2-苯乙醇（2-phenylethanol，2-PE）是存在于玫瑰、丁香、蜂蜜等天然产物中的芳香醇，可赋予这些天然产物特征玫瑰香气，被广泛应用于化工、医药、食品行业[1]。2-PE是全球用量排名第2的香料物质，年需求量超过10 000 t[2]。目前市售2-PE主要通过苯或苯乙烯的化学合成路线生产，存在原料来源于石化、能耗高、污染大、产品纯度难以保证等问题，无法满足食品级天然香料的安全要求[3]。天然植物提取法因产量极低、成本高昂，同样难以实现规模化生产[4]。生物合成法以底物来源清洁、产物天然、条件温和为优势，被视为替代化学合成的重要途径[5-6]。
微生物可经莽草酸途径从头合成2-PE，或经Ehrlich途径以L-苯丙氨酸为底物进行生物转化，其研究涉及的微生物包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和黑曲霉（Aspergillus niger）等[7]。其中，酿酒酵母因产量高、耐受性强以及食品安全性好，是发酵生产2-PE的首选微生物[8-9]。然而，2-PE作为次级代谢产物具有很强的细胞毒性，影响其生物合成效率[10-11]。当发酵液中2-PE质量浓度达到3～4 g/L时，其亲脂性可破坏细胞膜脂质双分子层结构，导致膜通透性异常、细胞内物质外漏、线粒体膜电位异常，并抑制核酸合成，最终引发细胞不可逆损伤[12]。因此，提升菌株的2-PE耐受性或降低发酵液中的产物积累浓度，是突破产量瓶颈的关键。
目前，提升2-PE产量研究主要聚焦于菌种选育、培养基组分优化、发酵条件改善及操作方式改进等方面[13]。菌株筛选与诱变是获得高耐受、高产菌株的重要途径，Celińska等[14]筛选得到高产2-PE菌株解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）NCYC3825，其2-PE产量为2 g/L左右。酵母菌合成2-PE能力不仅受菌株自身特性影响，还与培养基组分及培养条件紧密关联[15]。汪琨等[16]优化酿酒酵母CWY132生物转化合成2-PE的培养基组分和培养条件，使2-PE产量达4.1 g/L，较优化前提升约50%。目前，2-PE生物合成仍存在高耐受天然菌株匮乏、产物抑制效应明显等问题[17]。原位产物分离（in situ product removal，ISPR）技术作为可从发酵基质中连续回收目标产物的工艺手段，能降低产物积累带来的毒性和反馈抑制，并简化下游分离过程[18]。
本研究以从大曲中分离得到的1株产2-PE酿酒酵母JQ-5为研究对象，系统评估其对2-PE的耐受性。采用单因素优化试验、Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验、Box-Behnken试验设计优化培养基成分及发酵条件，并引入水/油酸两相ISPR体系，探讨双策略协同提升2-PE产量的效果，旨在提高菌株JQ-5生物合成2-PE效率，为高产2-PE菌株的开发及天然香料2-PE的绿色生物制造提供理论基础和工艺参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
高温大曲 河南仰韶酒业有限公司；酿酒酵母JQ-5从高温大曲中筛选获得。
2-PE、L-苯丙氨酸（均为分析纯） 上海麦克林生化科技股份有限公司；葡萄糖、MgSO4、KH2PO4（均为分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；蛋白胨（生物试剂） 北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母浸粉（生物试剂） 英国Oxoid公司。
YPD培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母浸粉10 g/L，121 ℃高压灭菌20 min；FM培养基：葡萄糖40 g/L、酵母浸粉5 g/L、L-苯丙氨酸5 g/L、MgSO4 0.5 g/L、KH2PO4 5 g/L，121 ℃高压灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
