非酿酒酵母筛选及其接种时序对桑葚酒品质的影响

向新宇1,金粉竹1,刘双豪1,杨开龙2,3,*,方裕理3

(1.四川省邛崃市汇利来酒厂,四川 成都 611530;2.四川邛崃金六福崖谷生态酿酒有限公司,四川 成都 611530;3.四川轻化工大学食品与酿酒工程学院,四川 宜宾 644002)

摘 要:为探究非酿酒酵母与酿酒酵母混合接种方式对桑葚酒品质的影响,本研究对从桑葚中筛选菌株并鉴定后,将其与酿酒酵母作为发酵剂制备桑葚酒,设置同时接种(SV)、先接种非酿酒酵母(NS+SC)、后接种非酿酒酵母(SC+NS)以及仅接种酿酒酵母(SC)4种处理,对桑葚酒品质进行分析。结果表明,筛选得到一株非酿酒酵母(编号为NS-32),鉴定为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus),NS-32可有效提升桑葚酒花香、果香与草本香特征;混菌发酵可使总酯含量提升10%,降低乙醇体积分数,缓解乙醇带来的刺激性口感,提升乳酸、酒石酸、柠檬酸及乙酸含量。风味化合物分析表明,乙酸异戊酯、苯乙醇与异戊醇构成桑葚酒的风味基本骨架,而柠檬烯、苯乙醛与玫瑰醚等12种风味物质是组间关键差异挥发性标志物。SC+NS发酵桑葚酒在果香、草本香及木香维度感官评分较高,花香、酸香等感官评分适中,整体品质更优。乙酸异戊酯、苯甲酸乙酯、苯乙醇及2,3-丁二醇与感官评分呈极显著正相关(P<0.01),而辛醇、异戊醇与感官评分呈极显著负相关(P<0.01)。综上,先接种酿酒酵母后接种非酿酒酵母是改善桑葚酒品质的有效手段。

关键词:桑葚酒;接种时序;非酿酒酵母;有机酸;相关性分析

桑葚(Morus alba L.)为桑科桑属植物的成熟果实,富含氨基酸、维生素、矿物质等多种营养成分,以及花青素、芦丁、多酚等生物活性物质[1-2],在改善心血管疾病、保护神经、抗炎、抗病毒[3-4]等方面具有显著功效。然而,桑葚皮薄多汁,成熟期短暂,采后易破碎与腐败变质[5]。桑葚主要用于制备桑葚干、桑葚饮料、桑葚酒以及桑葚茶等。因此,对桑葚进行深加工不仅能大幅减少损耗,还能最大限度地保留桑葚中的营养成分与生物活性物质。

桑葚酒是以桑葚为核心原料,经清洗、破碎、主发酵等工序酿造而成的果酒。酒体富含花青素、白藜芦醇等营养物质,其蛋白质和镁、硒等矿物质元素含量优于普通葡萄酒[6]。目前,桑葚酒发酵多采用商用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),导致香气缺乏层次感,口感单薄[7],难以满足消费者多样化的需求。非酿酒酵母能够促进风味物质生成,提升果酒的香气、品质与口感。Xu Haotian等[8]在桑葚酒发酵过程中添加美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)和陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola),有效缩短了发酵周期,并鉴定出25种特征性风味化合物。Zhang Qing等[9]采用酿酒酵母SC125与植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)BC114混合发酵制备桑葚风味饮料,有效提高了酒石酸、琥珀酸等有机酸及己酸乙酯等挥发性风味物质含量。孙逊等[10]将耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)CVE-7分别与4种酿酒酵母进行混合发酵,发现增酸与产香效果不仅取决于菌株搭配类型,亦受接种顺序的显著影响。目前,针对非酿酒酵母的接种时序对桑葚酒理化特性、有机酸组成及风味物质形成的影响尚缺乏深入研究。

