抹茶是经覆盖栽培、蒸汽杀青、去梗、碾磨等工艺制成的超微绿茶粉，其加工工艺可较大程度保留叶绿素、氨基酸及茶多酚等物质[1-3]。贵州铜仁作为新兴抹茶产区，抹茶种植基地达8 000 hm2，抹茶年产量近2 400 t，产销量居全国首位，且呈继续增长趋势[4]。抹茶多酚以儿茶素为主（点茶多酚70%以上），主要包括儿茶素、表儿茶素、儿茶素没食子酸酯等，这些活性成分赋予抹茶显著的抗氧化活性[3,5]以及良好的心血管疾病改善效果[5-6]。抹茶因其可全叶摄入，在食品加工与应用、预防代谢综合征等方面的潜力突出[3,7]。研究表明，抹茶中酚酸与黄酮可通过清除自由基、螯合金属离子发挥抗氧化、抗炎作用[8-9]。此外，抹茶膳食纤维（点比约10%）可促进肠道蠕动，并调控肠道菌群[10]。目前，抹茶主要应用于饮品、烘焙（饼干、面包）及面制品（面条）等领域[3,11]。已有研究对凝固型抹茶酸奶进行初步探索，但多停留在工艺优化和酸奶稳定性研究，鲜有对其理化性质与其中微生物生长特性进行深入分析[11-12]。
研究表明，仅有约20%的植物多酚能在上消化道被吸收。植物多酚多与膳食纤维等大分子结合，以复合物形式存在于植物组织中，经消化道转运后大多随消化残渣排出体外[13-14]，这大幅限制了机体对植物多酚的摄取与吸收效率，进而削弱其生理营养活性。因此，采用适当技术手段改变抹茶多酚的这些特性，可提高抹茶的营养价值。研究发现，微生物发酵可破坏多酚与膳食纤维及其他大分子之间的相互作用，同时可将部分多酚进行转化进而增强其生物可及性[15-16]。
酸奶风味独特，富含蛋白质、维生素、矿物质及益生菌等有益成分，具有改善肠道健康、提高免疫功能等作用[17-19]。将抹茶应用到酸奶中，乳酸菌可通过发酵作用利用抹茶膳食纤维及多酚，具备提升多酚生物可及性的潜在作用。同时，抹茶富含的膳食纤维、多酚等活性成分不仅能够赋予酸奶独特的色泽与风味，还可能促进乳酸菌增殖，进一步提高抹茶酸奶的营养价值。然而，上述抹茶与乳酸菌的协同增效作用仍缺乏系统验证。基于此，本研究考察抹茶添加量对凝固型酸奶pH值、乳清析出率、持水性、色泽、微观结构、酚酸与黄酮含量及乳酸菌生长的影响，旨在为抹茶发酵制品的开发及其营养阐释提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
抹茶（昔绿，粒径≥800目） 贵州铜仁贵茶茶业股份有限公司；全脂纯奶粉 内蒙古欧世蒙牛乳制品有限责任公司；优古母原味酸奶发酵菌（配料：麦芽糊精、蔗糖、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌） 微康益生菌（苏州）股份有限公司。
福林酚（分析纯） 北京索莱宝科技有限公司；生化鉴定管（蔗糖、山梨醇、七叶苷、棉子糖、纤维二糖、乳糖）、MC培养基、MRS培养基 青岛海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
ML31光学显微镜 广州市明美光电技术有限公司；SPX-150BE生化培养箱 上海力辰邦西仪器科技有限公司；YXQ-LS-100G高压蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TG16K-Ⅱ高速离心机 长沙东旺实验仪器有限公司；NR200色差仪 深圳市三恩驰科技有限公司；ST5000/F pH计 奥豪斯仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 抹茶酸奶制备