ME204E电子精密天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HY-2涡旋振荡仪 上海生工生物工程技术服务有限公司；THZ-100恒温振荡器、LRH-70生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；LDZM-60L-I立式高压蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；HT200R高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台 河南捷隆科技有限公司；UV-1800紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；1260 II高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 酿酒酵母JQ-5种子液制备及发酵
挑取JQ-5单菌落至YPD液体培养基中，30 ℃、150 r/min培养12 h至对数生长期，制备成种子液，以2%（V/V）的接种量转接至FM培养基，30 ℃、150 r/min培养48 h，测定2-PE产量。
1.3.2 酿酒酵母JQ-5对2-PE的耐受性测定
FM培养基中分别添加质量浓度为0、1、2、3、4、5 g/L 的2-PE，以2%（V/V）的接种量接种，30 ℃、150 r/min 培养72 h，每隔12 h取样测定OD600 nm值，绘制生长曲线。培养72 h后，以未添加2-PE组的OD600 nm值为基准，按 式（1）计算生长抑制率：
式中：OD0为未添加2-PE条件下培养72 h时的OD600 nm值；OD1为不同质量浓度2-PE条件下培养72 h时的OD600 nm值。
1.3.3 酿酒酵母JQ-5产2-PE发酵条件优化
1.3.3.1 单因素试验
分别对培养基中葡萄糖（20、40、60、80、100 g/L）、 酵母浸粉（3、5、7、9、11 g/L）、L-苯丙氨酸（1、3、5、7、9 g/L）、MgSO4（0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 g/L）、 KH2PO4（1、3、5、7、9 g/L），以及培养条件：温度（20、25、30、35、40 ℃）、装液量（30、40、50、60、70 mL/250 mL）、接种量（5%、10%、15%、20%、25%）进行优化，发酵结束后测定2-PE产量。
1.3.3.2 Plackett-Burman试验设计
在单因素试验结果的基础上，选取葡萄糖（A）、酵母浸粉（B）、L-苯丙氨酸（C）、MgSO4（D）、KH2PO4（E）、温度（F）、装液量（G）、接种量（H）8个因素，分别选取高水平（1）和低水平（-1），以2-PE产量为响应值进行Plackett-Burman试验设计（表1），采用Design-Expert 13.0软件进行显著性分析，筛选对2-PE产量影响显著的因素。
表1 Plackett-Burman试验设计因素和水平
Table1 Factors and levels for Plackett-Burman experimental design
A葡萄糖B酵母浸粉C L-苯丙氨D MgSO4E KH2PO4水平质量浓度/质量浓度/酸质量浓度/质量浓度/质量浓度/F温度/ G装液量/H接种（g/L）（g/L）（g/L）（g/L）（g/L）℃（mL/250 mL）量/%-140310.31303010180750.55407025
1.3.3.3 最陡爬坡试验
在Plackett-Burman试验设计结果的基础上，以响应值变化方向作为爬坡方向，根据各显著因素效应值确定爬坡步长，设计最陡爬坡试验。不显著因素采用正效应取高水平，负效应取低水平。
1.3.3.4 Box-Behnken试验设计
在最陡爬坡试验确定中心试验组基础上，采用Design-Expert 13.0软件进行Box-Behnken试验设计，对显著因素进一步研究，根据响应值进行回归分析，并对回归模型预测出的最佳发酵工艺条件进行验证。
1.3.4 ISPR两相体系发酵对2-PE产量的影响
