宁夏贺兰山东麓产区作为中国葡萄酒优势产区[1],以其独特的风土条件孕育了众多优质的酿酒葡萄品种[2]。其中,马瑟兰以其色泽深浓、果香馥郁、结构感强及良好的抗病性,已在该地区形成规模化种植[3-4]。
负载量作为协调葡萄树体营养生长与生殖生长的核心农艺手段,直接决定果实品质形成与原料风格表现,是葡萄栽培管理中调控果实综合品质的关键措施之一[5-7]。国内外研究表明,负载量主要通过改变树体微环境及源库关系影响葡萄的生理特性[8]、果实化学成分[9-12]以及最终葡萄酒的感官属性[13]。适量降低负载量能够显著改善浆果品质,一方面可优化光合产物分配,增强碳氮代谢协调性[14-15];另一方面,通过疏序、疏果等措施优化果穗结构[10],促进果皮中花色苷等次生代谢产物的积累[16],使葡萄酒呈现更深色泽、更浓郁果香特征及更协调口感结构[9,16]。然而,现有负载量研究多集中于鲜食葡萄、赤霞珠等传统酿酒葡萄品种[6,8,13],马瑟兰普遍存在单梢坐果量大(2~3穗/梢)导致的高负载特征,但其负载量对果实品质及风味代谢的调控机制尚不明确。
因此,本研究以7年生马瑟兰葡萄为研究对象,设置不同负载量(10、15、20条梢/m架面),以25条梢/m架面为对照,系统探究负载量对葡萄果实外观品质、基础理化指标以及多酚、有机酸、挥发性化合物的影响,旨在明确该产区马瑟兰葡萄的适宜负载量,为生产优质酿酒原料与高品质葡萄酒提供理论依据与实践指导。
马瑟兰葡萄来自宁夏中泽西班新农业科技有限公司葡萄基地,定植于2017年,株行距为0.8 m×3.5 m,整形方式为倾斜水平龙干型,土壤类型为沙壤土。
甲醇、乙醇、乙酸乙酯(均为色谱纯) 美国默克公司;甲酸(质谱纯) 美国Thermo Fisher Scientific公司;没食子酸、原儿茶酸甲酯等34种单体酚标准品(纯度>95.6%) 上海安谱实验科技股份有限公司;矮牵牛色素、飞燕草色素等18种花色苷标准品(纯度>95%) 上海源叶生物科技有限公司;莽草酸、奎宁酸等12种有机酸标准品(纯度>90%) 广州佳途科技股份有限公司。
PL202-L百分之一天平 梅特勒托利多科技(中国)有限公司;U3000液相色谱-TSQ-ALTIS三重四极杆质谱仪(配备电喷雾离子源) 美国Thermo Fisher Scientific公司;GCMS-TQ8050 NX三重四极杆气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)仪 日本岛津公司;PAL-1数字阿贝折射仪 日本爱拓分公司。
1.3.1 负载量设置
选择生长发育良好、长势一致的‘马瑟兰’葡萄植株。本研究的负载量差异主要通过调控葡萄树体的新梢密度实现,新梢密度分别为10、15、20条/m架面(F1、F2、F3),以25条/m架面为对照(CK),每个处理设置4个杆空(每个杆空6 m),每个处理3个重复。除疏除多余枝条外,其他栽培管理措施均按照酒庄统一标准进行。葡萄完全成熟后(2024年9月19日),每个处理采集10穗用于品质指标测定。
1.3.2 葡萄果实外观品质与基础理化指标测定
果穗尺寸:随机选取马瑟兰葡萄果穗,使用卷尺测量其长度和宽度;果实大小:随机选取马瑟兰葡萄果粒50粒,使用游标卡尺随机测量果粒的横径与纵径;穗质量、百粒质量:采用电子天平测定;可溶性固形物含量:使用数字阿贝折射仪测定;还原糖含量(以葡萄糖计):采用斐林试剂滴定法测定;总酸含量(以酒石酸计):采用NaOH滴定法测定;pH值:采用pH计测定。
1.3.3 葡萄果实有机酸测定
采用超高效液相色谱-串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法检测葡萄果实中有机酸。 称取2.00 g葡萄样品于50 mL离心管中,加入20.0 mL水,1 500 r/min涡旋提取1 min,4 000 r/min离心5 min,过0.45 μm水相滤膜,待测。
UPLC条件:Spursil C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,3 μm);柱温30 ℃;流速0.4 mL/min;进样体积2.0 μL;流动相A为0.1%甲酸溶液,流动相B为乙腈;梯度洗脱程序:0~14 min,95%~70% A;14~15 min,70% A;15~16 min,70%~90% A;16~18 min,90% A;18~19 min,90%~95% A;19~20 min,95% A。
MS条件:电喷雾离子源;扫描模式为负离子模式,选择反应监测模式,喷雾电压2 500 V;鞘气流速35 arb;辅助气流速10 arb;离子传输管温度300 ℃;雾化温度350 ℃;根据标准品优化的自建质谱库离子信息进行定性,外标法进行定量。