抹茶酸奶的制备参照文献[12,20]的方法并进行适当调整，其工艺流程如图1所示。物料配比：全脂奶粉20 g、白砂糖6 g、稳定剂50 mg、菌种2.0 g，蒸馏水100 mL，抹茶添加量分别为蒸馏水质量的0%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，物料混合后加蒸馏水100 mL。主要步骤：在25～30 ℃条件下，先将抹茶加入水中，再与奶粉、白砂糖等混合，6 000 r/min均质3 min，密封后95 ℃杀菌10 min；冷却至约40 ℃时，加入一定量菌种并搅拌均匀，（42±0.5）℃恒温发酵6 h，4 ℃冷藏3 d。
图1 凝固型抹茶酸奶的制备工艺流程
Fig.1 Preparation technological flow chart of set matcha yogurt
1.3.2 抹茶酸奶感官评价
参照文献[20-21]的方法并适当修改，对抹茶酸奶感官品质进行分析。
1.3.3 理化指标测定
1.3.3.1 pH值及酸度测定
酸奶搅拌均匀后称取30 g于烧杯中，用校准后的pH计测量酸奶的pH值，重复测定3次，取平均值。根据GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》，采用酚酞指示剂滴定法测定酸奶样品的酸度。
1.3.3.2 色泽测定
参照文献[21]的方法测定色泽。
1.3.3.3 持水力测定测定
参照黄玉莹等[21]的方法并适当修改。准确称取30.0 g酸奶，置于50 mL离心管中，离心（3 000×g）10 min后静置10 min，弃去上清液，称量残渣及离心管的质量并记录数据，持水力按式（1）进行计算：
式中：m1为离心管质量/g；m2为酸奶和离心管质量/g；m3为离心弃去上清液后酸奶和离心管质量/g。
1.3.3.4 乳清析出率
参照贺莹[22]的方法并修改。向50 mL离心管中准确加入30 g酸奶（m0/g）、密封，将离心管与水平面倾斜约40°，静置3 h后用微量移液器（50 μL）缓慢吸取析出的乳清，置于已称质量（m1/g）的5 mL烧杯中，直至酸奶表面无乳清为止，称量乳清及烧杯的质量（m2/g）。根据式（2）计算抹茶酸奶的乳清析出率：
1.3.3.5 酚酸和黄酮含量测定
多酚提取参照文献[9,14]进行。准确称量5.0 g样品，先用20 mL正己烷分2次萃取，以去除脂质，分离后加入25 mL 80%甲醇，于室温条件下超声处理20 min，随后离心（3 500×g）10 min，收集上清液，残渣再进行 2次提取，合并3次上清液，滤液经旋蒸仪浓缩（45 ℃）至干，再用80%甲醇定容至10 mL，即得游离酚提取物；将剩余残渣与20 mL 2 mol/L NaOH溶液混合，37 ℃条件下120 r/min振荡培养1 h，用1 mol/L盐酸溶液调pH 2.0，用20 mL乙酸乙酯分3次萃取有机物，离心（4 500×g）10 min后弃有机相，上清液经旋蒸仪浓缩（40 ℃）至干，用80%甲醇定容至10 mL，即得结合酚提取物， -18 ℃条件下保存，待测。
采用福林酚比色法[14]测定总酚酸含量。取125 μL样品于试管中，依次加入500 μL蒸馏水、125 μL福林酚试剂，充分混匀后，加1.25 mL 7 g/100 mL Na2CO3溶液，6 min后加1 mL蒸馏水，于室温避光反应1.5 h，测定760 nm波长处的吸光度（A760 nm）。以A760 nm为纵坐标（y）、没食子酸质量浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，得到回归方程为：y＝2.859x+0.021，R2＝0.994 7。