采用水/有机溶剂两相体系，考虑到有机溶剂对微生物细胞的生物相容性及2-PE在两相间的分配系数，选用油酸作为有机相。Gao Fang等[19]研究表明，两相体积比会影响2-PE在两相间的分配行为及萃取效果，因此本研究采用水/油酸体积比为1∶1的两相体系，该条件下体系稳定性较好，且对2-PE具有较高的萃取能力。
A组（对照）：在上述优化条件下进行单一水相发酵，取1 mL发酵液于4 000 r/min离心10 min，取上清液，经0.45 μm滤膜过滤后，采用HPLC法分析。
B组（水/油酸两相发酵液）：在单一水相发酵9 h后加入等体积油酸，继续发酵至结束。静置后取1 mL上层油相于4 000 r/min离心10 min，上层液体用甲醇按1∶10（V/V）稀释，即取0.1 mL油相样品与0.9 mL甲醇混匀，经0.45 μm滤膜过滤后，采用HPLC分析；另取1 mL下层水相发酵液于4 000 r/min离心10 min，将离心后的上清液经0.45 μm滤膜过滤，使用HPLC法测定2-PE产量，2-PE总产量为水相发酵液中2-PE产量与油相发酵液中2-PE产量之和。按式（2）计算两相体系中2-PE总产量：
式中：Y2-PE,eq为两相体系中2-PE总产量折算至初始水相体积的等效质量浓度/（g/L）；C水为2-PE在水相体系中的质量浓度/（g/L）；V水为2-PE水相体系的体积/L；C油为2-PE在油相体系中的质量浓度/（g/L）；V油为2-PE油相体系的体积/L；V水,0为初始水相体积/L。
当实验中油相与初始水相体积相等，即V油＝V水,0时，公式可简化为Y2-PE,eq＝C水+C油。
1.3.5 2-PE产量测定
采用HPLC法测定2-PE产量。HPLC条件：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（体积比1∶1）；流速0.5 mL/min；进样量5 μL；柱温30 ℃；检测波长260 nm。
1.4 数据处理
所有实验均重复3次，结果以x±s表示。采用Origin 2025软件绘图；采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析及Tukey多重比较检验；P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 酿酒酵母JQ-5对2-PE的耐受性
由于2-PE具有细胞毒性，完全抑制多数原核菌株和真菌生长的2-PE质量浓度为2～3 g/L，耐受水平达到2.5～5.0 g/L的菌株被视为高耐受型[20]。如图1所示，随着2-PE质量浓度的逐渐升高，菌株JQ-5的生长受到不同程度的抑制。当2-PE质量浓度为1～4 g/L时，抑制率逐渐升高至42.10%，菌体尚可正常增殖；当质量浓度升至5 g/L时，抑制率升至77.77%，菌体生长受到严重抑制。由此确定菌株JQ-5对2-PE的耐受质量浓度为4 g/L，高于牛明福等[21]报道的马克斯克鲁维酵母在36 ℃时对2-PE的耐受质量浓度（2 g/L），表明JQ-5具有较强的2-PE耐受能力。
图1 2-PE对菌株JQ-5的抑制率
Fig.1 Inhibitory rate of 2-PE against strain JQ-5
为进一步定量表征其耐受能力，以2-PE质量浓度对数值（lg x）对抑制率进行非线性拟合，依据四参数逻辑斯蒂模型建立剂量-响应曲线[22]。拟合方程为y＝5.409 6+ 72.359 2/（1+10（0.590 3-x）×7.1534），R2为0.874 7。据此计算得出菌株JQ-5对2-PE的半数抑制浓度为4.16 g/L，进一步证实其耐受性较强。在4 g/L 2-PE条件下对其生长曲线进行测定。如图2所示，与对照组（不含2-PE）相比，添加4 g/L 2-PE后菌株生长受到明显抑制，但菌体仍能持续生长，表明其对2-PE具有一定的适应能力。菌株JQ-5的高耐受机制可能与细胞膜组成重塑、主动外排系统上调及应激响应系统高效激活等多重因素有关[23-24]。这一特性有助于缓解产物的反馈抑制效应，为后续高浓度底物L-苯丙氨酸的添加和高产发酵工艺的设计奠定了重要基础。
图2 菌株JQ-5的生长曲线
Fig.2 Growth curve of strain JQ-5