1.3.4 葡萄果实单体酚、花色苷及挥发性风味物质测定
单体酚测定:采用Ge Qian等[17]的方法。称取2 g葡萄样品于15 mL离心管中,加入2 mL乙酸乙酯,涡旋振荡1 min,4 000 r/min离心3 min。收集上层清液于250 mL圆底旋蒸瓶中,重复萃取3次,经旋转蒸发仪蒸发至干,2 mL甲醇溶解残渣,经0.45 μm有机相滤膜过滤后进行UPLC-MS/MS法测定。
花色苷测定:采用陈翔等[18]的方法。准确称取0.05 g葡萄皮粉末,加入10 mL 含2%甲酸的甲醇溶液,超声(功率300 W、温度25 ℃)提取10 min,涡旋振荡20 min,随后4 000 r/min离心15 min,收集上清液,重复萃取3次,经旋转蒸发仪蒸发至干。流动相A为0.1%甲酸,流动相B为含0.1%甲酸的甲醇-乙腈(50∶50, V/V)溶液,样品经A、B两相混合液(体积比9∶1)复溶并定容至10 mL,经0.22 μm滤膜过滤后进行 UPLC-MS/MS测定。
挥发性风味物质测定:参照Yi Zicheng等[19]的方法。准确称取5.0 g葡萄样品于20 mL样品瓶中,加入1.5 g氯化钠,添加40 μL内标物4-甲基-1-戊醇(394.1 μg/L),混匀,采用GC-MS法测定。
采用Excel 2019处理数据;采用SPSS Statistics 25.0软件进行方差分析;采用Origin 2021、TBtools软件绘图;采用SIMCA 14.1进行正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)。
如表1所示,随着负载量增加,果实果穗质量、果穗长和果穗宽呈降低趋势,而果实横径和百粒质量呈先降后升的趋势。果穗长度、果穗宽度及果实纵、横径在各负载量处理组间无显著差异(P>0.05)。果穗质量在F1组与CK组之间存在显著差异(P<0.05),百粒质量在F1组与F3组间差异显著(P<0.05)。负载量差异对葡萄果实纵、横径无明显调控作用,但负载量对果穗性状具有明显影响,与CK相比,F1组果穗质量(提升11.8%)、果穗长度(提升10.2%)和果穗宽度(提升13.9%)均有所提高。整体而言,F1组外观品质更优。
表1 不同栽培处理对马瑟兰葡萄果实生长指标的影响
Table1 Effects of different cultivation treatments on growth indicators of Marselan grape fruits
F1207.97±20.06a89.06±5.56a15.98±0.58a11.98±1.04a12.42±0.45a11.45±0.57a F2200.18±17.10ab85.88±4.54ab15.71±1.29a11.34±0.45a11.94±1.03a11.13±0.97a组别果穗质量/g百粒质量/g果穗长度/cm果穗宽度/cm纵径/mm横径/mm F3198.35±5.25ab76.08±5.94b15.35±1.41a11.03±0.94a11.89±1.02a11.11±0.29a CK186.10±12.89b86.66±3.12ab14.50±0.14a10.52±1.00a11.97±1.02a11.41±0.93a
注:同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。表2同。
负载量越低,单株叶面积指数与光合产能相对更充裕,充足的碳源供应促进了同化物向果穗库的分配,从而导致葡萄果穗质量、百粒质量、体积增大[20]。负载量过高,有限的同化物被分摊至更多的果穗,导致单果分配到的养分减少,果穗发育受限。因此,负载量对果穗外观性状具有显著的调控效应,降低负载量有利于增大果穗规格。
葡萄的基本品质会直接影响葡萄酒的发酵过程及最终产品的风味[21]。如表2所示,不同处理组葡萄果实的出汁率(46.04%~51.25%)、可溶性固形物(22.21~24.73 °Brix)和pH值(3.58~3.66)无显著差异(P>0.05)。CK组葡萄果实还原糖、总酸含量显著低于其他处理组(P<0.05),F2组葡萄果实的还原糖含量最高(249.0 g/kg);但各处理组总酸含量无显著差异(P>0.05),贺兰山东麓产区总体呈现糖高酸低的特点[22],负载量调控可有效提升总酸含量,其中,F1组较CK组总酸含量提升2.52 g/kg、还原糖含量提升21.3 g/kg,增幅分别为64.8%和10.3%,改善了葡萄糖酸平衡。
表2 不同负载量条件下马瑟兰葡萄果实基础理化指标
Table2 Basic physicochemical indices of Marselan grape fruits under different crop loads