本研究以桑葚为原料,从中筛选并鉴定非酿酒酵母菌株,将其与酿酒酵母混合发酵酿造桑葚酒,设置同步接种(SV)、先接种非酿酒酵母(NS+SC)、后接种非酿酒酵母(SC+NS)、仅接种酿酒酵母(SC)4个处理,探究不同接种方式对桑葚酒基础理化指标、有机酸含量、挥发性风味物质以及感官品质的影响,进一步分析特征香气成分与感官品质之间的相关性,旨在为非酿酒酵母在桑葚酒中的应用提供理论依据与数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑葚(品种为无核大十) 四川宜宾长宁县;酿酒酵母SC 安琪酵母股份有限公司;白砂糖、焦亚硫酸钾(均为食品级) 淄博长城化工厂;氢氧化钠、盐酸、酚酞、无水碳酸钠、无水乙醇、硫酸亚铁、过氧化氢(均为分析纯) 成都市科隆化工试剂厂;YPD液体培养基、YPD固体培养基 北京陆桥生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

JYZ-E25型榨汁机 九阳股份有限公司;GZ-250-HS11型恒温恒湿培养箱 杭州广智科技设备有限公司;LRH-250型生化培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;STARTER型pH计 奥豪斯仪器(上海)有限公司;LX-B75L型高压蒸汽灭菌锅 成都宜恒实验仪器有限公司;T6型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;8890-5977B型气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)仪、固相微萃取三相萃取头、DB-WAX毛细管色谱柱(60 m× 250 μm,0.25 μm) 美国Agilent公司;Orbitrap Exploris 120型液相色谱-高分辨质谱仪 美国Thermo Fisher Scientific公司 ;CKX41倒置相差显微镜 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离与筛选

将10 g新鲜桑葚破碎后,于灭菌三角瓶室温自然发酵7 d。无菌条件下取2 g样品于250 mL锥形瓶中,加入40 mL无菌水,振荡均匀后室温静置20 min。取上清液1 mL,加入9 mL无菌水进行10倍梯度稀释至10-6,各取100 μL分别涂布于YPD固体培养基,28 ℃倒置培养5 d。挑选奶油色或乳白色、表面光滑、边缘整齐的单菌落,连续划线 3次,获得纯培养单菌落。

挑取单菌落,按照2%(V/V)的接种量将菌株接种到经破碎、过滤后的桑葚汁中,在杜氏小管中发酵72 h并观察气泡产生情况,记录24、48 h和72 h管内CO2产生量,以初步判断各菌株的发酵特性。将目的菌株经YPD培养基平板划线纯化3次,接种于YPD斜面培养基,28 ℃培养24 h后接种至YPD固体培养基。优先选择具备花果香气,且无生青、土腥、酸腐等异味的单菌落,同时要求菌株发酵液果香浓郁、香气协调,酸度柔和,无不良风味。

1.3.2 筛选菌株生长曲线测定

将筛选菌株及酿酒酵母SC活化液以3%(V/V)的接种量接种于YPD液体培养基,于25 ℃、200 r/min条件下振荡培养32 h,每隔2 h取样一次,采用紫外-可见分光 光度计测定OD600 nm值。

1.3.3 筛选菌株鉴定

将保藏于斜面的菌株接种至YPD固体培养基,于28 ℃ 恒温培养48 h,观察并记录菌落的大小、颜色、表面形态等特征。随后,取对数期菌液制备湿封片,于显微镜下观察菌体形态并拍摄显微图像。

将分离得到的单菌落接种至YPD液体培养基中,于30 ℃、180 r/min条件下振荡培养12 h。取1 mL菌液置于2 mL EP管中,采用煮沸法提取菌株基因组DNA,进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增。扩增引物为NL1(5′-GCATATCAATAAGCG GAAAAG-3′)与NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGAC GG-3′)。PCR扩增体系:2×Pro Taq 10 μL、正反向引物各1 μL、DNA模板5 ng,ddH2O补足至20 μL;PCR扩增条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环;72 ℃终延伸10 min。将PCR扩增产物送至上海美吉生物医药科技有限公司测序,将测序结果上传至NCBI平台进行BLAST比对分析,进行分子生物学鉴定[11]

