0.22 μm微孔滤膜 南通苏品实验器材有限公司。
LB固体培养基（g/L）：蛋白胨10 g、氯化钠10 g、酵母粉5 g、琼脂粉1.5 g，pH 7.0。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
发酵培养基（g/L）：甜菜碱10 g、磷酸氢二钠15 g、KH2PO4 6 g、硫酸镁0.5 g、硫酸铁0.01 g、酵母粉0.2 g、γ-丁基甜菜碱盐酸盐6 g、微量元素液1 mL，pH 7.0。121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
1512 HPLC仪（配有2996二极管阵列检测器和Empower色谱工作站） 美国Waters公司；HO3-A磁力搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；JP-031S 超声波清洗机 深圳市洁盟清洗设备有限公司；TGL-20M冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；SHZ-III隔水式多用真空泵 临海市谭氏真空设备有限公司；AT60/25静音无油空气压缩机 江苏岱洛医疗科技有限公司；T&J-Btype 5L发酵罐 迪必尔（上海）生物工程有限公司；721可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；Amethyst C18-H反向色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 苏州赛分科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 剑菌发酵产L-肉碱
将剑菌WQ-1接种于LB平板培养基，30 ℃活化48 h，接种环取适量菌落接种于不含γ-丁基甜菜碱的发酵培养基中，摇床30 ℃ 220 r/min活化38 h。将活化后的剑菌WQ-1以10%的接种量接种于装有3 L发酵培养基的发酵罐中[26]，搅拌转速500 r/min，通气量1 NL/min，发酵温度30 ℃，发酵时间48～80 h，得到待测发酵液。
1.3.2 标准储备液和盐酸溶液的配制
0.5 mol/L盐酸溶液的配制：精确量取4.2 mL浓盐酸，加入含有超纯水的100 mL容量瓶中，定容，配制成0.5 mol/L的盐酸溶液，4 ℃避光保存备用。
单标溶液的配制：精确称取L-肉碱和γ-丁基甜菜碱标准品1.0 g于100 mL容量瓶中，用0.5 mol/L盐酸溶液定容，得到10 g/L单标储备液，吸取适量体积单标储备液，用0.5 mol/L盐酸溶液稀释，配制得到0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL单标标准曲线工作液，4 ℃保存备用。
混合标准曲线工作液的配制：准确吸取适量的各质量浓度单标储备液于同一容量瓶中，用0.5 mol/L盐酸溶液定容，配制成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 混合标准曲线工作液，4 ℃保存备用。
空白基质发酵培养基标准工作液的配制：取经HPLC法确认、不含目标物的空白基质发酵培养基，配制与上述混合标准曲线工作液相同质量浓度的混合基质标准曲线工作液，4 ℃保存备用。
1.3.3 HPLC法测定L-肉碱和γ-丁基甜菜碱
取10 mL待测发酵液，8 000 r/min 离心5 min，去除菌体和沉淀，将上清液与不同处理溶剂（0.5 mol/L盐酸、乙腈和甲醇）按体积比1∶1混合，过0.22 μm水系微孔滤膜后等待进样分析。
采用Amethyst C18-H反向色谱柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流动相为92% 2 mmol/L 1-辛烷磺酸钠溶液（0.125% KH2PO4+0.125% K2HPO4）+8%乙腈，采用磷酸调整流动相pH值至3.0，等度洗脱，流速1 mL/min，进样量10 μL，柱温35 ℃，检测波长210 nm。