含量/°Brix(g/kg)(g/kg)pH F246.04±2.01a24.73±2.11a249.0±4.9a6.12±0.01a3.59±0.01a还原糖含量/总酸含量/组别出汁率/%可溶性固形物F151.25±3.70a22.21±0.77a228.2±12.0b6.41±0.01a3.58±0.02a F346.69±3.74a22.50±0.45a222.3±5.6c6.09±0.09a3.65±0.04a CK49.83±1.99a23.44±2.14a206.9±13.1d3.89±0.01b3.66±0.02a
2.3.1 单体酚
酚类化合物是决定葡萄酒颜色、风味和稳定性的关键成分,也是葡萄和葡萄酒具备高抗氧化活性的物质基础[23],葡萄果实中酚类物质的积累受光合产物分配等源-库关系和光照、温度等微环境的影响[24-25]。对葡萄果实检出的19个单体酚根据苯甲酸衍生物、肉桂酸衍生物、黄酮醇及其苷类、黄烷醇、其他黄酮类和二氢查耳酮苷 6类进行归类分析。如图1A所示,新梢密度对多酚积累呈显著负向调控,总酚及单体酚含量均随负载量增大而降低。F1组(10条/m)总酚含量达185 mg/kg,较CK组增加43%;负载量增至15、20、25条/m后,总酚含量稳定在130 mg/kg,表明超过阈值后抑制效应达到饱和。低负载量下,黄烷醇和其他黄酮类在F1组含量最高,较CK组分别增加53%和135%,是高负载量处理下驱动总酚含量下降的主要成因;苯甲酸衍生物和黄酮醇及其苷类受负载量调控弱;肉桂酸衍生物在CK组含量最高,表明高负载量有利于该物质积累。综上,适度降低新梢密度有利于维持高多酚水平,而过高新梢密度主要通过抑制黄烷醇及其他黄酮类化合物积累,导致总酚含量下降。新梢负载量通过改变源-库平衡及冠层微环境调控酚类合成[26]。低密度(F1)处理下,冠层结构较为开放,高透光率不仅提供光合碳源,更激活苯丙烷代谢途径,促进多酚积累,这与万昊[27]在‘北红’葡萄的研究结果一致,即低负载条件下上调PAL等关键酶基因表达;也与 Sun Runze等[28]关于光照与类黄酮呈正相关的结论相符,证实了改善冠层光照是提升马瑟兰葡萄酚类品质的关键驱动因子。反之,高密度处理导致冠层郁闭,果实受光不足限制碳骨架供应,且高湿微环境诱发氧化胁迫,抑制次生代谢基因表达。马瑟兰品种着色潜力相对较低,对弱光环境更敏感,故F3处理下酚类含量降幅显著。因此,适度降低新梢密度可通过优化冠层光环境与源-库关系提升多酚品质,而过高的新梢负载削弱光驱动的苯丙烷代谢活性。综上,F1组葡萄果实中多酚累积最优。
图1 不同负载量条件下马瑟兰葡萄果实多酚含量(A)及聚类热图(B)
Fig.1 Polyphenol contents (A) and cluster heatmap (B) of Marselan grape fruits under different crop loads
由图1B可知,马瑟兰葡萄果实的多酚组分对新梢负载量的响应呈现阶段性特征。F1组样品聚为1类,没食子酸、表儿茶酸、异槲皮苷及儿茶酸等黄烷醇类物质及丁香酸、白藜芦醇等黄酮醇及其苷类物质含量均维持在较高水平,反映出低负载条件能够有效激活苯丙烷代谢途径;随着新梢负载量提高至15、20条/m,样本独立聚为一支,多数多酚类次生代谢产物含量显著下调;当负载量进一步增至25条/m时,以咖啡酸、槲皮素等羟基肉桂酸类物质相对富集为特征。该结果揭示了冠层微环境发生恶化的临界阈值:低密度条件下充足的光照有利于类黄酮与酚酸的协同积累,而高密度引发的冠层郁闭与资源竞争则打破了这一正向代谢流向,导致果实化学轮廓发生本质改变。上述结果进一步证实,合理控制新梢负载量是维持马瑟兰葡萄果实多酚品质稳定性的关键农艺措施。
2.3.2 花色苷
花色苷是葡萄果实呈色的关键物质,对葡萄酒的色泽稳定性及风味品质具有重要影响[29]。由图2A可知,葡萄果实中共检出11种花色苷组分,其中以锦葵色素-3-O-葡萄糖苷含量最高,为362.2~405.5 mg/kg,点总花色苷含量的63.9%~70.8%,与Wang Yu等[15]研究结果基本一致,进一步证实该组分是马瑟兰果实呈色及决定葡萄酒颜色深浅的核心物质。随新梢密度的增大,花色苷组分含量呈先升后降的趋势,除锦葵色素-3-O-葡萄糖苷、锦葵色素和飞燕草色素含量在F3组达到峰值外,其他花色苷均在F2组达最高值。上述结果表明,新梢负载量通过调控源-库关系及碳氮代谢显著影响花色苷合成。与CK组 相比,F2和F3组叶果比更为合理,光合产物向果实的分配效率更高,同时冠层通风透光条件的改善有效增强了苯丙烷代谢途径活性,从而促进花色苷积累,总花色苷含量较CK组提高8.3%~9.1%。当新梢负载量降至 10条梢/m时,矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、芍药色素等部分花色苷组分含量有所下降,这可能与过低负载下植株营养生长过旺、光合同化产物向营养器官的分配比例增大有关[30], 进而导致内源激素平衡改变、光氧化胁迫增强及花色苷前体代谢受阻,抑制了花色苷的合成。综上,马瑟兰葡萄果实花色苷积累的最适新梢负载量为15~20条梢/m, 在此条件下可有效优化果实着色品质。