2.2 酿酒酵母JQ-5产2-PE发酵条件优化单因素试验结果
2.2.1 培养基成分对菌株JQ-5产2-PE的影响
在未优化培养基成分及发酵条件时，菌株JQ-5初始产2-PE质量浓度为2.45 g/L。低浓度葡萄糖限制菌体生长繁殖及从头合成2-PE；高浓度葡萄糖则诱导JQ-5生成大量副产物，抑制菌体生长及2-PE合成[25]。由图3a可知，随着葡萄糖质量浓度增加，2-PE产量及OD600 nm值呈先上升后下降的趋势，葡萄糖质量浓度为40 g/L时，2-PE产量及OD600 nm值达到最高，分别为2.82 g/L、22.38。因此，最适葡萄糖质量浓度为40 g/L。
图3 培养基成分对酿酒酵母JQ-5产2-PE的影响
Fig.3 Effects of medium components on 2-PE biosynthesis by S. cerevisiae JQ-5
由图3b可知，随着酵母浸粉质量浓度增加，2-PE产量及OD600 nm值呈先上升后下降的趋势，酵母浸粉质量浓度为7 g/L时，2-PE产量及OD600 nm值最高，分别达2.86 g/L、24.02。低浓度酵母浸粉影响菌体的生长及产2-PE相关酶系的合成；高浓度酵母浸粉可能导致胞内L-酪氨酸积累，进而反馈抑制3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸-7-磷酸合酶和分支酸变位酶活性，阻碍莽草酸途径的正常运作，显著抑制菌株利用L-苯丙氨酸合成2-PE的能力[26]，但具体机制有待进一步验证。因此，最适酵母浸粉质量浓度 为7 g/L。
由图3c可知，随着L-苯丙氨酸质量浓度在1～9 g/L范围内增加，2-PE产量先上升后下降，而OD600 nm值逐渐下降；当L-苯丙氨酸质量浓度为5 g/L时，2-PE产量达到最大值（3.05 g/L），OD600 nm值为24.86。低浓度L-苯丙氨酸作为直接前体促进2-PE高效合成；高浓度下，胞内Ehrlich途径相关酶系趋于饱和且无法进一步提升2-PE产量[27]。L-苯丙氨酸显著提升2-PE产量，但对菌体生长无明显的促进作用。因此，最适L-苯丙氨酸质量浓度 为5 g/L。
适量的KH2PO4可为菌体提供必需的K+和
，并维持弱酸性生长环境（pH值为5.0～6.0），保障菌体生长及对2-PE的转化能力，但高浓度KH2PO4会加剧发酵后培养基酸化，抑制菌体活性[28]。由图3d可知，随着KH2PO4质量浓度在1～9 g/L范围内增加，2-PE产量及OD600 nm值呈先上升后下降的趋势，当KH2PO4质量浓度为5 g/L时，2-PE产量及OD600 nm值最高，分别为3.09 g/L、23.38。因此，最适KH2PO4质量浓度为5 g/L。
Mg2+作为能量代谢、糖类代谢和DNA合成的多种酶的关键辅助因子，可显著提高酶活性，促进菌体增殖和2-PE合成[29]。由图3e可知，随着MgSO4质量浓度在0.3～1.1 g/L范围内增加，2-PE产量及OD600 nm值呈先上升后下降的趋势；当MgSO4质量浓度为0.7 g/L时，2-PE产量及OD600 nm值最高，分别达3.12 g/L、25.96。因此，最适MgSO4质量浓度为0.7 g/L。
2.2.2 培养条件对菌株JQ-5产2-PE的影响
温度低于30 ℃可能限制菌体生长相关酶活性；高于30 ℃时，酵母菌体内对热敏感的生长代谢相关酶类及参与转化合成2-PE的转氨酶活性受到显著抑制，不利于反应体系中2-PE的积累[30]。由图4a可知，随着温度在20～40 ℃范围内增加，2-PE产量及OD600 nm值呈先上升后下降的趋势；当温度为30 ℃时，2-PE产量及OD600 nm值达最高值（2.97 g/L、24.00）。因此，最适温度为30 ℃。
图4 培养条件对酿酒酵母JQ-5产2-PE的影响
Fig.4 Effects of culture parameters on 2-PE biosynthesis by S. cerevisiae JQ-5