根据L-肉碱和γ-丁基甜菜碱标准品的保留时间定性，采用外标法进行定量分析。
1.3.4 检测条件优化
1.3.4.1 前处理条件的确定
发酵液成分复杂，含有大量蛋白质及其他干扰物质，因此在上机前需对发酵液样品进行适当前处理。本研究分别采用0.5 mol/L盐酸、乙腈和甲醇对发酵液中的目标化合物进行1∶1混合稀释处理，考察不同溶剂对L-肉碱和γ-丁基甜菜碱色谱峰分离性能的影响。
1.3.4.2 流动相的选择
L-肉碱是一种强极性化合物，其在210 nm波长处具有最大紫外吸收峰[27]。由于保留时间较短，使用常规反相色谱柱难以获得理想的分离效果。为改善其在色谱柱上的保留时间，在流动相中加入离子对试剂1-辛烷磺酸钠。该离子对试剂可与L-肉碱形成电中性络合物，从而降低其整体极性，使其在C18色谱柱上得到有效分离。此外，考虑到不同有机溶剂对目标物的分离效果不同，本研究分别考察甲醇-磷酸盐缓冲液体系与乙腈-磷酸盐缓冲液体系作为流动相时目标物的分离效果。
1.3.4.3 乙腈体积分数的优化
乙腈具有较强的洗脱能力，是反相HPLC中常用有机流动相组成之一。本研究考察不同体积分数（4%、6%、8%、10%）乙腈-磷酸盐缓冲液体系对目标物色谱峰分离性能的影响。
1.3.4.4 流动相pH值的优化
在反相HPLC分析中，流动相pH值会显著影响目标物的电离状态，从而改变其保留时间与峰形，进而影响整体分离效果。本研究考察不同pH值（2.5、2.8、3.0、3.2、3.5）流动相对目标物色谱峰分离性能的影响。
1.3.4.5 色谱柱温度的优化
柱温是反相HPLC的重要参数，影响组分在固定相和流动相之间的分配系数、传质速率，进而改变色谱峰保留行为与峰形，影响分离效果。考察不同柱温（30、35、40 ℃）对目标物色谱峰分离性能的影响。
1.3.5 基质效应评价
由于发酵液成分较为复杂，会对目标化合物L-肉碱和γ-丁基甜菜碱的检测信号产生干扰，从而引起基质效应。本研究选用空白发酵培养基为基质配制系列质量浓度基质标准工作液，采用优化后的检测条件上机测定，以目标物峰面积（y）为纵坐标，目标物质量浓度（x）为横坐标绘制L-肉碱和γ-丁基甜菜碱的标准曲线，测定所得基质标准曲线斜率与纯溶剂标准曲线斜率，以两者比值确定基质效应影响程度。
1.3.6 方法学考察
1.3.6.1 标准曲线、检出限与定量限
取L-肉碱和γ-丁基甜菜碱质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的混合基质标准曲线工作液，在优化后的色谱条件下进行测定，以目标物对应峰面积（y）为纵坐标，目标物质量浓度（x）为横坐标绘制L-肉碱和γ-丁基甜菜碱的标准曲线，并得到线性范围及决定系数；检出限（limit of detection，LOD）以3倍信噪比确定，定量限（limit of quantitation，LOQ）以10倍信噪比确定。
1.3.6.2 加标回收率与精密度实验
向空白发酵液样品中分别添加低、中、高3个水平（0.5、1、3 mg/mL）的L-肉碱和γ-丁基甜菜碱标准品，每个水平设置3次平行实验，计算平均加标回收率及其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.3.6.3 微生物发酵液实际样品检测
发酵液按照1.3.3节进行前处理，利用优化后的色谱条件上机检测L-肉碱和γ-丁基甜菜碱的实际含量，在发酵过程中间隔4 h取样并测定发酵液中底物γ-丁基甜菜碱和产物L-肉碱的含量以及菌体的OD600 nm值，以监测整个发酵过程，确定底物具体补料时机。
1.4 数据处理
采用HPLC自带的Empower色谱工作站进行数据采集与定性定量分析，使用Excel 2019进行数据的处理，使用Origin 2024b软件绘图。
2 结果与分析
2.1 检测条件优化结果分析
2.1.1 前处理条件
由图1可知，当采用乙腈对目标物进行处理时， L-肉碱与γ-丁基甜菜碱的色谱峰信号极差，几乎无法检测到；采用甲醇处理时，L-肉碱与γ-丁基甜菜碱的色谱峰峰形较差，无法分开。而采用0.5 mol/L盐酸处理时，两者峰形良好且信号较强，说明采用盐酸处理不仅能够减少发酵液复杂基质对检测的干扰，还可显著提升色谱检测的稳定性和准确性。因此，选择0.5 mol/L盐酸作为最优发酵液处理溶剂。