图2 不同负载量条件下马瑟兰葡萄果实花色苷含量(A)及其 聚类分析(B)
Fig.2 Anthocyanin contents (A) and cluster analysis (B) of Marselan grape fruits under different crop loads
由图2B可知,11种花色苷依据其对新梢负载量变化的响应模式可划分为2类。第1类以锦葵色素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草色素及其前体锦葵色素为代表,紧密相邻,且均在F3组积累量最高,表明这3种组分可能共享相似的合成调控节点,且对适度负载量条件下光信号与糖代谢协同作用的响应更为敏感。研究证实,遮阴/光照改变会影响马瑟兰葡萄花色苷组分及PAL、CHS、DFR、UFGT、MYB等基因表达[31]。第2类包含芍药素、矢车菊素及丁香色素等其他8种花色苷组分,均在F2处理下达到峰值,表明经不同程度甲基化与糖基化修饰的花色苷,其积累对碳氮代谢平衡及相应酶促修饰环境具有更强的依赖性。
综上,马瑟兰葡萄果实花色苷的积累并非随新梢负载量降低而线性增加,而是在F2、F3处理(15、20条/m)下达到较高水平。在此条件下,冠层光温微环境、碳氮分配及内源信号协同调控效果最佳,有效促进了2类花色苷的同步积累。因此,将新梢负载量调控至15~20条/m是优化马瑟兰葡萄果实着色品质的重要农艺措施。
2.3.3 有机酸
有机酸是酿酒葡萄果实中重要的风味物质之一,是构成葡萄酒口感骨架的主要来源,也是评价酿酒葡萄与葡萄酒品质的重要指标[32]。由表3可知,成熟葡萄果实中共检出8种有机酸,果实中各有机酸含量差异较大:酒石酸含量最高,介于7 457.37~8 784.27 mg/kg之间,是葡萄果实中的特征酸,也是葡萄与葡萄酒中酸度的主要来源[33];其次是苹果酸,含量均高于1 000 mg/kg,柠檬酸和丙酮酸含量居中,为100~500 mg/kg,富马酸、奎宁酸、莽草酸和琥珀酸含量多在100 mg/kg以下。
表3 不同负载量条件下马瑟兰葡萄果实有机酸含量
Table3 Organic acid contents in Marselan grape fruits under different crop loads
mg/kg酒石酸8 748.01±630.83 a8 784.27±633.44a8 716.42±485.31a7 457.37±582.44b柠檬酸367.73±9.73b334.63±6.69bc324.74±29.76c406.54±25.39a莽草酸16.89±0.34bc14.79±0.78c17.69±0.64b21.61±2.06a c9.06±0.31bc10.21±0.62b16.99±1.33a有机酸F1F2F3CK苹果酸1 457.51±126.22b1 196.67±97.95b1 202.29±114.69b2 632.39±348.23a丙酮酸122.40±6.81a119.86±11.80a107.14±3.86a116.07±10.12a富马酸61.80±8.18b53.41±2.33b43.35±3.13c100.05±2.65a奎宁酸43.76±3.16a46.86±4.00a47.91±0.83a44.03±1.53a琥珀酸8.72±0.15总量10 826.82±426.34a10 559.54±501.23a10 469.75±566.45a10 795.05±369.78a
注:同行小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。表4同。
负载量对葡萄果实中有机酸总量无明显调控作用,但对果实有机酸组分含量具有一定影响。整体来看,负载量处理组(F1、F2、F3)之间各有机酸含量差异较小,而与对照组之间差异更为明显。其中,酒石酸在各处理组间无显著差异,但CK组显著低于负载量处理组(P<0.05)。CK组苹果酸含量显著高于负载量处理组(P<0.05),且随负载量增加呈下降趋势;柠檬酸、富马酸及莽草酸在CK组中亦表现出较高水平,而在负载量处理组中整体降低。琥珀酸含量在CK组中亦显著高于处理组(P<0.05),而在F1、F2、F3组相对较低并随负载量增加而略有升高。需要说明的是,本研究中CK样品采自同一试验田块,在降雨条件下发生自然灰霉病。已有研究表明,灰霉病可通过破坏果实组织结构、增强细胞壁降解及促进微生物代谢活动显著影响果实有机酸的积累与降解过程[34]。因此,CK组中苹果酸及部分呼吸代谢相关有机酸(如琥珀酸、柠檬酸等)的升高,可能与病害诱导的代谢紊乱及微生物参与的次级代谢有关。