总黄酮含量测定根据文献[9]的方法进行。取1.0 mL样品，加4 mL蒸馏水，接着加300 μL 5 g/100 mL NaNO2溶液，振荡混匀，反应6 min，加入300 μL 10 g/100 mL Al(NO3)3溶液，混匀，静置6 min，加入2 mL 4 g/100 mL NaOH溶液，于室温条件下避光反应15 min，测定510 nm波长处的吸光度（A510 nm）。以A510 nm为纵坐标（y），以芦丁质量浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，得到回归方程为：y＝0.645x+0.032，R2＝0.992 3。
1.3.4 微观结构观察
根据感官分析结果，以空白组酸奶为对照，选取3个不同抹茶添加量酸奶，对其微观组织结构进行观测。发酵前，用滴管吸取少量液态样品，滴加在洁净的凹形载玻片上，盖上盖玻片，并确保不产生气泡；发酵后，用微量药勺取少量酸奶样品置于洁净的载玻片上，盖上盖玻片，轻轻按压至半透明状态，在光学显微镜下观察样品的组织结构。
1.3.5 微生物分析与鉴定
1.3.5.1 菌落总数测定
选用抹茶添加量分别为1.5%、2.0%、2.5%的酸奶，参照GB 4789.35—2023《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》测定其中的乳酸菌菌落总数。
1.3.5.2 微生物分离
根据酸奶发酵菌菌种基本信息，按照GB 4789.35—2023方法对抹茶酸奶中的菌种进行初步分离。根据预实验结果，将酸奶样品分别稀释至10-6再分离培养。乳杆菌采用MRS琼脂培养基，嗜热链球菌采用MC培养基，分别在厌氧或有氧、（36±1）℃条件下培养72 h，根据培养结果初步判断微生物的种类。
1.3.5.3 再培养及镜检
将嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，乳杆菌属接种于MRS琼脂平板，在（36±1）℃条件下厌氧培养48 h。按照GB 4789.35—2023操作步骤，染色结束后在显微镜下观察染色结果。
1.3.5.4 生化鉴定
用接种环从平板上挑取已分离纯化的同一菌落于生化鉴定管中，接种后在（36±1）℃条件下恒温培养24 h，观察生化鉴定管的颜色变化。参照GB 4789.35—2023，根据生化鉴定管颜色变化判断菌种类别。
1.4 数据处理
采用SPSS 26软件进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著。使用OriginPro 8.5软件绘图，除特殊情况外，每次实验均重复3次，结果以x±s表示。
2 结果与分析
2.1 不同抹茶添加量对抹茶酸奶感官品质的影响
由表1可知，未添加抹茶的酸奶呈乳白色、质地均匀、酸度适中、口感细腻，有微量乳清析出；抹茶添加量为1.0%时，酸奶呈浅绿色、质地无明显变化、酸度适中、口感略粗糙，有乳清析出，抹茶滋味和香味不明显，这与已有研究[12]结果类似；随着抹茶添加量增加，酸奶绿色逐渐加深（抹茶添加量为2.0%时呈浓郁的深绿色），抹茶滋味和香味逐渐浓郁，但质地均匀性明显降低，粗糙度也明显增加，酸度变化不明显。抹茶添加量为1.0%、1.5%时，酸奶乳清析出较为明显，但超过2.0%后，这种不利影响减轻。总体而言，抹茶添加量为2.0%时，酸奶的色泽翠绿、质地较为均匀、抹茶滋味和香味适中；超过此值后，酸奶绿色较深且偏暗，抹茶味浓郁，且有明显的颗粒感，质感粗糙。综上，抹茶添加过多或过少均不能达到抹茶酸奶的预期感官品质。
表1 不同抹茶添加量凝固型抹茶酸奶感官品质
Table1 Sensory quality of set matcha yogurt with different matcha addition levels
