氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是食物发酵或贮存过程中自然产生的有机物，广泛存在于酱油、发酵茶及葡萄酒等酒类产品中[1-3]，是由氨基供体和乙醇反应生成的酯类化合物[4-7]。EC的前体物质包括氰酸盐、尿素、瓜氨酸和N-氨基甲酰类化合物等，这些前体物质通常是在发酵过程中由酿酒酵母或乳酸菌的精氨酸代谢途径产生[8-9]。EC对人体健康存在潜在威胁，长期接触EC会导致人类神经系统疾病和肝损伤[10]。联合国粮食及农业组织2002年规定发酵食品中的EC限量为20 μg/L[11]。葡萄酒、日本清酒和蒸馏酒常用EC限量标准分别为30、200、150 μg/L[12]。
EC降解方法主要有工艺优化[12-14]、物理控制法[14]、酶处理法[15]和微生物法[16-18]。工艺优化法降解效率有限、无法处理终端产品；物理控制法成本高、能耗大、可能破坏食品品质；酶处理法成本高、稳定性差、基质兼容性有限。针对EC污染现存问题，现有研究多聚焦于微生物降解方向。酵母菌是发酵体系中不可或缺的功能微生物[19]，部分菌株既可分泌EC水解酶、消耗EC前体物质，或直接将EC降解为氨气、二氧化碳和乙醇，从而实现EC消减，同时还能赋予发酵食品独特的风味和质地[20]。姚晓瑞宁[17]从葡萄中筛选出一株可有效降解EC的二尖梅奇酵母（Metschnikowia bicuspidata），其EC降解率为54.4%，可耐受质量浓度14 g/L的葡萄糖，可在12%乙醇环境中正常生长。申鹏森等[18]从酿酒葡萄、干化葡萄和酒醅中筛选出酿酒酵母NXU12-2，用其酿造的葡萄酒品质较优，且能够有效降低酒中的EC含量。目前，从葡萄和酒曲中筛选降解EC菌株的研究报道较为鲜见。本研究从葡萄和酒曲中筛选降解EC酵母菌，以EC作为唯一氮源和碳源进行初筛，结合菌株耐受性实验和溶血试验进行耐受性与安全性评价；通过形态学观察、生理生化实验和分子生物学鉴定完成菌株分类鉴定，并通过单因素试验和正交试验对其产酶条件进行优化，以期获得具备优良EC降解性能的酵母菌株，为降低发酵过程中EC的生物减控提供优质菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
夏黑葡萄 市售；黄酒酒曲 湖南某酒厂；亚硝基铁氰化钠 山东科源生化有限公司；无水乙醇天津市恒兴化学试剂制造有限公司；技术琼脂粉、蜡样芽孢杆菌 广东环凯微生物科技有限公司；溴甲酚紫 天津市化学试剂研究所有限公司；大豆蛋白胨、胰蛋白胨、葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、酵母浸粉、琼脂、EC、氯化钠、氯化铵、磷酸二氢铵、硫酸镁、乙酸钠、三氯乙酸 国药集团化学试剂有限公司；血琼脂培养基 常德比克曼生物科技有限公司。所用试剂均为分析纯或生化试剂。
显色剂I：准确称取0.5 g亚硝基铁氰化钠和12 g苯酚，超纯水溶解后移入200 mL容量瓶中定容；显色剂Ⅱ：称取10.5 g NaOH，量取6 mL NaClO，二者混合后用超纯水溶解并定容至200 mL；终止剂：用超纯水配制质量浓度为100 g/L的三氯乙酸溶液。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基：酵母浸粉1 g、蛋白胨2 g、葡萄糖2 g，蒸馏水溶解并定容至100 mL，pH值自然。YPD固体培养基：在YPD液体培养基基础上添加2 g琼脂。
EC作为唯一碳源培养基：EC 0.25 g、氯化钠0.2 g、硫酸铵0.4 g、磷酸二氢钾0.25 g、磷酸氢二铵0.25 g、硫酸镁0.05 g、琼脂粉2 g，蒸馏水溶解并定容至100 mL，pH值自然。
EC作为唯一氮源培养基：EC 0.25 g、葡萄糖0.2 g、磷酸二氢钾0.2 g、乙酸钠0.2 g、氯化钠0.5 g、溴甲酚紫0.001 g、琼脂粉2 g，蒸馏水溶解并定容至100 mL，pH 5。
以上培养基均于121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