聚类分析结果(图3)显示,F1、F2、F3组聚为 1类,而CK单独聚为1类,表明不同负载量调控条件下果实有机酸组成模式具有一致性,而CK由于病害背景影响,其代谢谱与处理组存在显著差异。这一结果进一步说明,负载量调控主要影响果实正常成熟过程中的有机酸代谢分配,而病害因素则会显著改变其代谢特征。综合来看,不同负载量处理主要通过调节果实成熟代谢过程影响苹果酸等呼吸代谢相关有机酸水平,从而改变果实酸组分结构;而CK组的差异性主要来源于灰霉病诱导的病理代谢干扰。
图3 不同负载量条件下马瑟兰葡萄果实有机酸含量热图
Fig.3 Heatmap of organic acid contents in Marselan grape fruits under different crop loads
2.3.4 挥发性风味物质
葡萄果实中挥发性化合物的复杂性和多样性主要是气候条件、葡萄品种等多种因素共同影响的结果[35]。对不同负载量处理下葡萄中挥发性成分进行鉴定分析,在葡萄中共检出12类130种挥发性香气物质(表4)。其中,酯类物质检测到的最多,有42种,其中包括乙酸酯类(22种)、其他酯类(13种)、乙基酯类(7种),其次为烷烃类(27种)、醇类(26种)、酸类(10种)、 酮类(9种)、萜烯类(5种)、醛类(3种)、酚类(2种) 和醚类(1种)。本研究采集葡萄样品年份降雨量较高,果实在成熟期及采收前后易受灰霉病及其他腐生微生物侵染,从而引起果实微生态结构改变,且部分底物的微生物转化过程增强。这一系列变化对挥发性风味物质组成具有重要影响。
表4 不同处理组马瑟兰葡萄果实挥发性风味物质含量
Table4 Contents of volatile flavor compounds in Marselan grape fruits of different treatment groups
μg/kg种类化合物F1F2F3CK苯甲醇40.70±0.70b12.44±0.57c6.08±0.46c364.09±18.92a 2-乙基己醇ND3.12±0.094a1.84±0.11bND 3-苯丙醇4.66±0.33b4.38±0.50b4.65±0.40b23.00±1.20a异戊醇113.40±9.00b110.08±6.87b93.98±4.10b4 408.20±352.66a 1-壬醇5.37±0.21b6.46±0.17b4.28±0.11b93.83±7.33a 2-(十八氧基)乙醇NDND1.63±0.12aNDβ-苯乙醇184.12±11.50a145.50±11.64b135.53±14.28bND 2,3-丁二醇NDNDND327.72±15.02a反-2-庚烯-1-醇NDND21.887±1.317aND 3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇NDNDND89.23±4.97a(S)-(+)-3-甲基-戊醇ND8.21±0.62a3.59±0.34b8.82±0.40a 1-己烯-3-醇25.80±1.18aNDNDND 2-庚醇18.02±1.12c21.47±1.14b14.39±1.44d46.88±2.15a醇类2-丙基-1-戊醇1.84±0.08bNDND3.10±0.25a 2-壬炔-1-醇NDNDND32.61±3.44a 1-戊烯-3-醇ND6.66±0.52aNDND 2-壬基醇NDNDND49.84±0.86a乙醇2 613.34±52.26b3 042.64±190.01b2 592.58±6.43b32 916.60±2 373.65a顺式-5-辛烯-1-醇ND5.72±0.32aNDND 3,4-二甲基-1-戊醇0.70±0.055aNDNDND十一甘醇ND2.38±0.31aNDND正丁醇5.39±0.19d14.61±1.10a7.57±0.33c9.06±0.24b 3-(1-甲基丁氧基)-2-丁醇ND18.38±2.09aNDND异丁醇11.24±1.22b11.99±0.55b5.92±0.64b973.92±86.56a顺-2-己烯-1-醇3.02±0.29c378.29±28.56a268.43±23.86b15.33±0.61c反式-3-己烯-1-醇20.24±0.35c41.46±4.15a27.85±1.28b43.68±3.81a醇类总量3 