图1 不同溶剂处理发酵液L-肉碱与γ-丁基甜菜碱色谱图
Fig.1 Chromatograms of L-carnitine and γ-butyrobetaine in fermentation broth treated with different solvents
2.1.2 流动相
由图2可知，甲醇-磷酸盐缓冲液和乙腈-磷酸盐缓冲液2种体系均能实现对目标物的分离。然而，在甲醇体系中，L-肉碱在210 nm波长处的响应较弱，且保留时间偏长，峰形不够理想。相比之下，乙腈体系能使目标物获得更好的峰形与适宜的保留时间。因此，最终选定乙腈-磷酸盐缓冲液体系作为流动相。
图2 甲醇（A）和乙腈（B）流动相体系下L-肉碱与γ-丁基甜菜碱色谱图
Fig.2 Chromatograms of L-carnitine and γ-butyrobetaine under mobile phase systems with methanol (A) and acetonitrile (B)
2.1.3 乙腈体积分数
由图3可知，随着乙腈体积分数在4%～10%范围内增加，2种待测化合物的保留时间均呈明显缩短趋势，同时响应值逐渐增强，峰形趋于对称。但当乙腈体积分数为10%时，2个待测目标物的保留时间过于接近，在分离检测时易产生误差，而当乙腈体积分数为8%时，2种目标物保留时间适中，响应值较高，峰形对称性良好。 L-肉碱的保留时间为8～9 min，γ-丁基甜菜碱的保留时间为10～11 min，能够实现两者的有效分离。因此，最终选定8%（V/V）乙腈作为流动相有机相的最佳比例。
图3 不同乙腈配比下L-肉碱与γ-丁基甜菜碱色谱图
Fig.3 Chromatograms of L-carnitine and γ-butyrobetaine at different acetonitrile volume ratios
2.1.4 流动相pH值
由图4可知，随着流动相pH值在2.5～3.5范围内的升高，2个目标物保留时间先逐渐缩短后趋于稳定。当流动相pH值为3.0时，2个目标化合物的保留时间适中，峰形良好且具有较强的响应值。综合考虑分离效率、保留时间及色谱柱耐受性，最终确定流动相pH 3.0为最优流动相pH值条件。
图4 不同pH值流动相体系下L-肉碱与γ-丁基甜菜碱色谱图
Fig.4 Chromatograms of L-carnitine and γ-butyrobetaine in different pH mobile phases
2.1.5 色谱柱温度
由图5可知，随着柱温在30～40 ℃的升高，目标化合物的保留时间先逐渐缩短后趋于稳定；色谱峰峰面积先增大后减小。当柱温为35 ℃时，2个目标物的保留时间适中且具有较强的响应值。综合考虑分离效果、色谱柱使用寿命及能源消耗等因素，最终选定35 ℃作为柱温条件。
图5 不同柱温条件下L-肉碱与γ-丁基甜菜碱色谱图
Fig.5 Chromatograms of L-carnitine and γ-butyrobetaine at different column temperatures
2.2 基质效应
当基质效应＞1.2时，表明存在基质增强效应；0.8＜基质效应＜1.2时，表明无基质效应；基质效应＜0.8时，表明存在基质抑制效应[28]。通过对微生物发酵液基质进行分析，结果表明L-肉碱的基质效应为0.991，γ-丁基甜菜碱的基质效应为0.997，表明2种化合物的基质效应不明显，可以采用盐酸作为溶剂配制标准曲线。
2.3 方法学评价
2.3.1 线性关系、检出限与定量限
采用优化的检测条件测定发酵液中L-肉碱与γ-丁基甜菜碱，以目标物对应峰面积（y）为纵坐标，目标物浓度（x）为横坐标绘制L-肉碱和γ-丁基甜菜碱的标准曲线，得到线性回归方程。由表1可知，L-肉碱与γ-丁基甜菜碱在0.2～1.2 mg/mL范围内线性关系良好，决定系数均不小于0.998，L-肉碱的LOD和LOQ分别为0.133 mg/mL和0.445 mg/mL，γ-丁基甜菜碱的LOD和LOQ分别为0.229 mg/mL和0.766 mg/mL。