LDZM-80-I高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1FD超净工作台 苏州净化设备有限公司；HNY-2102CI智能恒温培养振荡器 天津欧诺仪器股份有限公司；SPX-250BSH-Ⅱ生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；WGL-125B电热鼓风干燥箱天津泰斯特仪器有限公司；BL92-II DL超声波细胞粉碎机 无锡沃信仪器有限公司；SpectraMax ABS Plus酶标仪 美谷分子仪器（上海）有限公司；HI98103 pH计 汉钠仪器（上海）有限公司；TGL-20M冷冻离心机 长沙英泰仪器有限公司；XMTD-7000电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 降解EC酵母菌筛选
初筛：称取10 g酒曲、葡萄样品，加入90 mL灭菌的生理盐水中，按10倍梯度稀释法稀释至10-4，吸取上清液0.1 mL，均匀涂布于YPD固体培养基表面，28 ℃条件下培养72 h后挑取形态不一致的菌落进行纯化培养，培养至第4代后，用美兰染色镜检至完全纯化后于4 ℃保藏。将斜面保藏的菌株分别接种于YPD液体培养基中，在28 ℃条件下，摇床180 r/min振荡培养24 h，活化2代后接入以EC为唯一碳（氮）源的固（液）体培养基，28 ℃培养7 d后，观察菌株是否能在以EC为碳源的培养基中生长，以及以EC为氮源的培养基是否变色。挑选出能良好生长且具有EC降解能力的菌株。
复筛：将活化后的初筛菌株按接种量2%接种于葡萄糖质量浓度分别为25、30、35、40、45 g/100 mL的YPD液体培养基中，在28 ℃条件下，摇床180 r/min振荡培养24 h，挑选生长状况良好的菌株。
1.3.2 降解EC酵母菌耐受性实验
将初筛菌株活化后按2%（V/V）接种量分别接种于不同乙醇体积分数（3%、6%、9%、12%）、不同pH值（3.0、3.5、4.0）、不同葡萄糖质量浓度（25、30、35、40、45 g/100 mL）的YPD液体培养基中，28 ℃摇床培养48 h后进行10倍梯度稀释，选取10-5、10-6、10-7梯度分别涂布于YPD固体培养基表面，28 ℃静置培养36 h后进行菌落计数。
1.3.3 溶血试验
将复筛得到的菌株活化后划线接种到血琼脂培养基上，于28 ℃培养箱中培养5 d，观察菌落形成情况，包括菌落大小、形态、颜色以及是否形成溶血环。以蜡样芽孢杆菌作为阳性对照。
1.3.4 降解EC酵母菌鉴定
形态学观察：将目的菌株划线于YPD固体培养基上，30 ℃条件下倒置培养48 h，观察其菌落形态；将单菌落用超纯水稀释后，采用美蓝染液染色后在显微镜下观察其细胞形态。
生理生化实验：碳源同化试验、氮源同化试验和糖发酵试验[21]。
分子生物学鉴定：将菌株18S rDNA序列通过NCBI中的BLAST程序比对分析后，得到与待测物种序列相似性最大的同源序列，采用MEGA 5.0软件基于邻接法构建系统发育树，确定菌株种属关系。
1.3.5 筛选菌株产酶培养基组成优化
初始发酵条件：将筛选菌株活化后按2%（V/V）接种量接种于YPD液体培养基，于27 ℃、200 r/min振荡培养48 h，测得初始蛋白酶活性为26.35 U/mL。
单因素试验：采用单因素轮换法，在初始发酵条件基础上，依次考察碳源种类（果糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖，固定添加量20 g/L）、碳源添加量（5、10、15、20、25 g/L）、氮源种类（大豆蛋白胨、胰蛋白胨、氯化铵，固定添加量20 g/L）、氮源添加量（10、15、20、25、30 g/L）、无机盐种类（CuSO4、MgSO4、ZnSO4，固定添加量1 mmol/L）、无机盐添加量（2、5、8、11、14 mmol/L）对菌株产蛋白酶能力的影响。
正交试验：在单因素试验结果基础上，选取对酶活性影响较大的3个因素（A氮源添加量、B碳源添加量、C MgSO4添加量）为自变量，以蛋白酶活性（Y）为响应值，采用3因素3水平的正交试验对产酶培养基组成进行优化[21]。正交试验设计因素与水平如表1所示。
表1 正交试验设计因素与水平
Table1 Orthogonal test design factor and level