047.85±109.89b3 833.80±268.37b3 190.22±261.13b39 405.90±1 042.58a苯酚5.49±0.20b4.14±0.33c3.28±0.31d20.90±0.42a酚类邻甲基间羟基二苯胺16.06±1.05a18.23±2.15a8.70±0.54bND酚类总量21.55±1.51a22.38±1.57a11.98±1.33b20.90±0.75a九甘醇单甲醚NDND5.22±0.47aND醚类醚类总量NDND5.22±0.47aND丙位壬内酯NDNDND31.63±2.07a甲酸庚酯20.71±2.04b28.83±2.18a12.15±0.74c21.44±1.34b丙酸香茅酯NDNDND56.55±1.50a 2-羟基异丁酸甲酯5.99±0.68aNDNDND己酸异戊酯NDNDND15.28±0.56a丙酸己酯NDNDND53.63±5.12a其他苯甲酰基异硫氰酸酯8.22±0.36aNDNDND酯类丙酸正戊酯NDNDND28.84±0.76a 1,3-丙二醇二乙酸酯NDNDND48.13±2.21a己酸己酯NDNDND16.11±1.12a 2,2,4-三甲基戊二醇异丁酯1.84±0.18b5.34±0.30a1.75±0.15bNDγ-己内酯2.56±0.21c8.56±0.37a7.06±0.72bND正丁酸乙烯酯NDND6.73±0.18aND其他酯类总量39.31±3.43b42.73±1.96b27.69±1.27b271.64±13.58a苯甲醛6.87±0.30bND3.10±0.27c60.22±2.09a醛类2正-己己烯醛醛4141..3087±±04..6200ba35.85N±D2.59b2133..0598±±01..7698caNNDD醛类总量62.32±5.40a35.85±1.90b39.76±0.69b60.22±6.51a
续表4
种类化合物F1F2F3CK丁酸NDNDND10.99±0.72a 2-甲基丁酸7.09±0.38aNDNDND辛酸NDNDND96.56±0.97a反式-2-己烯酸9.42±1.25aNDNDND己酸NDNDND667.26±57.01a酸类2-甲基丙酸NDNDND85.87±1.72a酮丙二酸13.15±0.23b19.51±1.95b14.01±0.49b183.63±7.34a乙氧基乙酸NDNDND40.50±4.67a冰醋酸102.84±6.744 b 129.39±11.64 b 47.77±3.73 b 4 321.44±539.75 a异丁酸7.34±0.82 a 7.13±0.62 a 4.33±0.34 b ND酸类总量139.84±13.34b156.03±9.36b66.12±1.75b5 406.25±280.92a月桂烯6.13±0.18bNDND35.39±3.15a(+)-柠檬烯5.21±0.24bND1.90±0.17c27.48±0.55a香叶醇16.90±1.61 aNDNDND萜烯类橙花醇5.54±0.39a5.65±0.25aNDND芳樟醇3.09±0.36aNDNDND萜烯类总量36.88±3.99b5.65±0.25c1.90±0.069c62.87±4.75a 3-辛酮10.42±0.62a9.77±0.45a5.55±0.63bND甲基庚烯酮5.32±0.47aND1.49±0.10bND甲基壬基甲酮NDNDND45.25±1.97a 3-羟基-3-甲基-2-丁酮NDND4.51±0.43aND 3-羟基-2-丁酮30.27±1.39 b 21.38±0.21 b 12.69±1.01 b 1 539.91±55.52 a酮类2,4-二甲基-3-戊酮ND10.81±1.43aNDND 4-羟基-2-丁酮NDNDND20.57±1.68a 2-十九烷酮NDND1.12±0.095 aND 2-壬酮3.66±0.073bNDND79.69±5.58a酮类总量49.66±2.16b41.96±0.84b25.36±1.54b1 685.42±33.71a十二烷ND16.65±0.60 a 2.45±0.088 b ND正二十烷5.86±0.20 c 8.78±0.61 a 6.81±0.18 b ND2-甲基四癸烷NDND0.58±0.046 a ND2,5-二甲基十一烷ND13.90±0.61 a NDND3,8-二甲基十一烷3.08±0.30 a NDNDND3,8-二甲基癸烷ND7.11±0.58 a NDND5-丁基壬烷ND4.97±0.086 a NDNDβ-香树脂烷NDNDND8.34±0.83 a 