由图4b可知，随着装液量增加，2-PE产量及OD600 nm值逐渐下降。装液量低于40 mL/250 mL时，2-PE产量趋于稳定，高于40 mL/250 mL则迅速下降；OD600 nm值随装液量的增加而持续下降，表明高装液量条件下溶氧不足，无氧呼吸增强，副产物乙醇大量积累，不仅对菌体产生毒害作用，还可协同抑制2-PE[31]。在装液量40 mL/250 mL时，2-PE产量达到最高值（3.16 g/L），OD600 nm值为19.78，确定40 mL/250 mL为最适装液量。
接种量过低导致菌体增殖周期长，底物利用率下降；接种量过高加速底物消耗，抑制后期菌体生长[32]。由图4c可知，随着接种量在5%～25%范围内增加，2-PE产量呈先上升后下降的趋势，当接种量为10%时，2-PE产量及OD600 nm值达最高值（3.11 g/L、24.86）。因此，最适接种量为10%。
2.3 酿酒酵母JQ-5产2-PE发酵条件优化响应面试验结果
2.3.1 Plackett-Burman试验设计结果
在单因素试验结果的基础上，对葡萄糖（A）、酵母浸粉（B）、L-苯丙氨酸（C）、MgSO4（D）、KH2PO4（E）、温度（F）、装液量（G）、接种量（H）8个因素进行考察，以2-PE产量为响应值，Plackett-Burman试验设计结果见表2，方差分析结果见表3。
表2 Plackett-Burman试验设计及结果
Table2 Design and results of Plackett-Burman experiment
试验号ABCDEFGHY 2-PE产量/（g/L）140310.514070101.017±0.012240710.553070250.978±0.013340310.313030101.072±0.008440350.354030251.899±0.026540750.354070101.279±0.019640750.513030252.861±0.027780710.314030250.726±0.012880310.353070252.936±0.031980310.554030101.531±0.0161080350.553030101.008±0.0131180750.514070252.084±0.0211280750.313070100.932±0.012
表3 Plackett-Burman试验设计回归模型方差分析
Table3 Analysis of variance for regression model of Plackett-Burman design
来源平方和自由度均方FP显著性模型5.9351.1918.970.001 3**B0.030 310.030 30.484 50.512 4 C3.9213.9262.650.000 2**D0.398 610.398 66.370.045 0*F1.0511.0516.840.006 3**G0.53310.5338.520.026 7*残差0.375 360.062 5合计6.3111
注：*.影响显著（P＜0.05），**.影响极显著（P＜0.01）。表6同。
采用Design-Expert 13.0软件对Plackett-Burman试验设计结果进行分析，获得标准化效应的帕累托图（α＝0.05）（图5）。因素C、F、G、D标准化效应t值均超过临界t值，故为显著影响因素（P＜0.05），即影响酿酒酵母JQ-5产2-PE的显著因素为L-苯丙氨酸、温度、装液量、MgSO4，其他因素的标准化效应值较小。同时，可确定因素A、C、D为正效应因素，因素B、E、F、G、H为负效应因素。
图5 标准化效应的帕累托图（α＝0.05）
Fig.5 Pareto chart of standardized effects (α = 0.05)
对表3的Plackett-Burman试验结果进行方差分析，对于未达到显著水平的因素，根据其效应方向固定条件：葡萄糖取高水平80 g/L，酵母浸粉和KH2PO4分别取低水平，即3 g/L和1 g/L，接种量取10%。根据P值剔除较为不重要的变量（葡萄糖、KH2PO4、接种量），以2-PE产量为响应值，得到回归方程：Y＝2.667-0.025B+0.286C+1.823D-0.059F-0.011G。由表3可知，该模型极显著（P＝0.001 3＜0.01），模型决定系数R2＝0.940 5，调整后决定系数