4添加量/添加量/（g/L）添加量/（g/L）（mmol/L）210205315258水平A麦芽糖B胰蛋白胨C MgSO 15152
1.3.6 EC水解酶活性测定
粗酶液制备：将筛选菌株于YPD固体培养基上划线，27 ℃培养24 h。挑取单菌落接种至YPD液体培养基，培养8 h后，以2%（V/V）接种量转接至10 mL YPD液体培养基中，27 ℃、200 r/min振荡培养24 h后，离心（4 ℃、10 000 r/min、5 min）并收集菌体，用菌体等体积磷酸盐缓冲液重悬、离心、洗涤3次，采用5 mL磷酸盐缓冲液重悬。在冰浴条件下，采用超声波细胞粉碎机（400 W，工作3 s、间隔7 s）对菌悬液进行破碎，直至悬浮液变为清亮。破碎液冷冻离心，取上清液，即为粗酶液，保存备用。
酶活性测定：精确移取1 000 μL粗酶液于10 mL聚丙烯离心管中，对照以等体积超纯水代替。分别加入1 000 μL含3% EC的模拟酒样溶液，混匀后37 ℃恒温水浴反应15 min。随后加入1 000 μL终止剂终止反应，振荡混匀。依次加入显色剂I、Ⅱ各1 000 μL（间隔30 s，振荡混匀），将显色体系于37 ℃避光保温20 min，再用超纯水定容至10 mL，于625 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线回归方程计算酶活性[22]，按下式计算：
式中：ΔA625 nm为粗酶液组与对照组吸光度之差；n为酶活性测定液稀释倍数；k为标准曲线斜率的倒数；15为酶作用时间/min。
1.4 数据处理
采用SPSS Statistics 26.0进行数据处理并用GraphPad Prism 10.0绘图。
2 结果与分析
2.1 降解EC酵母菌初筛
菌株降解EC的代谢过程会产生氨气等碱性物质，随着降解反应的持续进行，培养体系中的氨气不断积累，导致培养基pH值逐渐升高，当pH值达到或超过6.8这一临界点时，溴甲酚紫指示剂从初始的黄色转变为紫色[23-24]，表明菌株具有降解EC的能力。在以EC分别作为唯一碳源和氮源的筛选培养基上，菌株P1、P2、P3、P4和Q1可使培养基颜色由黄色转变为紫色，表明这5株菌能够在以EC为唯一碳源的条件下生长，且能降解EC。因此，对这5株初筛菌株进行复筛。
2.2 降解EC酵母菌复筛
2.2.1 乙醇耐受性
由图1可知，随着乙醇体积分数在3%～12%范围内的增加，不同菌株活菌数整体呈下降趋势，说明酵母菌的生长随着乙醇体积分数的增加而受到抑制，与刘宜睿等[25]的研究结果基本一致。乙醇体积分数为3%～6%时，各菌株活菌数均维持在较高水平，活菌数在7.5～8.5（lg（CFU/mL））之间；乙醇体积分数为9%时，菌株Q1的活菌数明显下降；乙醇体积分数为12%时，菌株P3、P4、P1活菌数也出现明显下降，而菌株P2活菌数仍保持在较高水平，为7.37（lg（CFU/mL））。综上，菌株P2乙醇耐受性较好。
图1 筛选菌株乙醇耐受性
Fig.1 Alcohol tolerance of screened strains
2.2.2 pH值耐受性
由图2可知，随着pH值在3.0～4.0范围内增加，各菌株的活菌数均有所增加，这一结果可能与酸性环境对细胞膜结构的影响有关[26]，较高浓度的H+可能通过破坏菌株细胞膜结构抑制菌株正常代谢活动。在pH 3.0条件下，菌株P1和P4活菌数较高，分别达7.16（lg（CFU/mL））和7.25（lg（CFU/mL）），高于其他菌株。综上，菌株P4的pH值耐受性较好。
图2 筛选菌株pH值耐受性
Fig.2 pH tolerance of screened strains
2.2.3 葡萄糖耐受性
由图3可知，随着葡萄糖质量浓度在25～45 g/100 mL范围内的增加，不同菌株活菌数变化有所不同，其中菌株P3、Q1的活菌数在整个含量梯度范围内波动最小，稳定性较好。菌株P2、P4的活菌数随葡萄糖质量浓度在25～40 g/100 mL范围内升高呈逐渐下降趋势，之后略有回升，说明其高糖耐受能力有限，但具备一定的适应恢复能力。菌株P1活菌数呈先上升后下降的趋势，在葡萄糖质量浓度35 g/100 mL条件下，菌株生长达到最佳状态，活菌数为9.25（lg（CFU/mL）），表明菌株P1在较宽的葡萄糖含量范围内均具有较强的生长能力和高糖耐受性，提示该菌株对葡萄糖含量变化不敏感，适应范围较广。