1.3.4 桑葚酒制备工艺流程及操作要点

工艺流程:桑葚→清洗→打浆→添加偏重亚硫酸钾→ 调整成分→接种→发酵→过滤→倒罐→陈酿→精滤→装瓶。

操作要点:

预处理:清洗成熟、无损伤的桑葚,榨汁机破碎后,按照50 mg/L添加偏重亚硫酸钾,添加白砂糖调节可溶性固形物含量至22 °Brix,备用。

接种发酵:菌株总接种量为106 CFU/mL,非酿酒酵母和酿酒酵母的接种比例为1∶1。在28 ℃的条件下发酵约10 d,可溶性固形物含量不再变化时终止发酵。

陈酿:用7层纱布完成粗过滤、倒罐后,在4 ℃条件下避光贮存20 d,陈酿第7天进行转罐,陈酿结束后用过滤机进行过滤后即得桑葚酒[12]

1.3.5 理化指标测定

乙醇体积分数、还原糖、总酸、总酯和可溶性固形物含量参照韩保林等[13]的方法测定。

1.3.6 有机酸测定

有机酸的检测参照钟诗睿等[14]的方法并稍作修改。采用5、10、15、20、50、100、250、500 mg/L乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、乙酸和草酸标准溶液制作标准曲线。取5 mL桑葚酒于6 000 r/min离心2 min,取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后进样。色谱条件:进样体积10 μL;流动相为甲醇-0.01 mol/L KH2PO4溶液(pH 2.5)(5∶95,V/V);流速0.4 mL/min;柱温保持在25 ℃;检测波长210 nm。采用保留时间定性,外标法定量。

1.3.7 挥发性风味物质测定

挥发性风味物质的检测参照曹雨桐等[15]的方法并稍作修改。准确移取5 mL桑葚酒样品于15 mL顶空瓶中,加入10 μL的内标(12 mg/L 2-辛醇溶液)、2.0 g NaCl及搅拌子,在40 ℃条件下平衡20 min;随后插入萃取头,顶空萃取30 min,完成后将萃取头插入GC进样口,解吸温度250 ℃,解吸时间5 min。

GC条件:初始温度40 ℃保持5 min,以3.5 ℃/min升至200 ℃并保持 6 min,再以8 ℃/min升至230 ℃并保持3 min;载气为高纯氦气,流速为1.0 mL/min;进样口温度250 ℃,不分流进样。

MS条件:电子能量70 eV;连接杆温度180 ℃;离子源温度250 ℃;质谱扫描范围m/z 33~450。

定性与定量方法:采用线性保留指数与NIST 2014质谱库联用的方法对图谱进行定性分析,筛选匹配度大于80%的组分进行分析。采用内标法进行定量分析。

1.3.8 感官评价

感官评价由20名评审员(经过专业培训或持有果酒品评证书)组成品评小组,依据果香(10分)、花香(10分)、酒香(10分)、酸香(10分)、醇香(10分)、草本香(10分)和木香(10分)对桑葚酒样品进行感官评分,满分70分。评分标准:1~3分表示香气微弱,4~6分表示香气突出,7~10分表示香气浓郁协调[16]

1.4 数据处理

所有实验均设置3次重复,结果以x±s表示。采用Excel 2024处理数据,采用SPSSAU在线分析平台(https://spssau.com)进行方差分析。采用Origin 2024软件绘图。

2 结果与分析

2.1 发酵菌株筛选

2.1.1 初筛

杜氏小管常用于测定微生物在发酵过程中产生的气体量,可间接评估微生物的发酵特性。通过稀释涂布平板法从桑葚样品中初步分离出33株菌株,以SC作为对照,产气结果如表1所示。培养24 h后,10株菌的产气量已超过杜氏小管体积的25%;培养48 h后,9株菌株尚未开始产气,另有5株产气量已达到小管体积的50%;培养72 h后,31株菌株产气量达到25%以上,其中4株达到75%。综合不同时间点的产气速率及总量,发现NS-11、NS-23、 NS-29、NS-32在24 h即可检测到产气,且72 h产气量均达到75%,产气速率及总量均表现优异。因此,初步筛选NS-11、NS-23、NS-29和NS-32这4株菌进行后续研究。