加量/%色泽滋味组织状态气味样品外观抹茶添乳白色，与酸甜度适中，比表面无明显乳清洗出，无分层现有酸奶特有0常见市售酸例协调，具有酸奶相当奶特有的滋味象，口感浓厚、的奶香味细腻表面有明显乳清绿色，具有酸甜度适中，比有酸奶特有例协调，具有酸洗出，无分层现的奶香味，1.0抹茶酸奶特象，酸奶的质感有的色泽奶特有的滋味，略有抹茶无抹茶苦涩味降低、口感略粗糙香味表面有明显乳清绿色，具有酸甜度适中，比例协调，具有酸洗出，无分层现有酸奶特有1.5抹茶酸奶特象，酸奶的质感的奶香味和有的色泽奶特有的滋味，略有抹茶苦涩味降低、口感抹茶香味略粗糙深绿色，具酸甜度适中，比例协调，具有酸表面乳清洗出较有酸奶特有2.0有抹茶酸奶少，无分层现的奶香味和特有的色泽奶特有的滋味，有抹茶苦涩味象，口感较粗糙抹茶香味酸甜度适中，比深绿色，具例协调，酸奶特表面乳清洗出较酸奶特有奶少，无分层现香味不够浓2.5有抹茶酸奶有滋味不明显，特有的色泽抹茶苦涩味较为象，口感粗糙，郁，抹茶香浓郁有颗粒感味较为浓郁深绿色，具酸甜度适中，比表面乳清洗出较酸奶特有奶例协调，酸奶特少，无分层现香味不够浓3.0有抹茶酸奶特有的色泽有滋味不明显，象，口感粗糙，郁，抹茶香抹茶苦涩味浓郁颗粒明显味较为浓郁
2.2 不同抹茶添加量对抹茶酸奶理化指标的影响
由图2A可知，抹茶添加量为1.0%～2.0%时，抹茶酸奶pH值从4.3增至4.5；随着抹茶添加量进一步增加（2.5%～3.0%），抹茶酸奶pH值呈下降趋势，最终降低至4.2，这与酸奶的酸度变化呈相反趋势（图2B），说明抹茶会降低乳酸菌的产酸能力。总体而言，酸奶pH值变化不大，数值范围与已有研究结果[17,23]基本相似。这可能是抹茶成分会抑制乳酸菌生长，进而降低其发酵乳糖产乳酸的能力，导致酸度降低；抹茶添加量增加后，部分抹茶可溶性膳食纤维被乳酸菌发酵导致酸奶pH值轻微降低。
图2 抹茶添加量对抹茶酸奶pH值（A）、酸度（B）、色泽参数（C）、色差（D）、持水力（E）、乳清析出率（F）、总酚酸（G）及 总黄酮（H）的影响
Fig.2 Effect of matcha addition on pH value (A), acidity (B), color parameters (C), color difference (D), water-holding capacity (E), whey separation rate (F), total phenolic acids (G) and total flavonoids (H) of matcha yogurt
由图2C、D可知，添加抹茶后酸奶色泽参数与色差出现显著变化。随着抹茶添加量的增加，亮度值（L*）呈现明显的下降趋势（70～45），酸奶明显变暗；黄蓝值（b*）显著增加（从9.5升至16.4），表明酸奶逐渐偏向黄色；红绿值（a*）呈负值，且绝对值逐渐增加，说明酸奶的绿色逐渐增强，且与未添加抹茶的空白组差异显著。相应地，酸奶ΔE随抹茶添加量的增加显著增大（从20增至26）。这表明即使添加少量抹茶（如1.0%），酸奶颜色也会产生可察觉的差异（ΔE＞2通常被认为具有可见差异）。
由图2E可知，抹茶对酸奶持水性存在负面影响，但随着抹茶添加量增加，这种负面影响逐渐降低，如抹茶添加量为3.0%时，酸奶持水力由抹茶添加量1.0%时的（53.6±2.8）%增至（67.9±2.5）%；相反地，添加抹茶会增加酸奶的乳清析出率（图2F），少量添加（1.0%、1.5%）时，乳清析出率较高（1.2%、1.0%）；添加量超过2.0%后，乳清析出率逐渐降低，最低降至约0.5%。这可能是因为低添加量时，抹茶固体微粒会阻碍牛乳中酪蛋白聚集，降低其三维网状结构特性和胶凝性能，进而扩大乳清通道[23]；添加量增加到一定程度时，前述现象虽依然存在，但抹茶中可溶性膳食纤维（如果胶、半纤维素等）具备良好持水能力，可增强酪蛋白分子间的相互作用[23]；同时，抹茶多酚类物质可与酪蛋白之间通过弱相互作用增强酪蛋白凝胶网络结构，从而增强酸奶体系的持水性[24-25]。