图3 菌株葡萄糖耐受性
Fig.3 Glucose tolerance of strains
综上，菌株P1具有良好的耐乙醇、耐pH值、耐葡萄糖能力，因此对其安全性作进一步分析，并对其进行鉴定。
2.3 菌株P1溶血活性
由图4可知，阳性对照菌株周围形成明显的透明溶血环，具有溶血现象，相比之下，菌株P1菌落周围未出现任何溶血环，表明该菌株不具备溶血活性。
图4 菌株P1（A）及对照菌株（B）溶血活性
Fig.4 Hemolytic activity of strain P1 (A) and control strain (B)
2.4 菌株P1鉴定
2.4.1 形态学观察
由图5可知，菌株P1菌落呈现典型的圆形特征且表面光滑湿润、黏稠，呈乳白色，易被挑起。镜检下细胞为椭圆形，菌株大小约10 μm，细胞多以单个分散或成对排列为主，部分区域可见短链状排列，细胞表面存在微小的半球形突起。这是出芽生殖的初期特征，初步判定该菌株为酵母菌。
图5 菌株P1菌落形态（A）及菌体形态（B）
Fig.5 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of strain P1
2.4.2 生理生化实验结果
由表2可知，碳源同化试验中，菌株P1能够同化果糖和半乳糖，不能同化阿拉伯糖和木糖；氮源同化试验中，菌株P1不能同化硫酸铵和硝酸钾；糖发酵试验中，菌株P1可发酵麦芽糖、山梨醇、蜜二糖、乳糖、甘露糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖和棉籽糖，表明该菌株能够将糖类转化为能量和代谢产物。
表2 碳源、氮源同化及糖发酵试验结果
Table2 Results of carbon and nitrogen source assimilation and sugar fermentation tests
项目底物结果果糖+半乳糖+碳源同化木糖-阿拉伯糖-硫酸铵-氮源同化硝酸钾-麦芽糖+乳糖+甘露醇+山梨醇+糖发酵甘露糖+葡萄糖+蜜二糖+蔗糖+棉子糖+
注：+.阳性，-.阴性。
2.4.3 分子生物学鉴定
由图6可知，菌株P1与Pichia kudriavzevii聚于同一分支，结合形态学观察和生理生化实验结果，将其鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）。
图6 基于18S rDNA序列构建的菌株P1系统发育树
Fig.6 Phylogenetic tree of strain P1 constructed based on 18S rDNA sequences
2.5 产酶培养基组成优化单因素试验结果
2.5.1 碳源种类及麦芽糖含量对菌株产蛋白酶能力的影响
由图7A可知，以葡萄糖为碳源时，蛋白酶活性为26.35 U/mL，以果糖、麦芽糖和蔗糖为碳源时，蛋白酶活性分别为35.36、37.00 U/mL和33.70 U/mL，显著高于对照组（P＜0.05），因此，最佳碳源为麦芽糖。由图7B可知，随着麦芽糖质量浓度在5～25 g/L范围内的增加，蛋白酶活性呈先上升后下降的趋势（P＜0.05）；当麦芽糖质量浓度为10 g/L时，蛋白酶活性较高，为49.44 U/mL。因此，最佳麦芽糖质量浓度为10 g/L。
图7 不同碳源种类（A）及麦芽糖添加量（B）对菌株产蛋白酶能力的影响
Fig.7 Effects of different carbon source types (A) and maltose addition dosage (B) on protease production capacity of the strain
2.5.2 氮源种类及胰蛋白胨含量对菌株产蛋白酶能力的影响
由图8A可知，以胰蛋白胨为氮源时，蛋白酶活性为24.34 U/mL，以大豆蛋白胨、氯化铵为氮源时，菌株蛋白酶活性较低，胰蛋白胨为氮源时酶活性最高，因此，确定胰蛋白胨为最佳氮源。由图8B可知，随着胰蛋白胨质量浓度在10～30 g/L范围内增加，蛋白酶活性呈先上升后下降的趋势，当质量浓度为20 g/L时，蛋白酶活性达到最高值（38.57 U/mL）。因此，最佳胰蛋白胨质量浓度为20 g/L。