7-甲基十七烷ND2.84±0.17 aNDND烷烃类4-甲基十四烷ND0.83±0.044 a NDND5-甲基十四烷ND8.59±0.48aNDND 7-甲基十六烷ND21.60±2.28aNDND 9-甲基十七烷ND16.21±1.99aNDND 2,4-二甲基癸烷NDNDND30.29±1.89a 3-甲基-5-丙基壬烷NDNDND9.49±0.10a 2,6,10-三甲基十三烷ND6.21±0.28 aNDND 1-氯二十二烷ND4.77±0.19aNDND正十六烷ND8.08±0.53aNDND正三十二烷ND15.84±1.38aNDND 10-甲基十九烷ND16.98±0.95a0.92±0.092bND 1,1-二甲基-2-戊基环丙烷3.74±0.23 a NDNDND3,3,8-三甲基癸烷ND3.75±0.30aNDND十三烷3.10±0.37 aNDNDND烷烃类十四烷NDND2.31±0.16b43.15±5.09a正十七烷ND16.31±0.91 a NDND正二十一烷ND33.77±2.36a7.90±0.75c29.80±1.86b二十五烷ND15.99±1.12aNDND烷烃类总量23.69±2.07c223.16±15.62a20.95±1.27c121.07±4.37b
续表4
正己酸乙酯ND2.05±0.094 bND128.84±6.82 a abNDND3 456.84±182.92a a乙酸己酯311.62±28.56 b83.15±4.16 c63.60±7.08 c7 950.26±210.34 a b2.44±0.15 bND49.50±3.87 a aNDNDbNDND11.43±1.09 a a31.82±2.76 b 22.88±0.92 b39.47±2.46 b bNDND24.64±1.78 a b2 166.22±266.19 b 2 027.33±160.91 b3 992.12±143.94 a a乙酸甲酯33.43±0.88bNDND1 910.54±133.74a b2 535.73±25.36 b 2 274.40±142.04 b89 380.51±4 095.93 a b7 041.97±560.43b5 779.82±237.89b136 816.06±4 943.23a种类化合物F1F2F3CK奥苷菊环ND9.26±0.65a8.37±1.11aND 2,5,5-三甲基-2-己烯3.33±0.30b3.78±0.23a1.37±0.14cND烯烃类2,4-己二烯ND114.76±6.07a93.31±5.20bND 2,3,3-三甲基-1,4-戊二烯ND2.93±0.16aNDND烯烃类总量3.33±0.31c130.73±9.15a103.04±4.49bND丙酸乙酯NDNDND48.72±5.09a辛酸乙酯NDNDND86.99±2.61a丙酸-2-苯乙酯NDNDND15.05±1.44a乙基酯类肉豆蔻酸乙酯NDNDND18.45±0.184-乙酰氧基丁酸乙酯NDNDND18.17±1.67a棕榈酸乙酯11.45±1.41b11.92±0.24b13.18±0.60b85.06±7.66a乙基酯类总量11.45±1.41b13.97±0.50b13.18±0.60b401.27±22.34a乙酸苯乙酯7.50±0.74乙酸香叶酯9.62±0.67aNDNDND乙酸异丁酯NDNDND407.76±4.08a乙酸庚酯ND5.61±0.42bND19.90±0.80a乙酸辛酯7.66±0.66b1.85±0.049cND49.96±4.09a乙酸-3-苯基丙酯NDNDND24.29±1.46a乙酸丁酯NDNDND17.81±0.64a乙酸异戊酯25.44±1.59b3.69±0.339bND4 999.34±99.99a(3Z)-3-壬烯-1-醇乙酸酯NDNDND14.64±0.64三丙酸甘油酯2.61±0.32aNDNDND乙酸苄酯NDNDND108.19±8.45a乙酸(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二酯类烯-1-醇乙酸酯2.77±0.15c8.03±0.29b0.00±0.00d25.71±0.93a乙酸乙酯1 631.68±117.66b221.58±18.14b160.59±13.72b65 140.18±5641.31a乙酸正壬酯2.94±0.26乙酸四氢薰衣草酯ND11.34±0.60乙二醇一乙酸酯2.76±0.15(Z)-己-2-烯基乙酸酯111.33±13.91乙酸戊酯1.55±0.068甲酸己酯2 060.96±89.83甲酸乙烯酯NDNDND1 137.91±139.83乙酸酯类总量4 211.87±386.02合计7 647.76±271.64