由图2G可知，酸奶中酚酸类物质随抹茶添加量的增加而增加（从20 mg/100 g升至240 mg/100 g），特别是游离酚酸含量增加极为明显。总黄酮含量变化（图2H）与酚酸基本相似，但总量明显低于总酚酸，这与同类研究结果[15-16]基本一致。游离酚酸和游离黄酮的急剧增加，可能得益于乳酸菌对膳食纤维的分解，或对低水溶性茶多酚的发酵转化[26]，从而增加茶多酚溶出率。
2.3 不同抹茶添加量对抹茶酸奶微观结构的影响
由图3A1可知，发酵前，空白组呈半透明状，脂肪球分布均匀，粒径从几微米到十几微米不等。添加抹茶后，抹茶微粒与脂肪球混为一体，体系微粒尺寸无明显变化，但透明度降低，大颗粒有相互聚集的趋势，抹茶添加量越大，趋势越明显（图3B1～D1）。发酵后，空白组酸奶（图3A2）呈分散性聚集体状态，聚集体整体尺寸虽较大（从十几微米到几十微米），但组成的颗粒较小、密度较大；而抹茶组酸奶（图3B2～D2）微粒呈离散且不规则的大颗粒状聚集体，且分布密度明显低于空白组，微粒粒径随抹茶添加量增加而明显增大，其中抹茶添加量2.5%时，最大微粒粒径达91 μm，这表明抹茶会降低酸奶酪蛋白凝胶体系的稳定性或破坏其网络结构，这可能是空白组酸奶质地较为细腻，添加抹茶后变得粗糙的主要原因。适量添加抹茶虽有不利影响，但这种负面作用有降低趋势，这可能是抹茶中部分细小微粒在酪蛋白因pH值降低而聚集的初期起到成核核心的作用，有利于酪蛋白凝胶网络结构的形成，使得粗糙感并不明显[27]。然而，过多添加抹茶可能导致抹茶中大量微粒在稳定剂和酪蛋白形成的空间网络结构中大量聚集[23]。同时，在酪蛋白分子簇形成后，过多的抹茶微粒会阻碍蛋白分子簇之间的进一步缔合，并限制其在有限空间中的自由扩散，最终形成分散且密度小的弱凝胶结构，进而表现出粗糙口感和较低持水性[28-29]。
图3 不同抹茶添加量抹茶酸奶发酵前、后微观结构
Fig.3 Microstructure of matcha yogurt with different matcha addition levels before and after the fermentation
2.4 不同抹茶添加量对抹茶酸奶菌落总数的影响
根据微生物初级分离结果，抹茶酸奶中只检出乳杆菌和链球菌，未检出双歧杆菌。抹茶酸奶中乳杆菌和链球菌菌落形态特征如图4所示。对于乳杆菌（图4A），空白组菌落数量相对较少且大小不均，随着抹茶添加量不断增加，菌落分布渐趋均匀，数量也随之增多。对于链球菌（图4B），其菌落直径明显小于乳杆菌，但各组链球菌菌落的分布均比较均匀，菌落密度呈先增加后降低的趋势，这与已有研究结果[30]基本一致；抹茶添加量1.5%时，链球菌的菌落密度最大；抹茶添加量2.5%时，菌落密度明显降低。空白组乳杆菌与链球菌菌落总数（图4C）分别为（8.7±0.2）×107 CFU/g 和（8.1±0.4）×107 CFU/g；随着抹茶添加量增加至1.5%，乳杆菌菌落总数增至（9.5±0.4）×107 CFU/g，链球菌增至（8.9±0.3）×107 CFU/g；抹茶添加量为2.5%时，乳杆菌菌落总数达到峰值，而链球菌菌落数却降至（4.4±0.2）× 107 CFU/g，且组间存在显著差异。由此推测，抹茶可促进乳杆菌生长，但抹茶添加量超过一定范围时，将不利于链球菌生长。其原因可能是乳杆菌能够利用抹茶中的膳食纤维、多酚等成分，而链球菌不能发酵代谢这些成分，甚至可能受茶多酚、茶氨酸、咖啡因等成分抑制[31-32]。同时，乳酸菌的生长及其代谢物，以及这些代谢物创造的低pH值环境均可能对链球菌生长产生抑制作用[17,33]。