，表示模型可靠，拟合度较高。因此，选择L-苯丙氨酸、温度、装液量、MgSO4这4个因素进行最陡爬坡试验。
2.3.2 最陡爬坡试验结果
结合单因素试验结果可知，MgSO4质量浓度达到0.5 g/L后，2-PE产量基本保持恒定，其中0.5 g/L与0.7 g/L 条件下2-PE产量差异不显著（P＞0.05），表明继续提高MgSO4质量浓度对2-PE合成促进作用有限，因此将MgSO4质量浓度设定为0.5 g/L，进一步通过最陡爬坡试验研究L-苯丙氨酸、温度、装液量3个显著因素间的效应[33]。由表4可知，随着L-苯丙氨酸、温度、装液量3个因素的趋势性变化，2-PE产量呈先上升后下降的趋势，并且在第3组试验条件下，酵母菌JQ-5转化合成的2-PE产量最高，因此以第3组试验为Box-Behnken试验设计的中心试验点。
表4 最陡爬坡试验设计及结果
Table4 Design and results of steepest ascent experiment
质量浓度/（g/L）温度/℃装液量/（mL/250 mL）（g/L）1136401.102±0.0164727253.197±0.0355924203.046±0.0312-PE产量/试验号L-苯丙氨酸2333352.562±0.0283530303.511±0.02461121152.729±0.026
2.3.3 Box-Behnken试验设计结果
根据上述试验结果，以L-苯丙氨酸（A）、温度（B）、装液量（C）为自变量，2-PE产量为响应值，采用Design-Expert 13.0软件设计Box-Behnken 3因素3水平实验，Box-Behnken试验设计及其结果见表5，回归模型方差分析见表6。
表5 Box-Behnken试验设计及结果
Table5 Design and results of Box-Behnken experiment
编号ABC2-PE产量/（g/L）1-1-102.303±0.01921-103.340±0.0283-1102.228±0.02341102.673±0.0285-10-12.354±0.025610-13.213±0.0327-1012.196±0.02181013.069±0.02690-1-13.407±0.0291001-13.131±0.027110-113.356±0.028120112.888±0.026130003.506±0.032140003.533±0.036150003.561±0.031160003.531±0.036170003.557±0.038
表6 Box-Behnken试验设计回归模型方差分析
Table6 Analysis of variance for regression model of Box-Behnken design
来源平方和自由度均方FP显著性模型4.1490.459 5327.93＜0.000 1**A1.2911.29921.53＜0.000 1**B0.27610.276197.00＜0.000 1**C0.044 410.044 431.690.000 8**AB0.087 610.087 662.53＜0.000 1**AC0100.0350.857 0 BC0.009 210.009 26.580.037 3*A22.0312.031 449.61＜0.000 1**B20.180 510.180 5128.82＜0.000 1**C 20.076 810.076 854.81＜0.000 1**残差0.009 870.001 4失拟项0.007 830.002 65.250.071 6不显著纯误差0.00240.000 5合计4.1516
对表5的结果进行二次多元回归拟合，获得回归方程Y＝3.54+0.401 7A-0.185 8B-0.074 5C-0.148 0AB+0.003 5AC-0.048 0BC-0.694 6A2-0.207 0B2-0.135 0C2。
由表6可知，该模型P＜0.000 1，极显著，失拟项P＝ 0.071 6＞0.05，不显著，表明该模型可靠；决定系数R2＝ 0.997 6，调整后决定系数