图8 不同氮源种类（A）及胰蛋白胨添加量（B）对菌株 产蛋白酶能力的影响
Fig.8 Effects of different nitrogen source types (A) and tryptone addition dosage (B) on protease production capacity of the strain
2.5.3 无机盐种类及MgSO4添加量对产蛋白酶能力的影响
由图9A可知，相较于CuSO4、ZnSO4，添加MgSO4时，蛋白酶活性显著高于未添加无机盐的对照组（P＜0.05），可有效促进菌株产蛋白酶，因此，确定最佳无机盐为MgSO4。由图9B可知，随着MgSO4添加量在5～14 mmol/L范围内增加，蛋白酶活性呈先上升后下降的趋势；MgSO4添加量为5 mmol/L时，蛋白酶活性最高（63.52 U/mL）。综上，MgSO4最佳添加量为5 mmol/L。
图9 不同无机盐种类（A）及其MgSO4添加量（B）对菌株 产蛋白酶能力的影响
Fig.9 Effects of different inorganic salt types (A) and MgSO4 addition dosage (B) on protease production capacity of the strain
2.5.4 正交试验结果与分析
以麦芽糖添加量（A）、胰蛋白胨添加量（B）、MgSO4添加量（C）为考察因素，以蛋白酶活性为评价指标，设计3因素3水平的正交试验，试验设计及结果如表3所示。
表3 正交试验设计及结果
Table3 Orthogonal experimental design and corresponding results
B 胰蛋白胨C MgSO4添加量/蛋白酶活性/421237.26±1.48522343.79±0.50623139.16±0.71933231.09±0.82 R11.087.796.69试验号A 麦芽糖添加量/（g/L）添加量/（g/L）（mmol/L）（U/mL）111133.23±0.00212245.57±0.71313353.16±4.29731331.57±0.41832136.08±1.64 k143.9934.0236.15 k240.0741.8137.97 k332.9141.1442.84
由极差R值可知，3个因素对蛋白酶活性的影响程度存在明显差异，其从大到小依次为：A＞B＞C，即麦芽糖添加量＞胰蛋白胨添加量＞MgSO4添加量。其中麦芽糖对蛋白酶活性的影响最显著，其次是胰蛋白胨，MgSO4影响相对较小。结合各因素最优水平，得到产酶最优组合为A1B2C3，而正交试验的第3组蛋白酶活性最高（53.16 U/mL），约为优化前酶活性（26.35 U/mL）的2倍，主效应均值B2（41.81）＞B3（41.14），差异仅为1.6%，远小于因素A的波动（R＝11.08），因此，确定最优方案为A1B3C3（麦芽糖添加量5 g/L、胰蛋白胨添加量25 g/L和MgSO4添加量8 mmol/L）。此条件下，蛋白酶活性提升显著，可有效增强菌株降解EC的能力。
3 结 论
为降低发酵食品中EC含量，本研究从葡萄表皮和酒曲中分离纯化菌株，经EC选择性培养基初筛获得5株可以EC为碳氮源的酵母菌。通过耐受性测试筛选出工业适配性菌株P1，其可耐受12%乙醇、pH 3.0酸性环境及45 g/100 mL 葡萄糖，经形态学观察、生理生化实验及分子生物学技术鉴定为库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii），无溶血活性。通过单因素试验结合正交试验优化产酶条件，确定以YPD为基础培养基，麦芽糖（5 g/L）、胰蛋白胨（25 g/L）为碳氮源，添加8 mmol/L MgSO4时，蛋白酶活性为53.16 U/mL，约为优化前酶活性（26.35 U/mL）的2倍。该菌株可从源头控制发酵食品及乙醇饮料中EC含量，具有降低消费者健康风险的应用潜力。
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