表1 产气性能实验结果
Table1 Results of gas production performance test

菌株24 h48 h72 h菌株24 h48 h72 h SC++++++NS-17nd+++NS-1ndnd+NS-18nd++NS-2nd+++NS-19ndnd++NS-3++++NS-20nd++NS-4nd++NS-21nd+++NS-5ndnd+NS-22ndnd+NS-6+++++NS-23++++++NS-7nd++NS-24nd+++NS-8++++NS-25+++NS-9nd+++NS-26nd+++NS-10ndnd+NS-27ndndnd NS-11++++++NS-28nd+++NS-12nd+++NS-29+++++NS-13+++++NS-30nd+++NS-14ndnd+NS-31ndnd++NS-15+++++NS-32+++++NS-16nd+++NS-33ndndnd

注:nd.不产气;+、++和+++.分别表示产气量为杜氏小管体积的25%~50%、50%~75%、75%及以上。

2.1.2 复筛

由图1可知,SC的酒香和醇香得分最高,分别为8.2分 和8.1分,这与其发酵过程中产生较多醇类物质有关。菌株NS-11的草本香得分最高,为6.1分;菌株NS-23的花香得分最高,达7.6分;菌株NS-29的酸香和木香较为突出,分别为6.6分和5.1分;菌株NS-32的果香得分最高,为8.2分。整体来讲,4株非酿酒酵母的木香和草本香得分普遍偏低,而花香和果香相对突出,推测这与其发酵过程中酯类物质的生成有关。综上,菌株NS-32果香浓郁、花香适中、酒香与醇香均处于较高水平,整体感官表现较为均衡优异。

图1 不同菌株发酵桑葚酒感官评分雷达图
Fig.1 Radar chart of sensory scores for mulberry wine fermented by different strains

2.2 筛选菌株的生长曲线

由图2可知,5株菌株的生长曲线均呈典型的S形。在0~8 h内,各菌株OD600 nm值增长缓慢,处于延滞适应阶段;8 h后逐渐进入对数生长期,其中NS-23和NS-11增殖速率较快,菌株SC和NS-29次之,菌株NS-32的延滞期相对较长,约于12 h后进入对数生长期。20 h后各菌株增殖速率趋缓,24 h后均进入稳定期,OD600 nm值稳定在2.5左右,依据预先建立的标准曲线,对应菌体浓度约为1×108 CFU/mL。值得注意的是,菌株NS-32在稳定期内菌体数量维持稳定且波动较小,表明其具有较强的发酵稳定性。综合生长曲线特征与前期感官品评结果,选取NS-32进行后续发酵实验。

图2 不同菌株生长曲线
Fig.2 Growth curves of different strains

2.3 筛选菌株鉴定

2.3.1 形态学观察

由图3可知,菌株NS-32菌落呈乳白色,表面质地光滑,有较为明显的凸起,边缘较为整齐。此外,该菌落具有愉悦的香味。菌株NS-32的显微形态呈椭圆形,菌体宽约3 μm、长约6 μm。综上,初步判定菌株NS-32为酵母属菌株。

图3 菌株NS-32的菌落(A)及菌体(×1 000)(B)形态
Fig.3 Colony morphology (A) and cell morphology (×1 000) (B) of strain NS-32

2.3.2 分子生物学鉴定

经过序列比对发现,菌株NS-32与Wickerhamomyces anomalus具有较高同源性,与登录号为KY105893.1的序列同源性达到99.98%,与登录号为LC120363.1的序列同源性达到99.99%。基于以上结果,可初步将菌株NS-32鉴定为异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。