图4 不同抹茶添加量抹茶酸奶乳杆菌（A）和链球菌（B）的菌落形态及菌落总数（C）
Fig.4 Colony morphology ofLactobacillus (A) and Streptococcus (B) and total viable counts (C) in matcha yogurt supplemented with different amounts of matcha
2.5 微生物鉴定
乳杆菌（图5A）呈典型的杆状形态，菌体较长（部分超过20 μm）且形态相对多样，部分菌体可见一定的排列方式，革兰氏染色呈紫色，表明其为革兰氏阳性菌，符合杆菌类微生物的形态与染色特性。链球菌（图5B）则呈短链状排列的球形或卵圆形，革兰氏染色同样为紫色，判定为革兰氏阳性菌，其链状排列特征明显，体现了链球菌的典型形态学特点[30]。
图5 发酵后抹茶酸奶中乳杆菌（A）与链球菌（B）革兰氏染色结果
Fig.5 Gram staining results of Lactobacillus (A) and Streptococcus (B) in fermented matcha yogurt
由图6A可知，接种反应前，棉子糖管、纤维二糖管、乳糖管、山梨醇管及蔗糖管均呈蓝色或浅蓝色，而七叶苷呈深褐色；由图6B可知，接种乳杆菌后，蔗糖管、纤维二糖管及山梨醇管由蓝色变为紫色，乳糖管由蓝色变为黄色，而棉子糖管和七叶苷管的颜色变化不明显，说明此类乳杆菌可发酵利用乳糖、蔗糖、纤维二糖及山梨醇，但不能发酵利用七叶苷和棉子糖，根据菌落型态（图4A）、GB 4789.35—2023及文献[30,34]，判定此杆菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）；由图6C可知，接种链球菌后，仅有蔗糖管和乳糖管由蓝色变为黄色，其他管的颜色无明显变化，说明链球菌能发酵利用蔗糖和乳糖，但不能发酵其他4种底物，由此可推断链球菌为嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）[30]。
图6 抹茶酸奶发酵微生物生化鉴定结果
Fig.6 Biochemical identification results of fermentation microorganisms isolated from matcha yogurt
综上，在抹茶酸奶发酵过程中，点主导作用的发酵微生物为德氏乳杆菌保加利亚亚种及嗜热链球菌。然而，酸奶中微生物的种类及数量受菌种、发酵条件（如发酵时间、氧气浓度、发酵温度、老化时间等）、原料种类与成分等因素的影响。在具体的生产过程中，应结合实际情况进行综合分析并加以控制。
3 结 论
适量添加抹茶（1.5%～2.0%）时，凝固型酸奶乳清析出率相对较低，持水力较强，感官品质良好（绿色适中、质地均匀、口感柔和），能促进乳杆菌和链球菌的生长，游离酚酸与黄酮显著增加。相比未添加抹茶的酸奶，抹茶酸奶中微粒聚集体粒径明显增加，但密度较低，口感粗糙；抹茶酸奶中的优势菌种为德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌。然而，抹茶酸奶的质构特征、流变性质、功能成分（如L-茶氨酸、咖啡因、儿茶素及膳食纤维等）含量的变化及其与乳酸菌之间的相关性等尚未知晓，需进一步深入研究，进而阐释抹茶对酸奶感官品质及营养功能的影响机理。
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