表1 L-肉碱与γ-丁基甜菜碱的线性回归方程、决定系数、LOD和LOQ
Table1 Linear regression equations, coefficients of determination,LODs and LOQs of L-carnitine and γ-butyrobetaine
化合物线性回归方程决定系数LOD/（mg/mL）LOQ/（mg/mL）L-肉碱y＝13.726x-0.242 70.9990.1330.445γ-丁基甜菜碱y＝10.179x-0.602 20.9980.2290.766
2.3.2 准确度与精密度
由表2可知，在低、中、高不同加标水平下，L-肉碱的平均加标回收率为89.87%～103.65%，RSD为0.02%～1.59%，γ-丁基甜菜碱的平均回收率为89.23%～97.95%，精密度实验的RSD为2.41%～3.29%，说明该方法准确度高且精密度良好，可以满足痕量分析检测的要求[29]。
表2 L-肉碱与γ-丁基甜菜碱加标回收率和精密度
Table2 Spiked recovery and precision of L-carnitine and γ-butyrobetaine
1.089.870.060.589.232.993.097.952.41化合物加标量/（mg/mL）加标回收率/%RSD/%0.590.981.59 L-肉碱3.0103.650.02γ-丁基甜菜碱1.097.053.29
2.3.3 实际样品检测
用本方法对剑菌WQ-1整个发酵过程中L-肉碱与γ-丁基甜菜碱含量进行检测。由图6A可知，发酵59 h时，L-肉碱和γ-丁基甜菜碱可实现良好分离，其保留时间分别为8.8 min和10.7 min，质量浓度分别为11.11 g/L和5.22 g/L。由图6B可知，在31 h和55 h分别补加底物，总投料质量浓度达到20 g/L，发酵结束时，L-肉碱质量浓度达到13.98 g/L。说明在实际发酵过程中，可以根据本方法监测底物及产物含量，从而确定补料时机。
图6 微生物发酵过程中γ-丁基甜菜碱向L-肉碱转化的色谱分析（A）及发酵动力学曲线（B）
Fig.6 Chromatographic analysis (A) and fermentation kinetics curves (B) for the conversion of γ-butyrobetaine to L-carnitine during microbial fermentation
3 结 论
本研究通过系统优化样品前处理与色谱条件，建立了一种快速、可靠的HPLC方法，可在11 min内实现发酵液中L-肉碱与γ-丁基甜菜碱的有效分离与准确定量。采用0.5 mol/L盐酸作为前处理溶剂以减轻基质干扰，以92%的2 mmol/L 1-辛烷磺酸钠溶液与8%乙腈（pH 3.0）作为流动相，柱温35 ℃条件下，2种目标物可获得良好的峰形和分离度。方法学考察结果表明，L-肉碱与γ-丁基甜菜碱在0.2～1.2 mg/mL范围内具有良好的线性关系，决定系数不小于0.998，平均加标回收率为89.23%～103.65%， RSD为0.02%～3.29%，LOD分别为0.133 mg/mL和0.229 mg/mL，LOQ分别为0.445 mg/mL和0.766 mg/mL，表明本方法具备良好的准确度与重复性，适用于发酵液中L-肉碱与γ-丁基甜菜碱的快速检测。综上，本方法前处理步骤简便、分析周期短，相较酶法和液相色谱-质谱联用法更适用于发酵过程中关键成分的快速监控，可为 L-肉碱微生物发酵过程优化及产量提升提供有效的分析手段。但本研究仍存在应用范围有限、对复杂发酵基质的适应性有待进一步验证等不足。后续可结合更多发酵菌种与不同培养条件开展方法适用性研究，并探索与在线检测平台结合的可能性，以进一步提高对L-肉碱发酵过程监控的实时性与工业应用价值。
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