2.4 不同接种时序对桑葚酒理化指标的影响

由图4A可知,4种桑葚酒的pH值为3.81~3.97,这与丁波等[17]研究的低温桑葚酒pH值(3.88)结果一致。SV、SC组pH值分别为3.97、3.90,显著高于NS+SC、SC+NS组(P<0.05)。由图4B可知,SC+NS组总酯质量浓度最高,为2.38 g/L,且SV、NS+SC组和SC+NS组总酯质量浓度显著高于SC(P<0.05),混菌发酵可使总酯含量提升约10%,表明非酿酒酵母能积极促进酯类物质的生成与积累,进而增加酯类总量,并且在发酵24 h后添加非酿酒酵母对提升总酯质量浓度效果更为显著。由图4C可知,NS+SC、SC+NS组总酸质量浓度分别为7.20 g/L和7.36 g/L,显著高于SV、SC组(P<0.05)。由图4D可知,SC、NS+SC、SC+NS组和SV组可溶性固形物含量均稳定在3.8 °Brix左右,表明4种发酵方式的底物均得到充分利用,转化效率较高[18]。由图4E可知,SC组乙醇体积分数为8.63%,显著高于NS+SC、SC+NS组和SV组(P< 0.05)。还原糖作为微生物生长与代谢的关键底物,经过微生物体内一系列复杂的生化反应,最终生成乙醇等代谢产物,同时苹果酸、乳酸等代谢产物也会逐步积累[19]。由图4F可知,4种桑葚酒的还原糖质量浓度在2.32~2.65 g/L之间,其中SC+NS组还原糖质量浓度最低,表明该混菌发酵体系对糖底物的利用更为充分,底物利用率优于其他组。综上,SC+NS有助于总酯和总酸含量的积累,可在一定程度上提升果酒的口感层次与香气复杂性。

图4 接种时序对桑葚酒理化特性的影响
Fig.4 Effects of inoculation timing on physicochemical properties of mulberry wine

2.5 不同接种时序对桑葚酒有机酸的影响

有机酸的种类与含量是影响果酒感官特性的关键因素之一,适宜含量的有机酸能够有效缓和果酒的酸涩口感,提升酒体品质[20]。由表2可知,酒石酸和柠檬酸在桑葚酒有机酸组成中点主导地位[21],二者合计约点有机酸总量的50%。酒石酸不仅能参与酒石酸氢钾的平衡反应,促使多余的K+沉淀析出,还能与Fe3+形成稳定的络合物,在一定程度上抑制酚类物质的氧化反应[22]。在4种桑葚酒中,NS+SC、SC+NS组酒石酸质量浓度分别为1.74、1.71 g/L,显著高于SV组和SC组(P<0.05)。柠檬酸能够赋予酒体清爽口感和绵长后味,是影响感官体验的重要因素。其中,NS+SC组柠檬酸质量浓度相对较高,为1.58 g/L。乳酸和乙酸是水果中常见的有机酸,亦是大多数酯类物质合成的前体物质。乙酸含量是评估果酒在发酵过程中是否受到污染及变质的重要指标[23]。4种桑葚酒的乙酸质量浓度为0.66~0.94 g/L,均低于1.2 g/L, 符合QB/T 5476—2020《果酒通用技术要求》[24]的规定。乳酸为不挥发性酸,具有与柠檬酸类似的柔和调味作用。SV组乳酸含量最高,SC组最低,NS+SC组与SC+NS组之间无显著差异(P>0.05)。苹果酸具有浓郁的果味和生青味,略带刺激感,能够被乳酸菌降解转化为乳酸,从而实现降酸效果[25]。4种桑葚酒的苹果酸含量存在显著差异(P<0.05),其中SC+NS组酒样的苹果酸质量浓度最高,为0.91 g/L,NS+SC组酒样最低(0.57 g/L)。 草酸在所有检测的有机酸中质量浓度最低。在4种桑葚酒中,SV组草酸质量浓度最高,为0.43 g/L。综上,与单一酿酒酵母发酵(SC)相比,混菌发酵能有效提高乳酸、酒石酸、柠檬酸和乙酸含量,有助于丰富酒体的有机酸组成,改善口感层次与风味品质。