注:ND.未检出。
不同负载量处理显著影响葡萄果实挥发性风味物质的组成及含量结构。挥发性香气成分质量浓度为5 779.82~136 816.06 μg/L,最低值和最高值分别出现在F3组和CK组。CK组醇类、酯类、酸类、酮类总量均显著高于处理组,其中酸类、酮类超30倍,酯类超20倍。CK组乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯及己酸等物质含量异常升高,显著高于常规葡萄果实的报道水平,结合多雨条件下果实易发生微腐败可推测CK样品中已存在较明显的微生物代谢贡献。这类物质通常与酵母及细菌在糖、氨基酸及脂肪酸底物上的非控制性发酵相关,其高丰度可能反映果实在田间或采后阶段已发生轻微自发发酵或腐败代谢。
相比之下,各负载量处理组(F1、F2、F3)乙酸酯类及乙基酯类物质积累显著降低,尤其是乙酸乙酯和乙酸异戊酯含量大幅下降,说明负载量调控通过改善果穗通风透光条件、降低果粒拥挤度,从而在一定程度上抑制了雨季条件下的微生物滋生与次级发酵代谢的发生。这表明负载量不仅影响果实自身代谢,也可能通过“微环境调控效应”间接影响挥发性风味形成路径。此外,CK组检测到的大量高级醇(如异戊醇、2,3-丁二醇)及部分酸类(己酸、辛酸)显著高于处理组,同样支持其存在较强微生物代谢背景。这类物质在葡萄果实中正常生理水平通常较低,其异常积累更倾向于反映微生物 发酵活动增强,而非单纯植物代谢增强。
因此,在本研究的特定气候背景下,挥发性风味物质的变化应理解为“植物代谢调控+微生物代谢干扰”共同作用的结果,而非单一负载量调控效应。其中,处理组(F1、F2、F3)在一定程度上降低了雨季诱导的微生物代谢放大效应,从而表现为总体香气物质水平下降但组成更稳定。本研究剔除了受病害影响的CK组数据,基于F1、F2、F3组数据分析显示,低负载量(F1)有利于香气物质的生成,而过高的负载量(F3)则会因光照不足和微环境恶化抑制香气合成。
各处理组共检出21种共有挥发性风味物质,包括醇类10种、酯类7种、酸类2种、酚类1种和酮类1种。由图4可知,OPLS-DA模型解释与预测能力优异,模型自变量可解释方差(
、因变量拟合方差(
和交叉验证预测能力参数(Q2)分别为0.992、0.991、0.984,能够实现对3个负载量处理组与CK组的良好区分:CK组主要分布于第3象限,F2组集中于第4象限,而F1与F3组则聚集在第1象限。由200次置换检验散点图可知,Q2与纵轴截距为-0.421(<0),说明模型不存在过拟合现象。
图4 不同处理组马瑟兰葡萄果实挥发性化合物OPLS-DA得分图(A)与 置换检验散点图(B)
Fig.4 OPLS-DA score plot (A) and permutation test scatter plot (B) of volatile compounds in Marselan grape fruits from different treatments
本研究表明,新梢负载量对马瑟兰葡萄果实品质具有显著调控作用,且不同品质指标响应存在差异性与阶段性特征。降低负载量可显著改善果穗外观性状,其中10条梢/m处理可有效提高果穗质量及果穗结构指标,而对果实纵、横径影响不显著。在基础理化指标方面,负载量对出汁率、可溶性固形物及pH值影响较小,但可有效调节还原糖与总酸含量,从而改善糖酸平衡。在次生代谢物方面,低负载显著促进多酚尤其是黄烷醇与黄酮类物质积累,而花色苷含量则在中等负载(15、20条梢/m)范围内表现较优。负载量对有机酸总量影响不显著,但显著改变其组分结构,且病害背景对对照组有机酸代谢产生明显干扰作用。同时,负载量通过调控冠层微环境与源-库关系,显著影响挥发性香气物质的组成与稳定性,低负载有利于提升香气品质稳定性并降低异常发酵代谢产物积累。
综合各指标分析,新梢负载量通过调节光合产物分配、冠层微环境及次生代谢通路,对葡萄果实外观品质、酚类物质积累及香气形成具有系统性影响。其中10条梢/m处理在促进多酚积累、优化果穗结构及提升风味稳定性方面表现最优,为本实验条件下马瑟兰葡萄的适宜栽培负载水平;而15、20条梢/m范围更有利于花色苷的积累与着色品质提升。综上,10条梢/m负载处理在促进多酚积累、优化果穗结构及提升风味稳定性方面表现最佳。本研究结果为马瑟兰葡萄栽培管理中负载量精准调控及优质原料生产提供了理论依据,但是研究局限于单一年度且该年度降雨量偏大,对照样品受灰霉病干扰,可能造成生理与病理代谢效应叠加。未来需开展多年多点验证,并结合健康与病害果实对比分析,以进一步明确负载量的真实调控机制。
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