，表明该模型可以解释99.46%的2-PE产量变化，该模型拟合程度高。由P值可知，一次项A、B、C，交互项AB及二次项A2、B2、C2对2-PE产量影响极显著（P＜0.01），交互项BC对2-PE产量影响显著（P＜0.05）；由F值可知，3个因素对2-PE产量的影响程度依次为L-苯丙氨酸（A）＞温度（B）＞装液量（C）。
等高线越接近椭圆形、曲面坡度越陡峭，代表两因素交互作用越强；等高线接近圆形则交互作用较弱[34]。由图6可知，温度与L-苯丙氨酸、温度与装液量间交互作用响应曲面呈抛物线曲面，其对应的等高线呈椭圆形，响应曲面坡度较为陡峭。据此可判断，温度分别与L-苯丙氨酸、装液量之间存在较强的交互作用，与方差分析结果一致。
图6 各因素间交互作用对2-PE产量影响的响应曲面及等高线图
Fig.6 Response surface and contour plots illustrating interactive effects of various factors on 2-PE yield
2.4 验证实验
回归模型预测的酿酒酵母JQ-5产2-PE最优发酵条件为：L-苯丙氨酸5.69 g/L、温度28.34 ℃、装液量29.1 mL/250 mL，在此条件下，2-PE产量预测值为3.665 g/L。结合实际操作，将工艺条件修正为：L-苯丙氨酸5.7 g/L、温度为28.5 ℃、装液量29 mL/250 mL，2-PE产量实际值为3.674 g/L，与预测值接近，表明模型拟合可靠，较发酵条件优化前初始产量2.45 g/L提高49.96%。史荣超等[35]在L-苯丙氨酸添加量4 g/L、葡萄糖添加量50 g/L、初始pH 3.0，发酵温度25 ℃、接种量5%条件下，梅奇酵母转化L-苯丙氨酸合成2-PE产量为2.24 g/L。在相近发酵条件下，本研究中2-PE的产量较其提高了64.02%，表明菌株JQ-5可有效合成2-PE。
2.5 ISPR对生物合成2-PE的影响
由表7可知，B组中2-PE主要存在于油相中，仅有少部分在水相中，且油酸中2-PE产量为发酵液中的5.3倍。2-PE对细胞具有强毒性，常规发酵中产物积累会反馈抑制关键酶活性，油酸作为有机相迅速溶解疏水性2-PE，使产物从水相转移至油相，将发酵液中的2-PE浓度维持在较低水平，降低水相2-PE浓度，保护细胞活性，保持酵母高效代谢，推动反应持续正向进行，提高底物转化率。在发酵工艺相同的基础上，加入与发酵液等体积的油酸使得菌株JQ-5转化合成2-PE的产量较纯水相体系提高22.97%，终产量为4.518 g/L，较初始2-PE产量提高84.41%。Yan Wei 等[36]分离出一种梅耶罗酵母属菌株YLG18，通过响应面法和ISPR技术，最终2-PE产量可提高至3.20 g/L。本研究中酿酒酵母JQ-5是合成2-PE的优势菌株，将ISPR应用于发酵体系中，可有效促进2-PE的生物合成效率。
表7 水/油酸两相体系对酿酒酵母JQ-5转化合成2-PE产量的影响
Table7 Effects of aqueous/oleic acid biphasic system on 2-PE bioconversion yield by S. cerevisiae JQ-5
g/L组别水相油相总产量A3.674±0.0343.674±0.036 B0.717±0.0163.801±0.0294.518±0.032
3 结 论
本研究通过单因素试验、Plackett-Burman筛选、最陡爬坡试验和Box-Behnken响应面优化，系统确定了酿酒酵母JQ-5产2-PE的最佳发酵条件：葡萄糖80 g/L、酵母浸粉3 g/L、 L-苯丙氨酸5.7 g/L、MgSO4 0.5 g/L、KH2PO4 1.0 g/L、 接种量10%、装液量29 mL/250 mL、28.5 ℃条件下转化培养48 h，2-PE终质量浓度为3.674 g/L，较初始产量2.45 g/L提升了49.96%。在水∶油酸＝1∶1（V/V）的两相体系中，通过ISPR技术有效缓解了产物毒性抑制，2-PE总产量提升至4.518 g/L，较纯水相发酵体系提高了22.97%，较初始产量提高84.41%。本研究为2-PE绿色生物制造工艺的优化提供了系统性参考，也为后续菌株代谢改造奠定了工艺基础。
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