表2 接种时序对桑葚酒有机酸的影响
Table2 Effects of inoculation timing on organic acids in mulberry wine

g/L组别乳酸苹果酸酒石酸柠檬酸乙酸草酸SV0.97±0.02a0.81±0.02b1.48±0.06b1.37±0.02b0.94±0.02a0.43±0.01a NS+SC0.91±0.03a0.57±0.01d1.74±0.03a1.58±0.07a0.82±0.02b0.14±0.00d SC+NS0.92±0.02a0.91±0.02a1.71±0.02a1.34±0.02b0.82±0.02b0.29±0.01c SC0.78±0.01b0.68±0.03c1.32±0.04c1.21±0.04c0.66±0.01c0.36±0.01b

注:同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.6 不同接种时序对桑葚酒挥发性风味物质的影响

4个桑葚酒样品共鉴定出28种挥发性风味化合物,包括9种酯类、7种醇类、4种酸类、3种醛类、2种酮类、1种醚类、1种酚类和1种烯类。

由图5A可知,样品SV、NS+SC、SC+NS及SC分别检出24、19、23、22种挥发性风味物质,共有16种挥发性风味化合物,独有物质分别为1、0、1、1种,上述结果表明,非酿酒酵母的接种及时序对桑葚酒风味物质总种类未造成明显改变,但可在一定程度上调控特征香气组分含量。

图5 接种时序对桑葚酒挥发性风味物质的影响
Fig.5 Effects of inoculation timing on volatile flavor compounds of mulberry wine

由图5B可知,模型中=0.539,=0.237,累计为0.776,表明前2个成分能够解释77.6%的自变量变异信息。自变量拟合指数()为0.99,因变量拟合指数()为0.998,模型预测指数(Q2)为0.996,表示样本具有较好的分化效果。从样本分布情况来看,SV主要分布在第4象限,NS+SC集中于第1象限,SC+NS处于第1象限和第2象限的交界处,SC样本则分布在第3象限,表明NS+SC与SC+NS组间风味差异相对较小,而SC、SV与NS+SC、SC+NS之间差异较为显著,进一步说明接种时序是影响桑葚酒风味物质组成的重要因素之一。由图5C可知,经过200次置换检验,随机模型的Q2始终低于原始模型,且Q2回归线与纵轴的相交点小于0,说明模型不存在过拟合,该模型验证有效,表明此结果可以充分显示出4个组的挥发性风味物质差异。

由图5D可知,4种桑葚酒共有12种挥发性风味化合物存在显著差异,分别为柠檬烯、苯乙醛、玫瑰醚、己酸乙酯、乙酸异戊酯、苯酚、丁酸乙酯、己酸甲酯、苯乙醇、丙酸乙酯、丁酸、异戊醇。

由图5E可知,乙酸异戊酯具有香蕉香、甜香和苹果香,苯乙醇和异戊醇能赋予酒体花香和水果香[26],3种风味物质含量较高且被聚为1类,构成了桑葚酒风味的基本骨架。异戊醇、辛醇、2,3-丁二醇、丙三醇、苯乙醇、乙酸、异戊醛、苯乙醛、3-羟基二丁酮、羟基丙酮、癸酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲酸乙酯、己酸甲酯、乙酸异戊酯为共有风味化合物,均对桑葚酒的果香与花香形成具有贡献。此外,丙酸乙酯仅在SV中检测到,庚酸仅出现在SC中,而玫瑰醚在SC+NS中检测到,表明以上物质可能对桑葚酒香气特征差异化方面具有潜在作用。

综上,混菌发酵可在一定程度上增加桑葚酒挥发性风味物质的种类,且对其风味基本骨架无明显影响;接种时序是调控桑葚酒风味物质组成的重要因素,不仅对酯类物质的生成具有显著影响,还会导致特征性香气物质产生,进而决定桑葚酒的香气差异化特征。

2.7 不同接种时序对桑葚酒感官评价的影响

由图6可知,花香、酒香与醇香为4组桑葚酒的共性优势香气,各组评分均达7分以上,果香得分也普遍较高,表明桑葚原料本身的果香特征在发酵过程中得到充分保留,同时,醇类物质也赋予了酒体协调的发酵香与醇厚感。相较而言,木香与草本香的评分依旧偏低。从组间差异来看,酸香与酒香的评分差异较小,受处理方式的影响较小;而花香与果香的组间评分差异较为显著,表明这类香气受处理方式的影响更大。组间香气轮廓呈现明显差异化,NS+SC组酒样在花香与酸香维度评分较为突出,SC组酒样的酒香与醇香评分最高,SC+NS组酒样在果香、草本香及木香维度表现更优,SV组酒样各香气维度的评分均处于中间水平。推测上述现象的原因在于,酿酒酵母与非酿酒酵母在发酵过程中表现出良好的互补作用。二者的协同效应不仅减少了营养物质的损耗,还改善了桑葚酒的香气组成与品质,整体风味协调性更佳[27]。综上所述,非酿酒酵母的接种时序会影响菌群代谢及酶解反应,有效释放萜烯与芳香前体,富集酯类、高级醇等风味物质;同时,还在一定程度上调控了有机酸种类及含量比例,弱化了尖锐酸涩感,提升酒体饱满圆润度[28-29]

图6 不同接种方式下桑葚酒感官评分雷达图
Fig.6 Radar chart of sensory scores of mulberry wine under different inoculation modes

2.8 共有挥发性风味物质与感官评价的相关性分析

由图7可知,乙酸异戊酯与果香和木香呈极显著正相关(P<0.01);苯甲酸乙酯具有青草香和油脂香特征[30],与醇香呈极显著正相关(P<0.01);苯乙醇属于芳香族化合物,具有较为浓郁的玫瑰香[31],与花香呈极显著正相关(P<0.01);2,3-丁二醇是酵母菌发酵的特征代谢产物,可赋予酒体甜香及奶油风味,与醇香呈极显著正相关(P<0.01);辛醇与醇香呈极显著负相关(P<0.01);异戊醇含量过高易使酒体携带苦味、涩味,并产生不良气味,与果香、木香呈极显著负相关 (P<0.01)。综上,乙酸异戊酯、苯甲酸乙酯、苯乙醇及2,3-丁二醇分别对果香、木香、醇香、花香等愉悦风味属性具有显著正向贡献,是构成桑葚酒优良感官品质的关键香气物质,而辛醇与异戊醇则与部分理想风味呈负相关,其含量需要控制在一定范围之内。

图7 共有挥发性风味物质与感官评价的相关性分析
Fig.7 Correlation analysis between shared volatile flavor compounds and sensory evaluation

3 结 论

本研究从自然发酵7 d的桑葚中筛选出1株异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)NS32,并系统探究了不同接种时序的混菌发酵模式对桑葚酒品质的影响。结果表明,混菌发酵可有效提升桑葚酒中总酯、乳酸、酒石酸、柠檬酸及乙酸的含量,显著降低酒体乙醇体积分数,缓解乙醇带来的刺激性口感,并增强酒体花香、果香与木香特征,且SC+NS(先加入酿酒酵母,24 h后加入非酿酒酵母)的桑葚酒品质相对较高。相关性分析结果显示,乙酸异戊酯、苯甲酸乙酯、苯乙醇及2,3-丁二醇与感官评分呈极显著正相关,而辛醇、异戊醇则与感官评分呈极显著负相关。然而,本研究仅针对1株非酿酒酵母的不同接种时序开展探究,研究范围存在一定局限性。后续研究可进一步扩大非酿酒酵母的筛选范围,挖掘适配桑葚酒酿造的专用酵母菌株,同时结合工艺优化、酵母复配等技术手段,进一步提升桑葚酒酒体品质,为桑葚深加工产业的高质量发展提供理论指导与技术支撑。

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Screening of Non-Saccharomyces Yeasts and Effects of Their Inoculation Timing on Mulberry Wine Quality

XIANG Xinyu1, JIN Fenzhu1, LIU Shuanghao1, YANG Kailong2,3,*, FANG Yuli3

(1. Huililai Brewery, Qionglai City, Sichuan Province, Chengdu 611530, China;2. Sichuan Qionglai Jinliufu Yagu Ecological Brewing Co. Ltd., Chengdu 611530, China;3. School of Food and Liquor Engineering, Sichuan University of Science & Engineering, Yibin 644002, China)

Abstract: To investigate the effect of mixed inoculation of non-Saccharomyces yeast and Saccharomyces cerevisiae on the quality of mulberry wine, strains isolated from mulberry fruits were identified and then co-cultivated with S. cerevisiae as fermentation starters for mulberry wine brewing. Four fermentation treatments were established, namely simultaneous inoculation (SV), pre-inoculation of non-Saccharomyces yeast followed by S. cerevisiae (NS + SC), sequential inoculation of S. cerevisiae prior to non-Saccharomyces yeast (SC + NS), and single inoculation of S. cerevisiae (SC), and the quality of mulberry wine was analyzed. The results showed that a non-Saccharomyces yeast (NS-32), identified as Wickerhamomyces anomalus, could effectively enhance floral, fruity, and herbal aroma profiles of mulberry wine. Mixed fermentation increased total ester content by 10% while lowering alcohol content to reduce alcohol irritation, and elevated the contents of lactic acid,tartaric acid, citric acid, and acetic acid. Volatile flavor compound analysis revealed that isoamyl acetate, phenylethyl alcohol,and isoamyl alcohol constitute the basic flavor skeleton of mulberry wine, while 12 volatile substances, including limonene,phenylacetaldehyde, and rose oxide, served as key differential volatile markers discriminating different fermentation groups.The mulberry wine fermented with SC + NS scored higher in fruity, herbal, and woody aromas, with moderate scores in floral and sour notes, showing overall better quality. Correlation analysis further indicated that isoamyl acetate, ethyl benzoate, phenylethyl alcohol, and 2,3-butanediol were extremely significantly positively correlated with sensory scores(P < 0.01), while octanol and isoamyl alcohol showed extremely significant negative correlations with sensory scores (P < 0.01).In conclusion, sequential inoculation of S. cerevisiae followed by non-Saccharomyces yeast was an efficient strategy to improve the comprehensive quality of mulberry wine.

Keywords: mulberry wine; inoculation timing; non-Saccharomyces yeast; organic acid; correlation analysis

收稿日期:2026-01-14

基金项目: 四川轻化工大学2023年泸州老窖研究生创新基金项目(LJCX2023-6)

第一作者简介: 向新宇(1984—)(ORCID: 0009-0001-5977-9376),男,高级工程师,硕士,研究方向为酿酒生产及酒体设计。E-mail: 471989990@qq.com

*通信作者简介 杨开龙(1984—)(ORCID: 0009-0009-0349-7781),男,工程师,硕士,研究方向为白酒酿造和酒体设计。E-mail: 672223717@qq.com

DOI: 10.11882/j.issn.0254-5071.2026.07.025

中图分类号:TS262.7

文献标志码:A

文章编号:0254-5071(2026)07-0206-09

引文格式:
向新宇, 金粉竹, 刘双豪, 等. 非酿酒酵母筛选及其接种时序对桑葚酒品质的影响[J]. 中国酿造, 2026, 45(7): 206-214.DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.07.025. http://www.chinabrewing.net.cn
XIANG Xinyu, JIN Fenzhu, LIU Shuanghao, et al. Screening of non-Saccharomyces yeasts and effects of their inoculation timing on mulberry wine quality[J]. China Brewing, 2026, 45(7): 206-214. (in Chinese with English abstract) DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2026.07.025. http://www.chinabrewing.net.cn